Poznań 2017

(1)

INSTYTUT TECHNOLOGII I INŻYNIERII CHEMICZNEJ

ROZPRAWA DOKTORSKA

IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH

I NIEORGANICZNYCH

mgr inż. JAKUB ŁUKASZ ZDARTA

Praca doktorska wykonana w ramach Studium Doktoranckiego i przedłożona Radzie Wydziału Technologii Chemicznej Politechniki Poznańskiej

w celu uzyskania stopnia doktora

Promotor: prof. dr hab. inż. Teofil Jesionowski

Promotor pomocniczy: dr inż. Agnieszka Kołodziejczak-Radzimska

Poznań 2017

(2)

Ogromne podziękowania składam na ręce mojego Promotora, Pana Prof. dr. hab. inż. Teofila Jesionowskiego,

za ważne i cenne rady oraz wskazówki, a także za pokazanie, że warto być konsekwentnym i wytrwałym w dążeniu do celu.

(3)

Serdecznie dziękuję również

dr inż. Agnieszce Kołodziejczak-Radzimskiej oraz Kolegom i Koleżankom

z Zespołu Technologii Chemicznej, w szczególności mgr inż. Małgorzacie Norman,

dr. inż. Filipowi Cisielczykowi oraz dr. inż. Łukaszowi Klapiszewskiemu,

za pomoc, wartościowe wskazówki oraz poświęcony czas.

Podziękowania kieruję również do Studentów i Dyplomantów, z którymi miałem przyjemność współpracować.

(4)

Dziękuję także moim Rodzicom za wsparcie, wiarę we mnie oraz mądre rady w trudnych chwilach.

(5)

Niniejszą pracę dedykuję mojej żonie Agacie, która była dla mnie wsparciem w chwilach zwątpienia, motywacją, pomocą oraz cierpliwością, których potrzebowałem.

Bez Ciebie ta praca by nie powstała.

Dziękuję

(6)

- 6 -

S PIS T REŚCI

SPIS TREŚCI ... 6

SPIS SKRÓTÓW I SYMBOLI ... 9

WPROWADZENIE ... 11

PRZEGLĄD LITERATURY ... 13

1. Enzymy ... 13

1.1. Budowa i właściwości enzymów ... 13

1.2. Podział enzymów i ich zastosowanie ... 16

1.3. Lipazy ... 19

1.4. Parametry determinujące właściwości katalityczne enzymów ... 22

1.5. Podsumowanie wiadomości dotyczących enzymów ... 28

2. Immobilizacja enzymów ... 29

2.1. Definicja i podstawowe informacje dotyczące immobilizacji enzymów ... 29

2.2. Metody immobilizacji enzymów... 33

2.3. Wykorzystanie i zalety stosowania immobilizowanych enzymów ... 50

2.4. Podsumowanie podstawowych informacji o immobilizacji enzymów ... 54

3. Nośniki w immobilizacji enzymów ... 55

3.1. Podstawowe informacje i podział nośników ... 55

3.2. Przegląd nośników stosowanych w immobilizacji enzymów ... 60

3.3. Modyfikatory powierzchni w immobilizacji enzymów... 72

3.4. Podsumowanie wiadomości dotyczących nośników w immobilizacji enzymów ... 75

CEL I ZAKRES PRACY ... 77

CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA ... 78

4. Metodyka przygotowania nośników wykorzystanych w procesie immobilizacji enzymów ... 79

4.1. Synteza hydroksyapatytu ... 79

4.2. Synteza krzemionki typu zol-żel... 79

4.3. Otrzymywanie materiału hybrydowego krzemionka-lignina ... 80

4.4. Synteza układu chityna-lignina ... 81

4.5. Modyfikacja chityny związkami typu POSS ... 82

4.6. Preparatyka gąbki roślinnej z gatunku Luffa cylindrica ... 83

4.7. Preparatyka gąbki morskiej z gatunku Hippospongia communis ... 83

5. Immobilizacja wybranych enzymów na powierzchni przygotowanych nośników ... 84

6. Analiza fizykochemiczna oraz morfologiczna preparatów unieruchomionych enzymów ... 85

6.1. Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera oraz spektroskopia Ramana ... 85

(7)

- 7 -

6.2. Spektroskopia fotoelektronów wzbudzonych promieniowaniem rentgenowskim ... 86

6.3. Magnetyczny węglowy rezonans jądrowy – ¹³C CP MAS NMR ... 86

6.4. Ocena morfologii i mikrostruktury z zastosowaniem skaningowej mikroskopii elektronowej oraz mikroskopii cyfrowej ... 87

6.5. Mikroskopia sił atomowych ... 87

6.6. Ocena potencjału elektrokinetycznego (dzeta) ... 87

6.7. Analiza elementarna ... 88

6.8. Charakterystyka parametrów struktury porowatej ... 88

6.9. Ocena stabilności termicznej – analiza termograwimetryczna ... 89

6.10. Ocena ilości zimmobilizowanego enzymu – metoda Bradford ... 89

6.11. Określenie wydajności immobilizacji proteazy ... 90

7. Ocena aktywności katalitycznej oraz stabilności preparatów immobilizowanych enzymów ... 90

7.1. Aktywność katalityczna preparatów po immobilizacji ... 90

7.2. Stabilność preparatów po immobilizacji ... 91

7.3. Parametry kinetyczne preparatów po immobilizacji ... 92

7.4. Reakcja transestryfikacji oleju rzepakowego z metanolem ... 92

7.5. Chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas ... 93

WYNIKI BADAŃ I ICH ANALIZA ... 95

8. Immobilizacja proteazy z Aspergillus oryzae na powierzchni hydroksyapatytu ... 95

8.1. Analiza FTIR – charakterystyka grup funkcyjnych ... 95

8.2. Analiza elementarna – ocena składu pierwiastkowego analizowanych materiałów ... 96

8.3. Analiza parametrów struktury porowatej ... 97

8.4. Określenie ilości unieruchomionego enzymu ... 99

8.5. Wydajność procesu immobilizacji proteazy z Aspergillus oryzae ... 99

9. Immobilizacja Amano Lipase A z Aspergillus niger na powierzchni krzemionki typu zol-żel 101 9.1. Analiza FTIR – charakterystyka grup funkcyjnych ... 101

9.2. Analiza parametrów struktury porowatej ... 102

9.3. Stabilność elektrokinetyczna powstałych układów po immobilizacji enzymu ... 103

9.5. Aktywność katalityczna układów po immobilizacji ALA ... 105

10. Immobilizacja lipazy typu B z Candida antarctica na powierzchni materiału hybrydowego krzemionka-lignina ... 106

10.1. Charakterystyka topografii powierzchni powstałych materiałów – mikroskopia AFM ... 106

10.3. Ocena składu powierzchniowego oraz charakteru powstałych oddziaływań – analiza XPS ... 109

10.4. Aktywność katalityczna oraz stabilność układów po immobilizacji CALB ... 111

(8)

- 8 -

10.5. Mechanizm przyłączenia lipazy do materiału krzemionka-lignina ... 116

11. Immobilizacja lipazy z Aspergillus niger na powierzchni materiału chityna-lignina ... 117

11.1. Analiza ¹³C CP MAS NMR – weryfikacja skuteczności immobilizacji LAN ... 118

11.3. Stabilność elektrokinetyczna powstałych układów po immobilizacji enzymu ... 121

11.5. Aktywność katalityczna oraz stabilność układów po immobilizacji LAN ... 123

12. Immobilizacja lipazy typu B z Candida antarctica na powierzchni chityny zmodyfikowanej związkami z grupy poliedrycznych oligomerycznych silseskwioksanów (POSS) ... 128

12.1. Spektroskopia Ramana – potwierdzenie efektywności modyfikacji powierzchni chityny ... 129

12.2. Ocena stabilności termicznej układów po modyfikacji chityny ... 131

12.5. Testy aplikacyjne układów po immobilizacji – reakcja transestryfikacji oleju rzepakowego z metanolem ... 138

13. Immobilizacja lipazy z Aspergillus niger na powierzchni gąbki roślinnej z gatunku Luffa cylindrica ... 142

13.1. Ocena morfologii powierzchni stosowanych materiałów ... 142

13.3. Analiza elementarna – ocena składu pierwiastkowego analizowanych materiałów ... 145

13.4. Aktywność katalityczna oraz stabilność układów po immobilizacji LAN ... 146

13.5. Parametry kinetyczne wolnej oraz unieruchominej lipazy z Aspergillus niger... 150

14. Immobilizacja lipazy typu B z Candida antarctica na powierzchni szkieletu gąbki morskiej z gatunku Hippospongia communis ... 150

14.1. Ocena morfologii powierzchni wykorzystanych materiałów ... 151

14.3. Ocena ilości unieruchomionej CALB na powierzchni szkieletu gąbki morskiej ... 156

14.5. Testy aplikacyjne układów po immobilizacji – reakcja transestryfikacji oleju rzepakowego z metanolem ... 161

PODSUMOWANIE ... 164

CYTOWANA LITERATURA ... 170

STRESZCZENIE ... 192

SUMMARY ... 195

DOROBEK NAUKOWY AUTORA ... 198

(9)

- 9 -

S PIS S KRÓTÓW I S YMBOLI

13C CP MAS NMR

– spektroskopia węglowego magnetycznego rezonansu jądrowego, ang. Solid-state cross- polarization magic angle spinning carbon-13 nuclear magnetic resonance

ABTS – kwas 2,2'-azyno-bis(3-etylobenzotiazolino)-6-sulfonowy, ang. 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulphonic acid AFM – mikroskop sił atomowych, ang. Atomic Force Microscope

ALA – Amano Lipase A z Aspergillus niger, ang. Aspergillus niger Amano Lipase A ATP – adenozyno-5′-trifosforan

Arg – arginina

Asp – kwas asparginowy

CALB – lipaza typu B z Candida antarctica, ang. Candida antarctica lipase B CBB – Coomassie Brillant Blue G-250 (CBB G-250)

CLEA – usieciowane agregaty białkowe, ang. cross-linked enzyme aggregates CLEC – usieciowane kryształy białkowe, ang. cross-linked enzyme crystals CRL – lipaza z Candida rugosa, ang. Candida rugosa lipase

Cys – cysteina

DEAE – dietyloaminoetyl, ang. diethylaminoethyl

DOPA – 3,4-dihydroksyfenyloalanina, ang. 3,4-dihydroxyphenylalanine

numer EC – numer klasyfikacyjny enzymów, ang. Enzyme catalogue lub Enzyme commission ELS – elektroforetyczne rozproszenie światła, ang. Electrophoretic Light Scattering EPL – ε-poli-L-lizyna, ang. ε-poly-L-lysine

FAME – estry metylowe kwasów tłuszczowych, ang. fatty acids methyl esters

FTIR – spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera, ang. Fourier transform infrared spectroscopy

FWHM – ang. full width at half maximum GA – aldehyd glutarowy, ang. glutaraldehyde

Glu – kwas glutaminowy

GC-MS – chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas, ang. gas chromatography with mass spectrometry

HA – hydroksyapatyt

His – histydyna

HPLC – wysokosprawna chromatografia cieczowa, ang. high-performance liquid chromatography HRP – peroksydaza chrzanowa, ang. horseradish peroxidase

IUBMB – Międzynarodowa Unia Biochemii i Biologii Molekularnej, ang. International Union of Biochemistry and Molecular Biology

Km – stała Michaelisa-Menten

LAN – lipaza z Aspergillus niger, ang. Aspergillus niger lipase

Lys – lizyna

MPOSS – ang. Methacryl POSS Cage mixture

MWCNT – wielościenne nanorurki węglowe, ang. multi-walled carbon nanotubes

(10)

- 10 -

NAD+ – utleniona forma dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego NADH – zredukowana forma dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego PAL – liaza fenyloalaninowa, ang. phenylalanine liase

p-NPP – palmitynian para-nitrofenylu

p-NP – para-nitrofenol

POSS – poliedryczne oligomeryczne silseskwioksany, ang. polyhedral oligomeric silsesquioxanes PRT – proteaza z Aspergillus oryzae

PSS – sulfonian polistyrenu, ang. polystyrene sulfonate

SBA-15 – krzemionka mezoporowata typu SBA-15, ang. Santa Barbara Amorphous silica

SDS – laurylosiarczan sodu

SEM – skaningowy mikroskop elektronowy, ang. Scanning Electron Microscope

Ser – seryna

SWCNT – jednościenne nanorurki węglowe, ang. sigle-walled carbon nanotubes t1/2 – czas aktywności katalitycznej

TEOS – tetraetoksysilan, ang. tetraethyl orthosilicate

TG – trójglicerydy

THF – tetrahydrofuran

TRIS – bufor trihydroksymetyloaminometanowy, ang. tris(hydroxymethyl)aminomethane

Tyr – tyrozyna

U – unit – jednostka aktywności enzymatycznej V – początkowa szybkość reakcji enzymatycznej Vmax – maksymalna szybkość reakcji enzymatycznej VPOSS – ang. Vinyl POSS Cage mixture

XPS – spektroskopia fotoelektronów wzbudzonych promieniowaniem rentgenowskim, ang. X-ray photoelectron spectroscopy

(11)

- 11 -

W PROWADZENIE

W obecnych czasach wiele uwagi poświęca się realizacji procesów technologicznych w sposób efektywny oraz przyjazny dla środowiska. Trwają, zakrojone na szeroką skalę, poszukiwania stabilnych i wydajnych katalizatorów, które poprzez przyspieszanie reakcji chemicznych umożliwiają obniżenie kosztów ich prowadzenia. Szczególną uwagę zwracają enzymy, naturalne biokatalizatory procesów zachodzących w organizmach żywych, pozwalające na wielokrotne zwiększenie szybkości przemiany.

Białka te odznaczają się wysoką specyficznością oraz selektywnością i tym samym znajdują coraz szersze zastosowanie w wielu różnych dziedzinach życia codziennego, nauki oraz przemysłu.

Głównym ograniczeniem stosowania biokatalizatorów jest znaczące obniżenie ich aktywności katalitycznej oraz niska stabilność poza warunkami naturalnego występowania. Trudności te powodują, że opracowanie metod poprawiających ich właściwości jest wysoce pożądane. Jedną z takich technik, obecnie najpowszechniej stosowaną, jest immobilizacja. Jej zadanie polega na zwiększeniu stabilności oraz wydłużeniu aktywności unieruchomionego enzymu. Następstwem przyłączenia enzymu, bądź kilku enzymów z różnych grup katalitycznych do nierozpuszczalnego nośnika na drodze immobilizacji jest powstanie zupełnie nowego preparatu charakteryzującego się odmiennymi właściwościami, w porównaniu z natywnym białkiem. Podkreślić należy, że zmianie ulega przede wszystkim forma biokatalizatora, który po procesie unieruchomienia przybiera postać katalizatora heterogenicznego. Co więcej, immobilizacja powoduje zwiększenie odporności enzymów na denaturację wywołaną działaniem skrajnych warunków środowiska reakcji. Łatwość separacji unieruchomionych białek z mieszaniny reakcyjnej, wynikająca z formy biokatalizatora, możliwość ponownego wykorzystania takich układów, a także zwiększenie ich stabilności powodują, że zastosowanie immobilizacji ma bezpośrednie przełożenie na poprawę kontroli katalizowanych reakcji, a także na wzrost wykorzystania biokatalizatorów w wielu procesach.

Unieruchomieniu poddana może zostać bardzo szeroka gama białek enzymatycznych, a jednym z najistotniejszych czynników determinujących ich właściwości jest dobór odpowiedniego nośnika. Coraz większym zainteresowaniem cieszą się materiały kompozytowe oraz biopolimerowe, wykorzystywane jako matryce dla enzymów. Charakteryzują się one dobrymi zdolnościami sorpcyjnymi, jak i zdefiniowaną stabilnością termiczną i chemiczną oraz odpornością mechaniczną. Należy podkreślić, że zastosowanie biokompatybilnych oraz stabilnych nośników powoduje, że gama reakcji, które mogą być katalizowane przez immobilizowane enzymy, stale się rozszerza.

W ramach niniejszej dysertacji podjęto prace polegające na wykorzystaniu materiałów pochodzenia nieorganicznego: hydroksyapatytu oraz krzemionki typu zol-żel; kompozytowego: materiał krzemionka-lignina i chityna-lignina; jak i organicznego: zmodyfikowana związkami typu POSS chityna oraz gąbka roślinna Luffa cylindrica i szkielet gąbki morskiej Hippospongia communis, jako nośników w procesie immobilizacji proteazy oraz lipaz. W niniejszej pracy doktorskiej wiele uwagi poświęcono na określenie wpływu początkowych parametrów immobilizacji (takich jak: czas, temperatura, początkowe stężenie roztworu enzymu) na ilość unieruchomionego białka oraz aktywność otrzymanych preparatów.

(12)

- 12 -

Zdefiniowano także najbardziej korzystne warunki procesu, zapewniające zachowanie jak najlepszych właściwości katalitycznych przez unieruchomione enzymy. Co więcej, określono wpływ czasu i temperatury magazynowania, ilości następujących po sobie cykli katalitycznych oraz warunków reakcji (pH, temperatura) na zmiany aktywności hydrolitycznej otrzymanych układów enzymatycznych.

Z wykorzystaniem zaawansowanych metod oraz technik analitycznych potwierdzono skuteczne unieruchomienie biokatalizatora, jak i podjęto próbę scharakteryzowania rodzaju oddziaływań powstałych pomiędzy matrycą i unieruchomionym enzymem. Możliwość praktycznego zastosowania otrzymanych systemów biokatalitycznych zweryfikowano w oparciu o reakcje transestryfikacji oleju rzepakowego.

Podsumowując, przedkładana dysertacja doktorska dostarcza wielu informacji na temat immobilizacji enzymów z grupy hydrolaz na wybranych, funkcjonalnych materiałach nieorganicznych, organicznych oraz kompozytowych. Największe znaczenie w ramach niniejszej pracy mają badania związane ze zdefiniowaniem wpływu rodzaju nośnika oraz warunków procesu na stabilność i aktywność katalityczną unieruchomionych enzymów, a także prace mające na celu wskazanie potencjalnych kierunków zastosowań otrzymanych systemów biokatalitycznych.

(13)

- 13 -

P RZEGLĄD L ITERATURY 1. Enzymy

1.1. Budowa i właściwości enzymów

W ostatnich latach można zauważyć wyraźny trend w kierunku zwiększania ekonomiki oraz efektywności prowadzenia procesów chemicznych, a także ich realizacji w sposób bardziej przyjazny dla środowiska. Jednym z takich rozwiązań jest zastosowanie katalizatorów, które aktywują i przyspieszają zachodzące reakcje, jak i w znaczący sposób wpływają na ich selektywność. Szczególną uwagę przykuwają enzymy, katalizatory pochodzenia biologicznego, które charakteryzują się wysoką aktywnością oraz specyficznością [1].

Enzymy to w zdecydowanej większości wielkocząsteczkowe struktury białkowe, które przyspieszają przebieg reakcji chemicznych poprzez obniżenie ich poziomu energetycznego [2].

Biokatalizatory te wykorzystują zdolność do wiązania szerokiej gamy cząsteczek i ich ułożenia w optymalnej konfiguracji przestrzennej, co umożliwia efektywne rozrywanie i tworzenie wiązań chemicznych. Istota działania białek katalitycznych opiera się na obniżeniu energii aktywacji i stabilizacji stanów przejściowych reakcji, które są formami o najwyższym poziomie energetycznym [3].

Pierwsze badania związane z enzymami zostały przeprowadzone w XIX wieku przez Louisa Pasteura, który odkrył, że fermentacja cukrów do alkoholi jest silnie związana z procesami zachodzącymi w żywych komórkach drożdży [4]. Aby opisać te procesy, Wilhelm Kühne w 1878 roku po raz pierwszy użył terminu enzym, co z greckiego oznacza „w zaczynie” [5]. Od tego czasu rozpoczął się intensywny rozwój nowej dziedziny nauki – enzymologii, a naukowcy zajmujący się tą tematyką zostali kilkukrotnie nagrodzeni Nagrodą Nobla w dziedzinie chemii i medycyny (np.: E. Büchner, A. Harden czy J. Cornforth).

Większość z poznanych dotychczas enzymów to białka zbudowane z łańcuchów od kilkudziesięciu do kilku tysięcy aminokwasów [6,7]. Łańcuchy te zwijają się, tworząc skomplikowaną trójwymiarową strukturę przestrzenną. W cząsteczce biokatalizatora istnieją miejsca, gdzie następuje wiązanie kofaktorów – dodatkowych, niebiałkowych składników umożliwiających osiągnięcie pełnej aktywności katalitycznej. Kofaktory podzielić można na grupy prostetyczne oraz koenzymy. Pierwszymi z nich mogą być jony metali lub związki nieorganiczne, które są trwale i silnie związane z enzymem.

Druga grupa to zwykle małe, niebiałkowe cząsteczki organiczne, które przyłączane są do enzymu tylko w czasie katalizowania konkretnej przemiany [8].

Największy wpływ na właściwości katalityczne enzymu ma przestrzenne ułożenie aminokwasów, które tworzą centrum aktywne, gdzie przebiega reakcja. Wysoka aktywność katalityczna i specyficzność enzymów oraz ich regio- i chemoselektywność związane są także z kształtem i ekspozycją centrów aktywnych biokatalizatorów. Cechy te powodują, że biokatalizator zdolny jest do przyłączenia i przeprowadzenia reakcji tylko z cząsteczkami substratów o ściśle określonym ułożeniu atomów oraz zdefiniowanej strukturze chemicznej. Należy jednak odnotować, że centrum aktywne tworzy zaledwie kilka

(14)

- 14 -

spośród wszystkich aminokwasów wchodzących w strukturę danego białka. Niezwykle istotne jest odpowiednie przyłączenie substratu katalizowanego procesu do miejsca aktywnego, aby pożądana przemiana chemiczna mogła być zainicjowana. Wyróżnia się trzy zasadnicze rodzaje wiązania substratu w centrum aktywnym enzymu, których graficzną interpretację przedstawiono na rys. 1.

Rys. 1. Modele obrazujące mechanizm przyłączenia substratów do miejsca aktywnego enzymu:

a) model zamka i klucza, b) model trzypunktowego przyłączenia, c) model indukowanego dopasowania, gdzie: S – substrat, E – enzym, E+S – kompleks enzym-substrat, na podstawie [1-3]

Pierwszym, historycznie najstarszym, jest model „zamka i klucza" (ang. „lock and key" model), który został zaproponowany przez Hermanna Fischera pod koniec XIX wieku (rys. 1a). Opiera się on na założeniu, że kształt centrum aktywnego enzymu jest ściśle dopasowany do przestrzennego kształtu substratów, co powoduje, że tylko jeden, zdefiniowany typ cząsteczek może zostać przyłączony [9].

Jednak założenia tej teorii nie zostały w pełni potwierdzone przez dane eksperymentalne i obecnie ma ona znaczenie tylko historyczne. Dodatkową wadą tego modelu jest fakt, że w dostatecznym stopniu nie wyjaśnia on sposobu stabilizacji stanu przejściowego reakcji.

Alternatywne spojrzenie na sposób wiązania substratu z enzymem w 1948 roku opracował Alexander G. Ogston. Zaproponował, że do związania cząsteczek reagentów przez enzym potrzebne są

a)

b)

c)

E

E S

S

S S

S

E+S

(15)

- 15 -

tylko trzy miejsca, a oddziaływania mogą powstawać wyłącznie pomiędzy atomami i grupami komplementarnymi, pasującymi do siebie pod względem chemicznym (rys. 1b) [10]. Teoria trzypunktowego przyłączenia (ang. three-point interaction model) nie opisuje jednak w sposób dostateczny zachodzących przemian energetycznych oraz nie tłumaczy mechanizmów reakcji stereospecyficznych.

Dalsze badania dotyczące mechanizmu przemian enzymatycznych doprowadziły do opublikowania przez Daniela Koshlanda w 1958 roku modelu indukowanego dopasowania (ang. induced fit model), który jest ewolucją teorii „zamka i klucza". Według jego założeń centrum aktywne enzymu podczas katalizowanej reakcji zachowuje dużą elastyczność strukturalną, a aminokwasy je tworzące podlegają zmianom konformacyjnym (rys. 1c) [11]. W wyniku tych transformacji, możliwe staje się dokładne dopasowanie cząsteczek substratu do centrum aktywnego enzymu i wytworzenie stabilnych oddziaływań, co w rezultacie umożliwia przeprowadzenie procesu katalitycznego. Należy jednak podkreślić, że ostateczny mechanizm przemian enzymatycznych nie został do końca poznany i ciągle jest przedmiotem intensywnych badań.

Enzymy są niezbędne nie tylko do prawidłowego funkcjonowania organizmów żywych.

Ze względu na swoje unikalne właściwości i możliwość znacznego zwiększenia szybkości reakcji, znalazły zastosowanie jako efektywne katalizatory wielu procesów technologicznych. Zawdzięczają to zdolnościom do zmniejszenia poziomu wartości energii niezbędnej do przejścia substratu w produkt, poprzez obniżenie swobodnej energii aktywacji Gibbsa [12]. Zredukowanie wartości energii może odbywać się między innymi dzięki deformacjom, jakim poddane zostaje centrum aktywne enzymu oraz cząsteczki substratów. Wzrost szybkości reakcji może zostać osiągnięty także dzięki ograniczeniu niekorzystnych energetycznie oddziaływań elektrostatycznych pomiędzy substratami i składnikami mieszaniny reakcyjnej.

Wykorzystanie nowopowstałych interakcji, jak i odpowiednie zbliżenie substratów do centrum aktywnego skutkuje wytworzeniem otoczenia, które stabilizuje stan przejściowy. Dodatkowo zniekształcenie przez biokatalizator wiązań obecnych w cząsteczkach reagentów powoduje ich osłabienie i rozluźnienie, co w konsekwencji prowadzi do obniżenia energii aktywacji katalizowanej przemiany [13]. Obniżenie poziomu energetycznego przemiany osiągane jest także poprzez poprowadzenie reakcji chemicznej z powstaniem alternatywnego, bardziej stabilnego niż w procesach niekatalitycznych, kompleksu pośredniego enzym- substrat, co bez zastosowania enzymu nie byłoby możliwe.

Powyżej opisano wybrane właściwości i niepodważalne zalety białek katalitycznych. Enzymy odpowiedzialne są za prawidłowe kierowanie przemianami zachodzącymi w organizmach żywych, jednak bardzo często znajdują też zastosowanie w wielu różnych dziedzinach życia codziennego, gdzie katalizują szeroką i zróżnicowaną gamę przemian chemicznych. Ze względu na złożoność prowadzonych procesów w jakich uczestniczą, jak i ich ogromną liczbę, konieczne było usystematyzowanie i podział enzymów na odpowiednie grupy.

(16)

- 16 -

1.2. Podział enzymów i ich zastosowanie

Stały rozwój w dziedzinie enzymologii, jak i ciągłe odkrywanie nowych rodzajów enzymów spowodowały, że potrzebne było odpowiednie sklasyfikowanie dotąd poznanych białek katalitycznych.

Podział enzymów na poszczególne grupy katalityczne został zaproponowany w drugiej połowie XX wieku przez Międzynarodową Unię Biochemii i Biologii Molekularnej (IUBMB) i klasyfikuje enzymy na sześć głównych grup, w zależności od rodzaju katalizowanej przemiany. Każdemu biokatalizatorowi przypisany został odpowiedni, czteroczęściowy numer, w którym pierwsza cyfra oznacza klasę enzymu, druga i trzecia symbolizują odpowiednio podklasę i podpodklasę, a ostatnia reprezentuje miejsce, jakie białko zajmuje w swojej podpodklasie [14]. Na przykład lipaza trzustkowa posiada nr EC 3.1.1.3, co oznacza, że należy ona do hydrolaz, trzeciej grupy enzymów, i zajmuje pierwsze miejsce w swojej podklasie oraz podpodklasie. Podział enzymów na grupy katalityczne został zaprezentowany w tabeli 1.

Większość nazw enzymów pochodzi od nazw substratów, bądź związana jest z rodzajem reakcji, jaką dane białko katalizuje. Do nazw tych dodaje się przyrostek -aza. Spora grupa enzymów posiada nazwy dwuczłonowe, np. dehydrogenaza alkoholowa, w których pierwszy człon związany jest z katalizowanym procesem, a drugi odnosi się do rodzaju substratu.

Tabela 1. Podział enzymów na grupy katalityczne wraz z funkcją pełnioną przez każdą z nich oraz wybranymi przykładami enzymów

Numer grupy Nazwa grupy Rodzaj katalizowanej reakcji Przykładowe enzymy

I oksydoreduktazy

kataliza reakcji utleniania i redukcji oraz transport protonów

i elektronów pomiędzy cząsteczkami reduktora i utleniacza

dehydrogenazy oksydazy hydroksylazy

II transferazy

przenoszenie wybranej grupy funkcyjnej z cząsteczki donora na

cząsteczkę akceptora

kinazy aminotransferazy

III hydrolazy

kataliza procesów hydrolizy – rozpadu wiązań chemicznych

z udziałem cząsteczki wody

lipazy peptydazy

IV liazy

odszczepienie grup funkcyjnych od cząsteczki substratu i rozkład wiązania chemicznego na drodze innej niż hydroliza czy utlenianie

aldolazy dekarboksylazy

hydroliazy

V izomerazy

konwersja jednej formy izomerycznej danego związku

w drugą

izomerazy cis-trans epimerazy

VI ligazy

generowanie nowych związków poprzez wytworzenie wiązania chemicznego pomiędzy dwiema

niezależnymi cząsteczkami

syntetazy karboksylazy

(17)

- 17 -

Jak już wspomniano, w oparciu o raport IUBMB wyróżniono sześć głównych grup enzymów, w których sklasyfikowane są wszystkie znane obecnie białka katalityczne.

Pierwszą klasę enzymów, EC 1, stanowią oksydoreduktazy. Są to białka odpowiedzialne za katalizowanie reakcji utleniania i redukcji, jak i transport protonów oraz elektronów pomiędzy cząsteczkami reduktora i utleniacza. Enzymy te mogą działać na szeroki wachlarz związków chemicznych, a do najczęściej spotykanych białek spośród tej grupy zaliczyć można dehydrogenazy oraz hydroksylazy.

Pierwsze z nich to biokatalizatory biorące udział w procesie odszczepienia atomu wodoru z cząsteczki związku organicznego. Dehydrogenazy są kluczowymi enzymami w cyklu Krebsa, jednak wykorzystywane są także w procesach technologicznych, np. do regeneracji NAD+ do NADH [15]. Hydroksylazy z kolei to enzymy, których zadaniem jest przeprowadzenie procesu przyłączenia ugrupowania hydroksylowego do cząsteczki substratu. Są odpowiedzialne za prawidłowe funkcjonowanie wielu procesów zachodzących w organizmach żywych, lecz wykorzystywane są także w ochronie środowiska, gdzie ułatwiają degradację związków fenolowych zawartych m.in. w ściekach [16].

Do drugiej klasy enzymów, EC 2, należą transferazy, a więc grupa białek, których funkcją jest przenoszenie wybranej grupy funkcyjnej z cząsteczki donora na cząsteczkę akceptora. Dzielą się one na podklasy, w zależności od rodzaju przenoszonej grupy funkcyjnej. Do najważniejszych z tych białek katalitycznych należą kinazy, które przenoszą grupy fosforanowe z cząsteczek ATP na akceptor i odpowiedzialne są za właściwe przeprowadzenie procesu fosforylacji [17] oraz aminotransferazy, nazywane także transaminazami, które są odpowiedzialne za przyspieszenie transportu grupy aminowej (–NH2) z cząsteczki aminokwasu na cząsteczkę α-ketokwasu. Białka te odgrywają istotną rolę w wielu procesach metabolicznych, a ponadto są wykorzystywane w medycynie oraz w diagnostyce chorób wątroby. W tym wypadku monitoruje się poziom ich zawartości w płynach ustrojowych, a zmiany ilości tego białka mogą świadczyć o procesach chorobowych zachodzących w komórkach wątroby [18].

Bardzo liczną grupę enzymów stanowią hydrolazy, EC 3, białka które katalizują procesy hydrolizy, a więc rozpadu różnego rodzaju wiązań chemicznych z udziałem cząsteczki wody. Przez poszczególne enzymy z tej klasy rozłożone mogą zostać wiązania estrowe, peptydowe, β-glikozydowe, fosfodiestrowe w kwasach nukleinowych, czy estrowe w tłuszczach. Warto odnotować, że cechą wspólną białek z tej grupy jest to, że nie wymagają one kofaktorów do poprawnego działania. Szczególne miejsce w tej grupie zajmują lipazy, które zostaną szerzej opisane w podrozdziale 1.3.

Numer klasyfikacyjny EC 4 otrzymały liazy, a więc enzymy, które odpowiedzialne są za odszczepienie poszczególnych grup funkcyjnych z cząsteczki substratu i rozkład wiązania chemicznego na drodze innej niż hydroliza czy utlenianie. Zazwyczaj konsekwencją działania liaz jest rozerwanie jednego wiązania i powstanie w jego miejscu nowego. Kryterium podziału enzymów z tej grupy na podklasy jest rodzaj wiązania, którego rozpad katalizują. W związku z tym wyróżnić można kilka podklas tych enzymów, które biorą udział w procesach rozszczepienia wiązań: węgiel-węgiel, węgiel-azot, węgiel-tlen czy węgiel-siarka [19]. Największe zainteresowanie spośród tej grupy białek katalitycznych wzbudzają aldolazy, enzymy katalizujące reakcje rozszczepienia aldolowego. Są one używane jako

(18)

- 18 -

efektywne narzędzia, służące formowaniu nowych wiązań węgiel-węgiel, a synteza prowadzona z wykorzystaniem tych białek zapewnia wysoką stereoselektywność i sprawia, że reakcja przebiega w sposób bardziej przyjazny dla środowiska [20].

Kolejną grupę enzymów, oznaczoną numerem EC 5, stanowią izomerazy, a więc białka katalityczne, których funkcję można ogólnie zdefiniować jako konwersję jednej formy izomerycznej danego związku w drugą. Znane są jednak przypadki, że enzymy te katalizują także międzycząsteczkowe zmiany konformacyjne, które związane są ze zrywaniem starych i tworzeniem nowych wiązań chemicznych.

Produkty powstałe po procesie katalitycznym odznaczają się takim samym wzorem sumarycznym jak substrat, jednak posiadają odmienne ułożenie atomów oraz inną konfigurację przestrzenną. Enzymy z tej grupy biorą udział w wielu przemianach biologicznych, między innymi w procesie glikolizy czy metabolizmie węglowodanów, a na skalę przemysłową są powszechnie stosowane w procesach izomeryzacji cukrów [21]. Wyjątkowym zainteresowaniem cieszy się izomeraza glukozowa/ksylozowa (EC 5.3.1.5), która katalizuje odwracalną izomeryzację D-glukozy lub D-ksylozy, odpowiednio do D-fruktozy lub D-ksylulozy i uważana jest za jeden z najważniejszych enzymów stosowanych w skali technicznej [22].

Ostatnią, szóstą w kolejności grupę białek katalitycznych, oznaczonych jako EC 6, stanowią ligazy, które od nazwy katalizowanych przemian określane są jako syntetazy. Enzymy z tej klasy umożliwiają bowiem generowanie nowych związków poprzez wytworzanie wiązania chemicznego pomiędzy dwiema niezależnymi cząsteczkami. Proces tworzenia nowych połączeń ma miejsce przy jednoczesnym rozkładzie cząsteczki ATP i wykorzystaniu energii w niej zgromadzonej. Podział ligaz na sześć podklas determinowany jest przez rodzaj wiązania, które powstaje w wyniku katalizowanego procesu. Wyróżnić można na przykład ligazy odpowiedzialne za tworzenie wiązań węgiel-węgiel, węgiel- tlen czy węgiel-azot [23]. Najważniejszym enzymem z tej klasy, którego poprawne działanie jest niezbędne do prawidłowego funkcjonowania organizmów żywych, jest ligaza DNA. Białko to odpowiedzialne jest za łączenie wolnych końców nici DNA [24]. Proces ten następuje poprzez wytworzenie wiązania fosfodiestrowego pomiędzy końcem 3' i końcem 5'.

Zaprezentowane powyżej sześć głównych grup katalitycznych systematyzuje enzymy według rodzaju katalizowanej przemiany. Wiele cennych właściwości, którymi charakteryzują się biokatalizatory, ma bezpośredni wpływ na ogromną ilość procesów, w jakich są stosowane. Szeroka gama białek znalazła zastosowanie jako wydajne i efektywne substancje przyspieszające przebieg złożonych procesów realizowanych w skali przemysłowej. Warto jednak podkreślić, że zazwyczaj do całkowitej realizacji procesu katalitycznego niezbędne jest wykorzystanie kilku enzymów, z różnych grup katalitycznych.

Obecnie najpowszechniej wykorzystywanymi w skali przemysłowej enzymami są hydrolazy, a więc białka należące do trzeciej grupy katalitycznej, których przedstawicielem są lipazy. Z tego też względu lipazy zostały wykorzystane w badaniach realizowanych w ramach przedkładanej dysertacji doktorskiej, a w dalszej części pracy zostały szerzej opisane i scharakteryzowane.

(19)

- 19 -

1.3. Lipazy

Należące do podklasy esteraz, lipazy [EC 3.1.1.3] czyli hydrolazy estrów gliceryny, cieszą się szczególnie dużym zainteresowaniem spośród licznej grupy efektywnych „narzędzi” katalitycznych stosowanych w procesach chemicznych. Ich wielkość mieści się w zakresie od 20 do 60 kDa. Białka te mogą być pochodzenia mikrobiologicznego, roślinnego oraz zwierzęcego, jednak największe znaczenie odgrywają lipazy pozyskane z grzybów takich gatunków jak np. Aspergillus niger, Candida antarctica oraz bakterii z rodzaju Staphylococcus czy Pseudomonas [25]. Przykładowe struktury lipaz, pozyskanych z różnych źródeł, zostały zilustrowane na rys. 2.

Rys. 2. Struktury przestrzenne lipaz

pochodzących z: a) Candida antarctica, b) Candida rugosa, c) Bacillus subtillis, na podstawie [26-28]

Praktyczne wykorzystanie lipaz wymagało poznania ich struktury przestrzennej. Jako pierwsze zdefiniowano modele struktury ludzkiej lipazy trzustkowej oraz lipazy wyekstrahowanej z grzyba Rhizopus miehei. Na podstawie analiz strukturalnych wykazano, że enzymy te posiadają charakterystyczny wzór sfałdowania, zwany fałdowaniem α/β hydrolaz, co zobrazowano na rys. 3. Widocznych jest na nim osiem równolegle ułożonych struktur β-fałdowych, które otaczają α-helisy.

Dalsze badania nad strukturą lipazy pozwoliły odkryć, że białka te w swojej cząsteczce zawierają charakterystyczną triadę katalityczną aminokwasów złożoną z seryny, histydyny oraz kwasu asparginowego (Ser-Asp-His) lub glutaminowego (Ser-Asp-Glu) [29]. Triada ta tworzy miejsce aktywne lipaz, które dodatkowo przykryte jest polipeptydowym, hydrofobowym wieczkiem. Podczas procesu katalitycznego lipazy zostają zaadsorbowane na granicy faz olej-woda, następnie dochodzi do kontaktu enzymu z powierzchnią międzyfazową lipidów, co powoduje zmiany konformacyjne prowadzące do otwarcia pokrywy. Możliwy staje się wtedy dostęp substratu do miejsca aktywnego i zainicjowanie procesu katalitycznego. Powyżej opisany proces nazywany jest międzyfazową aktywacją lipaz [30].

a) b) c)

(20)

- 20 -

Rys. 3. Ułożenie aminokwasów w strukturze lipazy, tworzących α/β sfałdowanie hydrolaz, na podstawie [29]

Białka katalizujące procesy hydrolizy wiązań estrowych mogą brać udział w bardzo szerokiej gamie przemian chemicznych, a mechanizm ich działania w dużej mierze determinowany jest przez pochodzenie enzymu, parametry katalizowanego procesu czy obecność wody w mieszaninie reakcyjnej.

W środowisku bezwodnym białka te katalizują przede wszystkim procesy syntezy estrów, oraz reakcje estryfikacji i transestryfikacji, natomiast w roztworze wodnym wykazują tendencję głównie do katalizowania i przyspieszania reakcji hydrolizy [31].

Lipazy są jednymi z najbardziej wszechstronnych enzymów, o relatywnie niskiej specyficzności substratowej. Cecha ta, w połączeniu z rolą katalityczną jaką spełniają, spowodowała, że wykorzystywane są w przemyśle kosmetycznym, farmaceutycznym, mleczarskim, spożywczym, petrochemicznym czy w przemyśle środków czyszczących (rys. 4) [32-36].

Ważnym, z technologicznego punktu widzenia procesem przemysłowym, w którym wykorzystywane są lipazy jest hydrolityczny rozkład szerokiej gamy olejów roślinnych (olej z oliwek, rzepakowy, słonecznikowy, kokosowy) do kwasów tłuszczowych oraz glicerolu. Proces ten bez zastosowania enzymów wymaga wysokiej temperatury i ciśnienia, co powoduje, że jest wysokoenergetyczny. Wykorzystanie lipaz różnego pochodzenia, pozyskanych m.in. z: Thermomyces lanuginosus, Aspergillus niger, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis czy Geotrichum candidum, powoduje, że reakcja hydrolizy biegnie w dużo łagodniejszych warunkach temperatury (40–60 °C) i ciśnienia, a dodatkowo możliwe jest otrzymanie produktów odznaczających się lepszymi właściwościami użytkowymi oraz wysoką czystością [37-39]. Bardzo duże osiągnięcia zostały także poczynione w zakresie wykorzystania wybranych lipaz w procesie transestryfikacji olejów roślinnych z krótkołańcuchowymi alkoholami alifatycznymi do produkcji biodiesla. Wykorzystanie lipaz otrzymanych między innymi z: Burkholderia cepacia, Pseudozyma antarctica i Candida antarctica, pozwala na otrzymanie biopaliwa o pożądanym składzie i czystości, całkowitą konwersję trójglicerydów oraz kwasów tłuszczowych zawartych w oleju, jak i na prowadzenie procesu w sposób bardziej przyjazny dla środowiska [40-42]. Należy także podkreślić, że enzymatyczna produkcja biodiesla umożliwia wytwarzanie biopaliw bez dodatku glicerolu, którego ekstrakcja z mieszaniny reakcyjnej jest droga i mało efektywna.

(21)

- 21 - Przemysł spożywczy

Przemysł papierniczy

Synteza chemiczna

Diagnostyka medyczna

Przemysł kosmetyczny i farmaceutyczny Detergenty

i środki czystości

Przemysł kaletniczy

PRZEMYSŁOWE WYKORZYSTANIE LIPAZ

Rys. 4. Przykłady przemysłowego wykorzystania lipaz

Obecnie lipazy są także powszechnie stosowane w syntezie organicznej, gdzie wykorzystywane są do katalizy szerokiej gamy regioselektywnych i stereospecyficznych przemian, jak również do produkcji związków chiralnych oraz rozdziału mieszanin racemicznych [43,44]. Wybrane typy enzymów pochodzenia mikrobiologicznego, pozyskane z Pseudomonas sp., Candida antarctica czy Candida rugosa, pomimo że zbudowane są z analogicznych sekwencji aminokwasów, to jednak diametralnie różnią się przestrzenną strukturą czwartorzędową. To właśnie ta cecha decyduje o ich właściwościach i katalizowaniu różnych typów reakcji chemicznych. Odmienne rozmieszczenie łańcuchów aminokwasowych w przestrzeni determinuje też wysoką regioselektywność oraz enancjoselektywność tych białek [45].

Ze względu na fakt, że wiele pochodnych tłuszczów oraz kwasów karboksylowych, jak i ich pochodnych powszechnie wykorzystuje się w przemyśle farmaceutycznym i kosmetycznym, także i w tych dziedzinach przemysłu zastosowanie znalazły lipazy. W obu gałęziach przemysłu doceniono możliwość realizacji procesów w bardziej łagodnych warunkach, co pozwala zmniejszyć ich koszty.

Dodatkowo, zastosowanie białek katalitycznych pomaga przeciwdziałać izomeryzacji, racemizacji, epimeryzacji, a także innym niechcianym zmianom konformacyjnym cząsteczek podczas ich syntezy.

W przemyśle kosmetycznym lipazy wykorzystywane są m.in. do produkcji kremów z filtrem przeciwsłonecznym, płynów do kąpieli i olejków zapachowych. W przemyśle farmaceutycznym natomiast Produkcja biopaliw

(22)

- 22 -

stosowane są do produkcji leków, w których tylko jeden z enancjomerów jest substancją czynną i posiada pożądane właściwości lecznicze [46-48].

Znaczenie trójglicerydów oraz kwasów tłuszczowych w przemyśle spożywczym znane było już od dawna, stąd nie może dziwić duże wykorzystanie lipaz w wielu dziedzinach tego rodzaju przemysłu [49]. Poprzez swoje unikalne właściwości białka te, umożliwiają modyfikację struktury tłuszczów roślinnych, co wykorzystywane jest między innymi w produkcji preparatów do żywienia niemowląt, aby przypominały one mleko matki, a także w produkcji tłuszczów o zmniejszonej kaloryczności [50]. Jednym z ciekawszych zastosowań jest wykorzystanie lipaz do produkcji substytutów masła kakaowego, które charakteryzuje się właściwościami smakowymi oraz użytkowymi zbliżonymi do produktu pochodzenia naturalnego [51]. Ponadto, lipazy wykorzystywane są także przez serowarów, aby przyspieszyć dojrzewanie serów i wzmocnić ich aromat.

Warto podkreślić, że omówione bardziej szczegółowo w niniejszym podrozdziale, przemysłowe zastosowania lipaz nie wyczerpują listy procesów, w których białka te mogą być stosowane. Należy zwrócić uwagę na ich powszechne wykorzystanie w przemyśle tekstylnym, papierniczym, kaletniczym czy środków piorących, a ostatnio także w ochronie zdrowia i diagnostyce medycznej [52-56]. Według zgodnej opinii naukowców, w ciągu najbliższych lat nastąpi dalszy, gwałtowny wzrost przemysłowego zastosowania lipaz, stąd dalsze prace nad rozwojem technologii tych enzymów są uzasadnione.

1.4. Parametry determinujące właściwości katalityczne enzymów

W ostatnich latach odnotowuje się wyraźny trend wskazujący na wzrost wykorzystania biokatalizatorów w wielu dziedzinach nauki i technologii, czego dowodem jest ciągle rosnąca wartość rynku enzymów, który według prognoz, w 2020 roku powinien osiągnąć wartość ponad 6 mld USD [57].

Białka katalityczne stosowane są w bardzo szerokiej gamie procesów technologicznych, od oczyszczania zdegradowanych wód po przemysł farmaceutyczny, a co więcej, ciągle prowadzone są prace mające na celu ich implementację w nowych branżach nauki i techniki.

Istnieje jednak szereg czynników, które mają istotny wpływ na właściwości enzymów, a jednocześnie ograniczają szersze wykorzystanie biokatalizatorów. Wśród najważniejszych należy wymienić: fizykochemiczne parametry środowiska reakcji, którą katalizują enzymy, charakter i rodzaj prowadzonego procesu oraz ilość i typ inhibitorów. Wybrane czynniki wpływające na właściwości katalityczne enzymów zostały zaprezentowane na rys. 5.

Spośród najistotniejszych parametrów fizykochemicznych środowiska reakcji, które mają bezpośredni wpływ na działanie enzymów, należy wyróżnić: temperaturę oraz pH prowadzonego procesu, jednak znacząca jest również aktywność wody oraz siła jonowa roztworu.

Większość białek katalitycznych osiąga swoją najwyższą aktywność w bardzo wąskim zakresie pH oraz temperatury, które odpowiadają warunkom fizjologicznym pracy enzymu. W przemianach chemicznych wzrost temperatury zazwyczaj powoduje wzrost szybkości reakcji. Podobnie jest

(23)

- 23 -

w przypadku katalizy enzymatycznej, która biegnie wydajniej w podwyższonej temperaturze. Należy jednak wziąć pod uwagę, że zbyt wysoka temperatura prowadzonego procesu może wywołać nieodwracalne zmiany w strukturze białka, co w konsekwencji prowadzi do jego denaturacji i utraty aktywności enzymatycznej. Doskonałym przykładem ogromnej różnorodności optymalnych warunków działania białek katalitycznych jest przykład lipazy wyekstrahowanej z Bacillus sp. oraz izomerazy ksylozowej pozyskanej z Thermotoga neapolitana. Pierwsze z tych białek wykazuje najwyższą aktywność w temperaturze 50 °C, podczas gdy drugie w temperaturze ponad 90 °C [58,59]. Łączy je jednak fakt, że nawet niewielkie zmiany temperatury, jak np. jej obniżenie o 10 °C, powodują drastyczny spadek aktywności tych białek.

Rys. 5. Czynniki wpływające na właściwości katalityczne enzymów

Enzymy wykazują także dużą wrażliwość na zmienne warunki pH środowiska reakcji. Również w przypadku tego parametru, nawet jego niewielkie zmiany mogą powodować znaczącą redukcję właściwości katalitycznych enzymów, a optymalne pH działania zależy od rodzaju biokatalizatora i procesu, w którym bierze udział. Aldolaza ze Staphylococcus aureus wykazuje optimum pH przy wartości 6,5, podczas gdy proteaza uzyskana z Bacillus licheniformis maksimum swoich właściwości katalitycznych osiąga w pH od 9 do 10, a pepsyna, odpowiadająca za procesy trawienne w ludzkim żołądku, najwyższą aktywność wykazuje w pH silnie kwaśnym, o wartości między 2 i 3 [60,61]. Jak już wspomniano, większość enzymów wykazuje wysoką aktywność tylko w wąskim zakresie pH, jednak znane są też białka, które charakteryzują się dobrymi właściwościami w szerszym zakresie pH. Do tej grupy należy większość enzymów z podklasy proteaz, których optymalne warunki działania zawierają się w przedziale pH od 8 do 11.

WŁAŚCIWOŚCI

KATALITYCZNE ENZYMÓW

Kinetyka enzymatyczna

Warunki procesowe

Inhibicja

Typ i rodzaj procesu

Rodzaj rozpuszczalnika

Pochodzenie enzymu

(24)

- 24 -

Siła jonowa roztworu, w którym prowadzona jest reakcja to również jeden z ważnych czynników determinujących aktywność omawianych białek. Parametr ten jest szczególnie istotny wówczas, gdy mechanizm katalizy determinowany jest przez wzajemne zależności pomiędzy naładowanymi cząsteczkami. Jeśli ładunki cząsteczek substratów oraz centrum aktywnego są takie same, wówczas wzrost siły jonowej będzie wywoływał wzrost szybkości reakcji chemicznej, jeżeli natomiast ładunki mają przeciwny znak, wówczas dojdzie do obniżenia szybkości przemiany. Na przykład chymotrypsyna, do efektywnego katalizowania reakcji potrzebuje dwóch dodatnio naładowanych reszt aminokwasowych (histydyny oraz argininy) w centrum aktywnym. Ponadto wartość siły jonowej mieszaniny reakcyjnej ma wpływ na przestrzenną konformację centrum aktywnego enzymu, jak i na charakter oraz siłę powstałych oddziaływań enzym-substrat [62]. Zmiany wartości siły jonowej roztworu, poprzez zmianę gęstości ładunków mogą także powodować zaburzenie przestrzennej konformacji centrum aktywnego, co może wywołać dezaktywację całego białka, tak więc kontrola tego parametru reakcji enzymatycznej jest niezwykle ważna [63]. Na aktywność enzymów wpływa także aktywność wody, jak i obecność różnych jonów w mieszaninie reakcyjnej, które bezpośrednio związane są z siłą jonową roztworu.

Na przebieg reakcji wpływ ma wiele czynników, a ich odzwierciedleniem są zmiany w kinetyce przemiany enzymatycznej. Procesy katalizy są charakteryzowane w oparciu o dwa główne parametry:

maksymalną szybkość reakcji enzymatycznej – Vmax oraz stałą Michaelisa-Menten – Km. Vmax informuje o maksymalnej szybkości z jaką może zachodzić katalizowana reakcja, natomiast stała Km definiuje stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji enzymatycznej wynosi dokładnie połowę szybkości maksymalnej Vmax. Jest to także stężenie substratu, przy którym połowa miejsc aktywnych enzymu jest obsadzona substratem. Na wartość stałej Michaelisa-Menten wpływ ma: pH, temperatura, siła jonowa oraz rodzaj i stężenie substratu, jak i inhibitorów, jednak jej wartość nie zależy od stężenia enzymu. Dzięki modelowi Michaelisa-Menten możliwe jest także zdefiniowanie zależności szybkości reakcji katalitycznej od stężenia substratu, co graficznie zaprezentowano na rys. 6. Gdy stężenie substratu jest niewielkie, istnieje wówczas liniowa zależność pomiędzy stężeniem a szybkością reakcji. Natomiast kiedy dostępna jest duża ilość cząsteczek substratu (wysokie stężenie), wówczas szybkość procesu katalitycznego jest niemalże całkowicie niezależna od stężenia.

Rys. 6. Krzywa obrazująca zależność szybkości reakcji katalitycznej od stężenia substratu

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35

0 1000 2000 3000 4000

Szybkość reakcji

Stężenie substratu Vmax

1/2 Vmax

Km

(25)

- 25 -

Obecność w mieszaninie reakcyjnej innych jonów lub cząsteczek, niebędących bezpośrednimi substratami reakcji enzymatycznej, może mieć duży wpływ na przebieg oraz wydajność realizowanej przemiany. Białka katalityczne są bowiem bardzo czułe na występowanie różnych substancji, które mogą hamować ich aktywność. Substancje te nazywane są inhibitorami i odpowiadają za zmniejszenie katalitycznej efektywności enzymów [64]. Molekuły ograniczające działanie biokatalizatorów mogą łączyć się z ich cząsteczkami na drodze słabych oddziaływań, jak i w sposób trwały, dlatego wyróżnić należy inhibicję odwracalną i nieodwracalną. Inhibicję odwracalną można dalej podzielić na: kompetycyjną, akompetycyjną oraz niekompetycyjną, a nazewnictwo to jest konsekwencją współzawodnictwa pomiędzy cząsteczkami inhibitorów i substratów o miejsce aktywne, jak i różnych miejsc w enzymie, do których przyłączony może zostać związek blokujący [65]. Graficzną prezentację poszczególnych typów inhibicji odwracalnej zaprezentowano na rys. 7. Poza głównymi typami inhibicji, które spotykane są najczęściej, nie można także pominąć inhibicji allosterycznej, częściowej, postępującej wraz z czasem prowadzenia procesu, oraz typu „tight-binding” [66].

Rys. 7. Schematyczne zaprezentowanie różnych rodzajów inhibicji: a) kompetycyjna, b) akompetycyjna, c) niekompetycyjna, gdzie: S – substrat, E – enzym, I – inhibitor, E+I – kompleks enzym-inhibitor,

E+S+I – kompleks enzym-substrat-inhibitor, na podstawie [65,66]

a)

b)

c)

E E

E I

I I

S S

S

S E+I

E+S+I

E+I S

S

(26)

- 26 -

Najczęściej spotykanym typem blokowania enzymów jest inhibicja kompetycyjna, w której substrat i inhibitor konkurują o miejsce w centrum aktywnym białka (rys. 7a). W większości przypadków, inhibitor jest budową strukturalną bardzo zbliżony do cząsteczki substratu, co powoduje, że przyłączenie inhibitora właściwie uniemożliwia przyłączenie reagenta i odwrotnie. Warto jednak dodać, że istnieje możliwość kontroli inhibicji kompetycyjnej. Poprzez zwiększenie stężenia substratów proces inhibicji może zostać przezwyciężony, nie powodując drastycznych zmian w efektywności biokatalizatora. W tego rodzaju inhibicji maksymalna szybkość reakcji (Vmax) nie zmienia się, natomiast ze względu na malejące powinowactwo enzymu do substratu wzrasta wartość stałej Michaelisa-Menten (Km) [67].

W przypadku inhibicji akompetycyjnej (rys. 7b) inhibitor nie przyłącza się do natywnej formy białka, tylko do wytworzonego już kompleksu aktywnego enzym-substrat. Powoduje to pozorne zmniejszenie stężenia tego kompleksu i w konsekwencji obniżenie wartości stałej Km. Co więcej, ze względu na fakt, że centrum aktywne białka ciągle jest zablokowane i nie ma możliwości realizacji kolejnych aktów katalitycznych, spada także wartość szybkości reakcji. Ten rodzaj inhibicji jest jednak relatywnie rzadko spotykany i dotyczy głównie enzymów multimerycznych, o złożonej budowie [68].

Inhibicja niekompetycyjna (rys. 7c) polega na tym, że inhibitor może związać się z wolną formą białka, jednak poza miejscem aktywnym. Przyłączenie dużych cząsteczek inhibitora może blokować dostęp do centrum katalitycznego enzymu lub wywoływać w nim pewne zmiany konformacyjne. Spowalnia to lub całkowicie hamuje przebieg reakcji i powoduje obniżenie wartości Vmax, jednocześnie nie wpływając na wartość stałej Michaelisa-Menten. Warto dodać, że w przypadku reakcji z inhibicją niekompetencyjną, istnieje możliwość wytworzenia kompleksów enzym-inhibitor oraz enzym-substrat-inhibitor, jednak w obu przypadkach są to układy katalitycznie nieaktywne [68].

Poza przedstawionymi powyżej przykładami wyróżnić należy także inhibicję nieodwracalną.

W takim przypadku dochodzi do stałego, zazwyczaj kowalencyjnego, związania substancji inhibitującej z jednym lub kilkoma łańcuchami białkowymi enzymu. Efektem tego typu działania jest skuteczne i trwałe zablokowanie centrum aktywnego białka, co prowadzi do jego dezaktywacji. Mechanizm inhibicji nieodwracalnej jest często stosowany w terapii wielu chorób. Inhibitory (np. eflornityna czy penicylina) zostają wprowadzone do ludzkiego organizmu gdzie wiążą się z resztami aminokwasów tworzących enzym i/lub centrum aktywne, powodując ich zablokowanie [69].

Inhibicja, czego najlepszym dowodem jest powyższy przykład, pomimo blokowania działania enzymów nie musi być rozpatrywana tylko poprzez pryzmat swoich negatywnych efektów. Znane są przykłady reakcji, gdzie inhibitory odpowiedzialne są za regulację aktywności enzymatycznej poprzez sprzężenie zwrotne. Mechanizm ten doskonale sprawdza się w ludzkim organizmie. Nadmierny wzrost stężenia produktu reakcji katalizowanej przez enzym może prowadzić do inhibicji białka, a taka sytuacja znacząco obniża zdolności produkcyjne biokatalizatora [70,71].

Wspomniana już wcześniej lipaza, pochodząca z Pseudomonas aeruginosa oraz pozyskana z komórek ludzkiego żołądka traci swoją aktywność pod wpływem działania wybranych jonów metali, takich jak jony: miedzi, cynku, kobaltu czy srebra. Co więcej, enzymy z tej podpodklasy są również czułe

(27)

- 27 -

na związki z grup alkaloidów, polifenoli czy flawonoidów, a także wybranych surfaktantów, wśród nich między innymi saponin czy laurylosiarczanu sodu (SDS) [72-74]. Z kolei ureazy, białka katalityczne należące do tej samej klasy enzymów – hydrolaz, są wrażliwe na działanie np. jonów metali ziem alkalicznych oraz jonów rtęci, kobaltu czy miedzi [75], jak i wybranych pochodnych związków organicznych, wśród których największymi zagrożeniami są pochodne tiolowe oraz pochodne kwasów hydroksamowych [76]. Toksyczny wpływ na ureazy mają także niektóre kwasy nieorganiczne, np. kwas borny [77].

Sposób prowadzenia procesu, jak i poprawne oddzielenie produktów reakcji po procesie to również istotne parametry, które wpływają na sprawność biokatalizatora enzymatycznego. Blokowanie centrów aktywnych enzymów ma miejsce także w przypadku niewłaściwej separacji produktów przemiany katalitycznej z mieszaniny reakcyjnej. Odpowiedni odbiór produktów jest kluczowy, zwłaszcza jeśli dana przemiana katalizowana jest przez więcej niż jeden rodzaj enzymów, a produkty jednej reakcji mogą być inhibitorami biokatalizatorów pracujących w następnych etapach procesu [78]. Dobór odpowiedniego rodzaju procesu, a przy tym zapewnienie warunków pracy, które skutkować będą zachowaniem wysokiej aktywności biokatalizatorów, to podstawowe kwestie, które przekładają się na wysoką efektywność oraz wydajność prowadzonych przemian [79].

Rodzaj mikroorganizmu, z którego pochodzi dany enzym, jak i sposób jego ekstrakcji są ważnymi czynnikami, mającymi bezpośredni wpływ na jego strukturę oraz aktywność. Wykazano bowiem, że z każdego ze źródeł enzymów można pozyskać kilka form tego samego białka katalitycznego. Dobrym przykładem są lipazy typu A oraz B pozyskane z Candida antarctica. Lipaza typu B wykazuje wysoką stereoselektywność, podczas gdy lipaza typu A wykazuje selektywność względem zupełnie innych substratów na skutek odmiennej budowy przestrzennej centrum aktywnego [80]. W trakcie prowadzonych badań udowodniono również, że obecność surfaktantów (np. Tween 20 lub Tween 80) w pożywce wykorzystywanej podczas hodowli mikroorganizmów, determinuje i zmienia ilość różnych form lipazy, w porównaniu z hodowlą bez dodatku związków powierzchniowo czynnych, które można pozyskać z danego mikroorganizmu [81,82].

Większość procesów metabolicznych z udziałem enzymów zachodzi w środowisku wodnym.

Zmiana rozpuszczalnika na medium organiczne, powszechnie wykorzystywane w wielu syntezach, powoduje również modyfikację właściwości enzymów. Szeroko rozumiana synteza chemiczna, chemia metaloorganiczna oraz synteza i modyfikacja polimerów, to dziedziny w których zastosowanie enzymów w rozpuszczalnikach organicznych jest szczególnie zauważalne [83]. Białka katalityczne w środowisku niewodnym zazwyczaj wykazują większą stabilność, jednak pozostają w formie nierozpuszczonej, co powoduje tendencję do ich aglomeracji i w konsekwencji prowadzi do spadku aktywności [84]. Należy jednak odnotować, że prowadzenie reakcji w rozpuszczalniku organicznym umożliwia transformację związków o charakterze silnie hydrofobowym, co w środowisku wodnym jest trudne do osiągnięcia [85].

Wartym podkreślenia jest również fakt, że w medium organicznym, w porównaniu z warunkami wodnymi, zmianie mogą ulegać właściwości katalityczne enzymów. Przykład stanowią lipazy i esterazy, które

(28)

- 28 -

w środowisku wodnym katalizują hydrolizę estrów do alkoholi, a w rozpuszczalniku organicznym katalizują reakcje transestryfikacji tych samych substratów [86], co schematycznie przedstawiono na rys. 8.

Rys. 8. Reakcje katalizowane przez lipazy, w zależności od środowiska ich prowadzenia

Enzymy są niezwykle istotnymi katalizatorami wielu zróżnicowanych procesów realizowanych w organizmach żywych, jak i w skali przemysłowej. Ich niska stabilność, rozumiana jako szybka utrata właściwości katalitycznych, w warunkach innych niż optymalne oraz złożony wpływ wielu czynników decydują o szybkiej utracie swoistych właściwości przez te białka. Warunki prowadzenia procesu oraz otoczenie chemiczne, w którym pracuje enzym, to jedne z głównych czynników mające bezpośredni wpływ na efektywność katalizowanych przemian, jak i żywotność oraz aktywność biokatalizatorów. Należy zatem pamiętać, że aby wydłużyć okres wysokiej aktywności katalizatora enzymatycznego, warunki prowadzenia procesu powinny zostać starannie dobrane, a ich kontrola, w trakcie trwania reakcji jest niezbędna.

1.5. Podsumowanie wiadomości dotyczących enzymów

Wszechobecność enzymów odzwierciedla ich kluczową rolę w nieskończonej ilości przemian katalitycznych zachodzących w naturze. Poza niekwestionowanym znaczeniem fizjologicznym w procesach metabolicznych, białka katalityczne wykazują szereg niepowtarzalnych właściwości, które powodują, że są to niezwykle cenne narzędzia, wykorzystywane do katalizowania reakcji prowadzonych w skali technicznej. Jest to związane z faktem, że białka katalityczne umożliwiają prowadzenie reakcji w łagodnych warunkach, w sposób, który wpisuje się w założenia tzw. zielonej chemii, a enzymy, jako biokatalizatory, nie są szkodliwe dla środowiska. Trudno wymienić gałąź przemysłu, w której choćby na jednym z etapów produkcji nie wykorzystuje się białek katalitycznych, a inżynieria enzymatyczna staje się coraz bardziej zaawansowaną dziedziną nauki, której rozwój postępuje bardzo dynamicznie.

Dotychczas opublikowane doniesienia literaturowe podają, że poznano, wyizolowano i scharakteryzowano kilka tysięcy enzymów, które podzielone zostały na sześć głównych klas (grup)

rozpuszczalniki organiczne

LIPAZY

procesy hydrolizy

rozpuszczalniki wodne

procesy transestryfikacji