Definicja i podstawowe informacje dotyczące immobilizacji enzymów

Białka katalityczne są coraz szerzej wykorzystywane w wielu procesach technologicznych.

Głównym czynnikiem, który limituje ich efektywne zastosowanie jest obniżenie aktywności, rozumiane jako zmniejszenie wydajności katalizowanej przemiany, wynikające z budowy i wrażliwość tych cząsteczek na warunki środowiska reakcji. Stąd też nastąpił dynamiczny rozwój badań mających na celu poprawę odporności enzymów na zmienne warunki reakcyjne, a spośród kilku przebadanych technik, immobilizacja okazała się najbardziej skuteczną metodą. Jest to proces polegający na związaniu enzymu ze stałym,

- 30 -

nierozpuszczalnym w środowisku reakcji nośnikiem, przy jednoczesnym zachowaniu przez biokatalizator właściwości katalitycznych [87-90]. Należy odnotować, że unieruchomienie enzymów skutkuje zmianą formy katalizatora z postaci homogenicznej, w przypadku wolnego enzymu, do formy heterogenicznej dla immobilizowanego biokatalizatora [91]. Idea procesu immobilizacji enzymów została schematycznie zaprezentowana na rys. 9.

Rys. 9. Schematyczne zaprezentowanie procesu immobilizacji enzymów, na podstawie [87]

Zmiana formy białka katalitycznego (w wyniku immobilizacji) jest niezwykle istotna ze względu na fakt, że wykorzystanie unieruchomionego enzymu pozwala na znacznie łatwiejsze oddzielenie biokatalizatora od mieszaniny reakcyjnej po zakończonym procesie. Ma to bezpośredni związek z czystością otrzymanych produktów, które nie są zanieczyszczone zużytym białkiem katalitycznym [92].

Przyłączenie naturalnego katalizatora do nierozpuszczalnego nośnika skutkuje także znaczącym wydłużeniem aktywności katalitycznej enzymu, co umożliwia jego wykorzystanie w kilku następujących po sobie cyklach reakcyjnych, co nie jest możliwe w przypadku białka katalitycznego w natywnej formie [93,94]. Dodatkowo, możliwe staje się magazynowanie wytworzonych wcześniej preparatów, gdyż po przeprowadzeniu procesu unieruchomienia odnotowuje się znacznie wolniejszy spadek aktywności białka.

Opublikowane dotąd wyniki badań potwierdzają również, że proces immobilizacji wpływa pozytywnie na całą strukturę białkową poprzez jej stabilizację i wzmocnienie, co przekłada się na zwiększenie odporności enzymu na niekorzystne działanie pH, temperatury czy chemicznych środków denaturujących [95-97].

Immobilizowane enzymy zachowują ponadto wysoką aktywność w rozpuszczalnikach organicznych, przy jednoczesnym zachowaniu pierwotnych funkcji katalitycznych, co nie jest możliwe w przypadku wykorzystania rozpuszczalnej formy biokatalizatora [98,99]. Zastosowanie enzymów związanych z podłożem daje także możliwość prowadzenia reakcji w reaktorze okresowym i/lub ciągłym, ponieważ takie rozwiązanie pozwala na stałe dostarczanie substratów oraz odbieranie produktów reakcji [100]. Jest to istotny aspekt, ponieważ skuteczność i wydajność procesu katalitycznego zależą od stężenia substratów i produktów reakcji, które mogą być inhibitorami enzymów. Doniesienia literaturowe wskazują,

- 31 -

że ze względu na fakt ingerencji w strukturę białka, jak i możliwość powstania zawady przestrzennej, w wyniku procesu immobilizacji, możliwe jest obniżenie zdolności katalitycznych preparatów po immobilizacji, kosztem poprawy innych cech użytkowych. Nie zawsze jednak jest to obserwowane, bowiem podczas reakcji syntezy estrów katalizowanej przez lipazy odnotowano nawet 40-krotny wzrost właściwości katalitycznych enzymu po immobilizacji, w porównaniu z białkiem w formie natywnej, ze względu na większą ochronę biokatalizatora przed denaturacją [101].

Termin „immobilizowany enzym” w literaturze pojawił się w latach pięćdziesiątych XX wieku, natomiast pierwsze zastosowanie immobilizowanych biokatalizatorów zostało opisane przez Chibata i współpracowników w 1966 roku. W swojej pracy przedstawili oni wykorzystanie aminoacylazy z Aspergillus oryzae w procesie racemicznego rozdziału mieszaniny syntetycznych D-L-aminokwasów [102]. Wartym odnotowania jest fakt, że w początkowym okresie rozwoju metod unieruchamiania biokatalizatorów, poprzez immobilizowany enzym rozumiano białko katalityczne, które jest bezpośrednio związane z nośnikiem. Wraz z ich rozwojem pojawiły się jednak nowe rozwiązania i obecnie określenie unieruchomiony enzym oznacza białko bezpośrednio lub pośrednio związane z nośnikiem. Co więcej, wyróżnia się techniki, w których enzym jest otoczony przez nośnik, a także takie, w których nie występuje matryca w klasycznym rozumieniu tego słowa [103-105]. Obecnie immobilizacji poddaje się nie tylko pojedyncze enzymy, ale również kompleksy dwu- i wieloenzymatyczne lub żywe komórki z zachowaniem ich aktywności metabolicznej, a nawet rozbudowane struktury subkomórkowe [106].

Niemniej jednak żadna z technik powodujących zmianę formy biokatalizatora, w tym także immobilizacja, nie jest pozbawiona wad. Samo przeprowadzenie tego procesu może wiązać się z pogorszeniem właściwości katalitycznych enzymu. Może to być spowodowane usztywnieniem struktury białkowej, jak i oporami dyfuzyjnymi w swobodnym transporcie substratów i produktów, do i z centrum aktywnego. Utrudniony przepływ składników mieszaniny reakcyjnej jest wynikiem zawady przestrzennej, która powstaje wskutek przyłączenia cząsteczek białka do nośnika lub też związany jest z powstaniem oddziaływań w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca aktywnego [105,107]. Dodatkowo, trwałe połączenie enzymu z nośnikiem może powodować brak możliwości ponownego zastosowania matrycy, ze względu na trudności w usunięciu zdezaktywowanego białka [108]. Jednak w obliczu znaczącej poprawy właściwości preparatów po prawidłowo przeprowadzonej immobilizacji, zalety płynące z unieruchomienia znacząco przeważają nad wadami.

Efektywność pracy preparatów po immobilizacji w procesach przemysłowych zależna jest od kilku czynników, wśród których najważniejsze są trzy: rodzaj enzymu, typ wykorzystanego nośnika oraz zastosowana metoda immobilizacji, co zobrazowano na rys. 10 [109-111]. Wybór enzymu, który ma zostać poddany unieruchomieniu determinowany jest przez rodzaj katalizowanej przemiany. Właściwości biochemiczne oraz strukturalne, w tym konformacja przestrzenna białka oraz ilość i rodzaj grup funkcyjnych w jego strukturze, to podstawowe parametry, które poddawane są analizie w trakcie projektowania procesu immobilizacji. Istotny jest również dobór odpowiedniego nośnika, którego selekcja zależy w głównej mierze od jego stabilności operacyjnej i właściwości mechanicznych. Niemniej ważny

- 32 -

jest także charakter chemiczny matrycy oraz typ powierzchniowych grup chemicznych, które odpowiedzialne są za wytworzenie stabilnych oddziaływań z enzymem. Dobór właściwej techniki immobilizacji ma także wpływ na występowanie oporów dyfuzyjnych związanych z transportem komponentów mieszaniny reakcyjnej. Wybór odpowiedniej metody unieruchamiania wpływa również na stabilność immobilizowanych białek katalitycznych w zmiennych warunkach. Oprócz wyżej wymienionych czynników, także warunki prowadzenia procesu czy jego rodzaj (ciągły lub okresowy) determinują efektywność pracy unieruchomionego enzymu i wpływają na wydajność całego procesu technologicznego.

Właściwości biochemiczne

Rodzaj i kinetyka reakcji

Charakter chemiczny

Właściwości mechaniczne

ENZYM NOŚNIK

EFEKTYWNOŚĆ DZIAŁANIA PREPARATÓW PO IMMOBILIZACJI

TYP IMMOBILIZACJI

Stabilność operacyjna

Opory dyfuzyjne

Rys. 10. Czynniki kształtujące efektywność pracy preparatów po immobilizacji w procesach przemysłowych

W trakcie realizowanego procesu przemysłowego unieruchomiony biokatalizator częściowo traci swoje właściwości. Parametrem charakteryzującym stabilność operacyjną preparatów po immobilizacji jest czas aktywności katalitycznej enzymu (ang. enzyme half-life) – t1/2. Jest to wielkość opisująca okres, po którym zachodzi utrata połowy początkowej aktywności katalitycznej enzymu. Najczęściej spowodowane jest to utratą aktywności przez enzym, wskutek inhibicji, denaturacji czy negatywnego wpływu zanieczyszczeń mikrobiologicznych. Istotne znaczenie dla zaniku właściwości katalitycznych ma także wymycie biokatalizatora z nośnika, blokowanie porów matrycy oraz zniszczenie materiału nośnego [112,113].

Dobór konkretnego enzymu determinowany jest przez rodzaj procesu, który ma być katalizowany. Rodzaj biokatalizatora, jak i typ przemiany chemicznej wpływają także na selekcję nośnika, na którym osadzone ma zostać białko. Każdorazowo istnieje możliwość wyboru kilku nośników, a kluczowa, dla wytworzenia stabilnych i trwałych oddziaływań, jest komplementarność grup funkcyjnych matrycy oraz enzymu. Najważniejsze jednak dla zachowania jak najdłuższej i najwyższej aktywności preparatów po immobilizacji jest utrzymanie właściwego balansu pomiędzy wszystkimi czynnikami kształtującymi właściwości katalityczne unieruchomionych enzymów.

- 33 -