CEL I ZAKRES PRACY
4. Metodyka przygotowania nośników wykorzystanych w procesie immobilizacji enzymów
4.1. Synteza hydroksyapatytu
W celu wytworzenia hydroksyapatytu, 100 ml wodnego roztworu chlorku wapnia (Chempur, Polska) o stężeniu 1 M wprowadzono do reaktora o pojemności 500 ml, umieszczonego w łaźni wodnej Julabo 13 EH, firmy Julabo Labortechnik GmbH (Niemcy) w temperaturze 40 °C. Reaktor wyposażono w mieszadło szybkoobrotowe EUROSTAR Digital (IKA-Werke GmbH & Co. KG, Niemcy) i rozpoczęto mieszanie z prędkością około 900 obr/min. W następnym kroku, przy użyciu pompy perystaltycznej ZALIMP PP1B-05A (Polska), zadozowano 100 ml wodnego roztworu Na2HPO4 (Chempur, Polska) o stężeniu 0,6 M z prędkością 2 ml/min. Po zakończeniu dodawania wodorofosforanu disodu proces mieszania kontynuowano przez około 15 min w celu zapewnienia wysokiego stopnia konwersji substratu. Powstały produkt sączono pod zmniejszonym ciśnieniem, przemyto kilkakrotnie gorącą wodą destylowaną, a następnie suszono w suszarce stacjonarnej UFB 500 BASIC (Memmert GmbH & Co. KG, Niemcy) w temperaturze 105 °C przez 24 h. Końcowym etapem przygotowania hydroksyapatytu do immobilizacji była jego 24-godzinna kalcynacja w temperaturze 600 °C przeprowadzona z użyciem pieca firmy Nabertherm (Niemcy) oraz przesianie przez sito o wielkości oczek 63 µm. Schemat przygotowania hydroksyapatytu został zaprezentowany na rys. 19.
Rys. 19. Uproszczony schemat technologiczny syntezy hydroksyapatytu, gdzie: 1 – pompa perystaltyczna, 2 – reaktor z mieszadłem, 3 – zestaw do filtracji,
4 – suszarka stacjonarna, 5 – piec do kalcynacji 4.2. Synteza krzemionki typu zol-żel
Krzemionkę typu zol-żel, wykorzystaną jako nośnik w procesie immobilizacji, otrzymano z zastosowaniem zmodyfikowanej metody Stöbera [341], która polega na hydrolizie i kondensacji alkoksysilanów w środowisku alkoholu etylowego i wody amoniakalnej. Zastosowana procedura została wcześniej szczegółowo opracowana i zoptymalizowana w Zakładzie Technologii Chemicznej Politechniki Poznańskiej [342].
80
-Do reaktora o pojemności 500 ml zaopatrzonego w mieszadło szybkoobrotowe EUROSTAR Digital (IKA-Werke GmbH & Co. KG, Niemcy), wprowadzono 100 ml 96-proc. alkoholu etylowego (Chempur, Polska) oraz 11 ml 25-proc. roztworu wody amoniakalnej (Chempur, Polska) i rozpoczęto mieszanie z szybkością około 1200 obr/min. Następnie przy pomocy pompy perystaltycznej ZALIMP PP1B-05A (Polska), zadozowano 17 ml tetraetoksysilanu (TEOS) zakupionego w firmie VWR International (Polska), z szybkością około 1 ml/min. Cały proces prowadzono jeszcze przez 30 min w temperaturze 40 °C, w łaźni wodnej Julabo 13 EH, firmy Julabo Labortechnik GmbH (Niemcy).
Powstały osad sączono pod zmniejszonym ciśnieniem na zestawie firmy Sartorius Stedim Biotech (Niemcy) po czym intensywnie przemywano alkoholem etylowym w celu deaglomeracji powstałych cząstek. W końcowym etapie krzemionkę suszono w suszarce stacjonarnej UFB 500 BASIC (Memmert GmbH & Co. KG, Niemcy) w temperaturze 105 °C przez 24 h, a następnie przesiano przez sito o wielkości oczek 63 µm.
Uproszczony schemat otrzymywania krzemionki metodą zol-żel zaprezentowano na rys. 20.
Rys. 20. Uproszczony schemat technologiczny syntezy krzemionki zol-żel, gdzie: 1 – pompa perystaltyczna, 2 – reaktor z mieszadłem, 3 – zestaw do filtracji,
4 – suszarka stacjonarna, na podstawie [342]
4.3. Otrzymywanie materiału hybrydowego krzemionka-lignina
Synteza materiału hybrydowego krzemionka-lignina jest procesem złożonym z kilku etapów, które zostały szczegółowo opracowane w Zakładzie Technologii Chemicznej Politechniki Poznańskiej [343-346].
W oparciu o te prace przeprowadzono syntezę tego materiału.
W badaniach wykorzystano komercyjnie dostępną krzemionkę Syloid® 244, która została wyprodukowana przez firmę W.R. Grace & Co. (USA). Jest to białe, amorficzne ciało stałe o hydrofilowym charakterze i cząstkach o nieregularnych kształtach.
W pierwszym etapie prac dotyczących otrzymania materiału krzemionka-lignina, powierzchnię krzemionki poddano modyfikacji silanowym związkiem wiążącym, którym był N-2-(aminoetylo)-3-aminopropylotrimetoksysilan dostarczony przez firmę Sigma-Aldrich, USA. Modyfikator, w ilości
96% C2H5OH 25% NH3·H2O
81
-5 cz. wag. został rozpuszczony w mieszaninie alkoholu metylowego z wodą (4:1, v/v) i z wykorzystaniem atomizera naniesiony na powierzchnię krzemionki, a następnie całość dokładnie wymieszano.
Zmodyfikowaną krzemionkę suszono następnie przez 24 h w temperaturze 105 °C.
Drugim etapem badań była aktywacja ligniny krafta (Sigma-Aldrich, USA), aby zwiększyć jej powinowactwo do krzemionki. W tym celu 1 g ligniny zawieszono w mieszaninie dioksanu i wody (9:1, v/v) i umieszczono w reaktorze. Do przestrzeni reakcyjnej, wyposażonej w mieszadło szybkoobrotowe EUROSTAR Digital (IKA-Werke GmbH & Co. KG, Niemcy) zadozowano roztwór powstały w wyniku rozpuszczenia 1,5 g jodanu(VII) sodu (Sigma-Aldrich, USA) w 30 ml wody, a po dodaniu aktywatora, proces prowadzono jeszcze przez 30 min, bez dostępu światła.
Końcowym etapem prac nad syntezą materiału krzemionka-lignina było dodanie 5 g zmodyfikowanej uprzednio krzemionki i kontynuowanie mieszania przez 1 h. Po tym czasie, powstały materiał hybrydowy przeniesiono na wyparkę próżniową Rotavapor RII-HB 50Y (BÜCHI Labortechnik AG, Szwajcaria) w celu oddzielenia rozpuszczalników. Produkt suszono następnie w suszarce konwekcyjnej UFB 500 BASIC (Memmert GmbH & Co. KG, Niemcy) w temperaturze 105 °C przez 24 h.
Na rys. 21. schematycznie zaprezentowano syntezę materiału krzemionka-lignina.
Rys. 21. Schemat technologiczny syntezy materiału hybrydowego krzemionka-lignina, gdzie: 1 – pompa perystaltyczna, 2 – reaktor z mieszadłem, 3 – wyparka próżniowa,
4 – suszarka stacjonarna, na podstawie [343]
4.4. Synteza układu chityna-lignina
Proces otrzymywania materiału chityna-lignina składał się z dwóch etapów, z których pierwszy polegał na odpowiednim przygotowaniu chityny, a drugi na syntezie finalnego układu. W badaniach wykorzystano doświadczenie pracowników zespołu Zakładu Technologii Chemicznej Politechniki Poznańskiej w zakresie syntezy tego materiału [347].
W pierwszej kolejności, komercyjnie dostępną chitynę z pancerzyków krewetek (Sigma-Aldrich, USA), rozdrobniono w ucieraku moździerzowym RM 100 (Retsch GmbH, Niemcy) w środowisku ciekłego azotu, a następnie, w celu klasyfikacji, przesiano przez sito o średnicy oczek 80 µm.
82
-W trakcie syntezy przeprowadzono, analogicznie do procesu otrzymywania materiału krzemionka-lignina, aktywację ligniny wykorzystując do tego 15-proc. roztwór nadtlenku wodoru (Sigma-Aldrich, USA). W tym celu do reaktora wprowadzono 5 g ligniny oraz 15 ml H2O2 i całość mieszano przez 30 min za pomocą mieszadła szybkoobrotowego EUROSTAR Digital (IKA-Werke GmbH & Co. KG, Niemcy) z szybkością ok. 800 obr/min. Po tym czasie do układu wprowadzono 5 g przygotowanej uprzednio chityny i kontynuowano mieszanie przez 1 h. Ideę procesu modyfikacji opisano we wcześniej opublikowanych pracach [347].
Po zakończeniu mieszania gotowy produkt sączono pod zmniejszonym ciśnieniem na lejku Büchnera, intensywnie przemywając gorącą wodą w celu odmycia pozostałości ligniny. Układ suszono w suszarce stacjonarnej UFB 500 BASIC (Memmert GmbH & Co. KG, Niemcy) w temperaturze 105 °C przez 24 h i przesiano przez sito o wielkości oczek 80 µm.
Na rys. 22. schematycznie przedstawiono poszczególne etapy syntezy układu chityna-lignina.
Rys. 22. Schemat technologiczny syntezy układu chityna-lignina gdzie: 1 – reaktor z mieszadłem, 2 – zestaw do filtracji, 3 – suszarka stacjonarna 4.5. Modyfikacja chityny związkami typu POSS
W pierwszym etapie prac chitynę pozyskaną z pancerzyków krewetek, zakupioną w firmie Sigma-Aldrich (USA) rozdrobniono w ucieraku moździerzowym RM 100 (Retsch GmbH, Niemcy) w obecności ciekłego azotu i przesiano przez sito o wielkości oczek 80 µm.
Następnie 10 g tak przygotowanej chityny wprowadzono do reaktora i dodano 30 ml roztworu zawierającego 5 g odpowiedniego związku typu POSS. Jako modyfikatory wybrano Methacryl POSS Cage mixture (MPOSS) oraz Vinyl POSS Cage mixture (VPOSS), które zostały rozpuszczone odpowiednio w etanolu oraz w tetrahydrofuranie (THF). Powstałe roztwory poddano mieszaniu za pomocą mieszadła EUROSTAR Digital (IKA-Werke GmbH & Co. KG, Niemcy) z szybkością ok. 800 obr/min przez okres 1 h. Kolejnym etapem było odparowanie rozpuszczalnika z wykorzystaniem wyparki próżniowej Rotavapor RII-HB 50Y firmy BÜCHI Labortechnik AG (Szwajcaria). Następnie zmodyfikowaną chitynę suszono w temperaturze 100 °C przez okres 12 h.
83
-Na rys. 23. przedstawiono poszczególne etapy procesu modyfikacji chityny związkami typu POSS.
Rys. 23. Schemat procesu modyfikacji powierzchni chityny związkami z grupy poliedrycznych oligomerycznych silseskwioksanów, gdzie: 1 – reaktor z mieszadłem,
2 – wyparka, 3 – suszarka stacjonarna 4.6. Preparatyka gąbki roślinnej z gatunku Luffa cylindrica
Gąbkę roślinną z gatunku Luffa cynlindrica, zakupioną w sklepie zielarskim, rozdrobniono a następnie oczyszczono z zanieczyszczeń w postaci barwników, protein oraz węglowodorów.
Gąbkę pocięto na kawałki o wymiarach 2 x 2 x 0,3 cm, które następnie umieszczono w reaktorze w 0,1 M roztworze NaOH (Chempur, Polska). Reaktor ogrzewano w łaźni wodnej Julabo 13 EH, firmy Julabo Labortechnik GmbH (Niemcy), w temperaturze 80 °C nieustannie mieszając zawartość za pomocą mieszadła mechanicznego EUROSTAR Digital (IKA-Werke GmbH & Co. KG, Niemcy)
z szybkością ok. 200 obr/min przez okres 2 h. Po zakończeniu tego procesu roztwór z gąbkami odsączono grawitacyjnie i odmyto wodą destylowaną do uzyskania pH=7. W celu dokładnego oczyszczenia gąbki, opisane powyżej czynności powtórzono trzykrotnie. Rozdrobnione i oczyszczone gąbki suszono w suszarce UFB 500 BASIC (Memmert GmbH & Co. KG, Niemcy) w temperaturze 70 °C przez 24 h.
4.7. Preparatyka gąbki morskiej z gatunku Hippospongia communis
Gąbki morskie, które zostały zebrane u wybrzeży Tunezji i dostarczone przez INTIB GmbH (Niemcy) poddano procesowi oczyszczania w celu wyeliminowania zanieczyszczeń mineralnych.
W pierwszej kolejności gąbki zostały dokładnie wypłukane wodą destylowaną, a następnie umieszczone w 3 M roztworze kwasu chlorowodorowego na okres 72 h. Po upływie tego czasu wyjęto je i intensywnie odmyto wodą destylowaną do uzyskania pH=7. Gąbki zostały następnie pozostawione w suszarce stacjonarnej, w temperaturze 50 °C, na okres 24 h, a następnie rozdrobnione na fragmenty o zbliżonych rozmiarach ok. 2 x 2 x 0,3 cm.
84