CEL I ZAKRES PRACY
9. Immobilizacja Amano Lipase A z Aspergillus niger na powierzchni krzemionki typu zol-żel 101
Kolejnym etapem badań realizowanych w ramach przedkładanej dysertacji było unieruchomienie Amano Lipase A z Aspergillus niger (ALA) na powierzchni zsyntezowanej krzemionki typu zol-żel.
Dostępność, wysoka stabilność termiczna i mechaniczna oraz obojętność chemiczna powodują, że jest to interesujący materiał, który wykorzystany został jako matryca.
W trakcie przeprowadzonych analiz potwierdzono skuteczne unieruchomienie enzymu na powierzchni matrycy oraz zdefiniowano ilość naniesionego białka. Najważniejszym etapem prac było jednak scharakteryzowanie aktywności katalitycznej zachowanej przez unieruchomioną lipazę, co pozwoliło na określenie, w jaki sposób ilość zaadsorbowanego białka wpływa na aktywność powstałych systemów biokatalitycznych [368]. Obok stosowanych wcześniej metod analitycznych potwierdzających efektywność unieruchomienia enzymu, dodatkowo w przypadku omawianych systemów biokatalitycznych przeprowadzono ocenę stabilności elektrokinetycznej, istotnej z punktu widzenia ich praktyczngo wykorzystania.
9.1. Analiza FTIR – charakterystyka grup funkcyjnych
Dzięki wykorzystaniu spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera otrzymane zostały widma, w oparciu o które możliwe było potwierdzenie skutecznej immobilizacji lipazy na powierzchni matrycy krzemionkowej. Na rys. 27a zaprezentowano widma FTIR otrzymanej krzemionki zol-żel oraz Amano Lipase A z Aspergillus niger (ALA), natomiast na rys. 27b widma układów powstałych po 2 h immobilizacji lipazy z roztworów białka o zróżnicowanym stężeniu.
Rys. 27. Widma FTIR: a) Amano Lipase A z Aspergillus niger i zsyntezowanej krzemionki zol-żel oraz b) układów powstałych po 2 h immobilizacji lipazy na powierzchni krzemionki,
prowadzonej z roztworów enzymu o różnym stężeniu
Widmo FTIR krzemionki zol-żel (rys. 27a) odznacza się obecnością pięciu charakterystycznych sygnałów. Pierwszy z nich, z maksimum przy 3748 cm-1 pochodzi od drgań rozciągających pojedynczych
a) b)
102
-grup silanolowych ≡Si–OH obecnych na powierzchni krzemionki. Szerokie pasmo w zakresie 3450–3240 cm-1, jest konsekwencją występowania grup hydroksylowych na powierzchni nośnika, a maksimum przy liczbie falowej 1620 cm-1 związane jest z obecnością fizycznie zaadsorbowanej wody. Drgania rozciągające grup ≡Si–O– generują sygnał ok. 1120 cm-1 [369], natomiast 3 pasma, w zakresie pomiędzy 1000 a 469 cm-1 są pasmami typowymi dla materiałów krzemionkowych i pojawiają się w związku ze symetrycznymi oraz asymetrycznymi drganiami zginającymi wiązań ≡Si–O–Si≡ [370].
Na podstawie analizy wyników FTIR Amano Lipase A z Aspergillus niger (rys. 27a) wykazano, że w strukturze enzymu znajduje się wiele różnorakich grup funkcyjnych, odpowiedzialnych zarówno za aktywność białka, jak i umożliwiających jego przyłączenie do krzemionki. Dowodem na to jest obecność sygnałów związanych z występowaniem grup –OH i –NH2 (szerokie pasmo w zakresie 3600–3200 cm-1), grup karbonylowych C=O (ok. 1700 cm-1) oraz wiązań C–OH (1415 cm-1). Charakterystyczne dla struktur białkowych jest również występowanie sygnałów związanych z obecnością wiązań amidowych.
Posiadają one swoje maksima przy liczbach falowych 1645 cm-1 (wiązania amidowe I) oraz 1542 cm-1 (wiązania amidowe II) [371,372]. Ponadto na widmie obecne jest również pasmo charakterystyczne dla wiązań C–H w grupach –CH2 oraz –CH3 (2930 cm-1), a także sygnały poniżej 1000 cm-1, które przypisane mogą zostać różnego typu drganiom wiązań węgiel-węgiel.
Na rys. 27b zaprezentowano wyniki analizy FTIR układów powstałych po 2-godzinnej immobilizacji lipazy z roztworów białka o różnym stężeniu. Na widmach obecne są sygnały charakterystyczne dla krzemionki, przy liczbach falowych 3748 cm-1, 1120 cm-1 oraz w zakresie 1000–469 cm-1, a także pasma potwierdzające obecność enzymu w analizowanych próbkach. Wśród nich, szeroki sygnał w zakresie 3550–3230 cm-1 (drgania rozciągające –OH i –NH2) oraz przy 2920 cm-1 (drgania rozciągające C–H). Kluczowe jest jednak występowanie sygnałów, które swoje maksima posiadają przy liczbach falowych 1637 oraz 1536 cm-1. Są to sygnały związane z obecnością wiązań amidowych I oraz II, których maksima, w stosunku do widma czystego enzymu, uległy nieznacznym przesunięciom. Jest to dowód nie tylko potwierdzający skuteczną immobilizację lipazy na powierzchni krzemionki [373], lecz przede wszystkim zachowanie przez enzym aktywności katalitycznej [374,375].
Przy analizie widm układów po immobilizacji należy także zwrócić uwagę na wzrost intensywności poszczególnych sygnałów, wraz ze zwiększeniem początkowego stężenia roztworu białka.
Podsumowując, można stwierdzić, że wraz ze wzrostem początkowego stężena roztworu enzymu zwiększa się ilość biokatalizatora osadzonego na powierzchni nośnika.
9.2. Analiza parametrów struktury porowatej
W celu oceny parametrów struktury porowatej nośnika krzemionkowego oraz dokonania porównania ich zmian w wyniku przeprowadzonego procesu immobilizacji wyznaczono powierzchnię właściwą, średnią średnicę porów oraz ich objętość. W tabeli 10 zaprezentowano wyniki dla próbek powstałych po 2-godzinnej immobilizacji z roztworów enzymu o zmiennym początkowym stężeniu.
103
Tabela 10. Parametry struktury porowatej nośnika krzemionkowego oraz układów po 2 h immobilizacji lipazy
Nazwa próbki Powierzchnia właściwa BET [m2/g]
Objętość porów [cm3/g]
Średnia średnica porów [nm]
Krzemionka zol-żel 9,8 0,007 2,8
Krzemionka + ALA 1 mg/ml 5,8 0,004 2,5
Krzemionka + ALA 3 mg/ml 4,9 0,004 2,0
Krzemionka + ALA 5 mg/ml 4,0 0,003 1,9
Krzemionka + ALA 7 mg/ml 3,9 0,003 1,8
Ocena porównawcza poszczególnych parametrów nośnika krzemionkowego oraz układów po immobilizacji jasno wskazuje na duże zmiany zachodzące w wartościach wszystkich analizowanych parametrów. Krzemionka otrzymana metodą zol-żel odznacza się powierzchnią właściwą wynoszącą 9,8 m2/g oraz ma pory o średnicy 2,8 nm i objętości 0,007 cm3/g. Największe zmiany w strukturze porowatej nośnika zachodzą po immobilizacji enzymu prowadzonej z roztworu enzymu o stężeniu 7 mg/ml, wówczas powierzchnia właściwa zmniejsza się do 3,9 m2/g, natomiast objętość porów wynosi 0,003 cm3/g, a ich średnica 1,8 nm. Jednak istotne zmiany dla poszczególnych wartości widoczne są już w wynikach dotyczących preparatów powstałych z wykorzystaniem roztworów białka o niższych stężeniach. Warto również odnotować, że znaczące obniżenie wartości poszczególnych parametrów wskazuje na unieruchomienie enzymu, podobnie jak w przypadku hydroksyapatytu, na powierzchni nośnika oraz w jego porach.
9.3. Stabilność elektrokinetyczna powstałych układów po immobilizacji enzymu
Ze względu na możliwość stosowania otrzymanych układów po immobilizacji w reakcjach modelowych prowadzonych w różnych warunkach pH, istotnym było określenie wpływu tego parametru na ich stabilność elektrokinetyczną. Właściwości elektrokinetyczne lipazy, nośnika krzemionkowego oraz produktów po immobilizacji, z roztworu enzymu o stężeniu 5 mg/ml, scharakteryzowano w zakresie pH od 2 do 10. Otrzymane krzywe, w postaci zależności potencjału dzeta od pH, zostały zaprezentowane na rys. 28. Uzyskane zależności pośrednio potwierdziły skuteczne unieruchomienie lipazy na powierzchni materiału krzemionkowego.
Analizowany nośnik krzemionkowy wykazuje punkt izoelektryczny w pH 4,7. Wartości potencjału dzeta spadają wraz ze wzrostem pH środowiska i osiągają najniższą wartość, -45 mV, w pH=10.
W oparciu o te dane można stwierdzić, że krzemionka zol-żel jest stabilna elektrokinetycznie w warunkach neutralnych oraz zasadowych. Amano Lipase A posiada punkt izoelektryczny przy pH 2,3 i w całym analizowanym zakresie wartości potencjału dzeta nie schodzą poniżej -10 mV.
104
-Rys. 28. Krzywe elektrokinetyczne Amano Lipase A z Aspergillus niger, zsyntezowanej krzemionki zol-żel oraz układów powstałych po immobilizacji enzymu
Na rys. 28 zaprezentowano również krzywe stabilności elektrokinetycznej układów po immobilizacji. Przebieg wszystkich krzywych jest zbliżony, a punkty izoelektryczne powstałych produktów znajdują się w zakresie pH od 3 do 4. Przebieg uzyskanej zależności jest zbliżony do kształtu krzywej otrzymanej dla nośnika krzemionkowego, co może wskazywać, że właściwości elektrokinetyczne otrzymanych układów determinowane są głównie przez nośnik. Należy ponadto odnotować, że wartości potencjału dzeta dla wszystkich układów po immobilizacji osiągają wartości poniżej -30 mV w pH powyżej 6, co wskazuje na zachowanie przez nie stabilności elektrokinetycznej w takich warunkach.
9.4. Określenie ilości unieruchomionego enzymu
W oparciu o dostępne dane eksperymentalne oraz z wykorzystaniem metody Bradford obliczono ilość enzymu zimmobilizowanego na powierzchni nośnika. Dane te, w zależności od czasu immobilizacji oraz początkowego stężenia roztworu białka, przedstawiono w tabeli 11. Wyniki zaprezentowano jako ilość mg Amano Lipase A (ALA) unieruchomionej na 1 g krzemionki typu zol-żel.
Analizując dane z tabeli 11 pod kątem wpływu czasu immobilizacji na ilość unieruchomionego enzymu stwierdzono, że proces przebiega najintensywniej w pierwszej godzinie jego trwania (unieruchomiona zostaje największa ilość enzymu). Pewne zmiany odnotowane zostały także w następnych 60 min jego trwania, jednak po przekroczeniu 2 h prowadzenia procesu nie obserwuje się wyraźnego zwiększenia ilości osadzonego biokatalizatora.
Rozpatrując wpływ stężenia roztworu białka na ilość zimmobilizowanej lipazy należy odnotować, że im wyższe było stężenie, tym więcej enzymu zostało unieruchomione. Wyraźny trend wzrostu ilości unieruchomionego enzymu jest zauważalny w przypadku stężeń 1, 3 oraz 5 mg/ml, natomiast maleje w przypadku stężenia 7 mg/ml. Jest to najprawdopodobniej wywołane wysyceniem nośnika, co
105
-uniemożliwia osadzenie większej ilości enzymu. Co ciekawe, im większe było początkowe stężenie enzymu, tym większe ilości białka zostały zaadsorbowane przez nośnik w tym samym czasie.
Tabela 11. Ilość enzymu unieruchomionego na powierzchni krzemionki typu zol-żel, w zależności od czasu immobilizacji oraz początkowego stężenia roztworu białka
Nazwa próbki
Stężenie roztworu enzymu [mg/ml]
1 3 5 7
Ilość unieruchomionego enzymu [mg/g]
Krzemionka + ALA 1 min 6 15 10 25
Krzemionka + ALA 1 h 17 62 118 155
Krzemionka + ALA 2 h 18 63 122 157
Krzemionka + ALA 24 h 18 63 122 158
Krzemionka + ALA 96 h 19 64 123 158
W przeprowadzonych badaniach unieruchomiono ponad 120 mg lipazy na 1 g nośnika po procesie trwającym 2 h z roztworu enzymu o stężeniu 5 mg/ml, co jest ilością niemal sześciokrotnie większą niż w podobnych badaniach zrealizowanych przez Galarneau wraz z zespołem [376]. Uzyskane rezultaty wskazują na duży potencjał krzemionki zol-żel jako nośnika w procesie immobilizacji enzymów, a dodatkowo potwierdzają wcześniejsze wnioski, że najbardziej optymalny czas dla immobilizacji Amano Lipase A z Aspergillus niger na jej powierzchni to 2 h.
9.5. Aktywność katalityczna układów po immobilizacji ALA
Aktywność katalityczna zachowana przez immobilizowane enzymy to kluczowy parametr determinujący ich wykorzystanie jako efektywnych systemów biokatalitycznych. W ramach zrealizowanych prac określono zachowanie aktywności hydrolitycznej unieruchomionej na powierzchni krzemionki Amano Lipase A (ALA). Otrzymane dane zaprezentowano w tabeli 12. Jako 100-proc. aktywność katalityczną przyjęto aktywność, którą charakteryzuje się natywna forma enzymu.
W ramach wykonanych badań dokonano oceny wpływu czasu immobilizacji oraz stężenia roztworu enzymu na zachowanie przez unieruchomione białko aktywności katalitycznej. Zachowanie najwyższej aktywności katalitycznej, 93,6%, odnotowano w przypadku układu powstałego po 2 h immobilizacji z roztworu zawierającego 7 mg/ml białka enzymatycznego. Z wyjątkiem tego przykładu, niezależnie od wyjściowego stężenia roztworu białka, najlepsze właściwości katalityczne zachowała lipaza po 24 h immobilizacji. Co więcej, im wyższe było stężenie enzymu tym gorsze właściwości katalityczne posiadały powstałe układy. Najniższą aktywność po unieruchomieniu (8,2%) wykazała lipaza immobilizowana przez 96 h z roztworu o najwyższym stężeniu (7 mg/ml). Zachowanie bardzo niewielkiej aktywności katalitycznej przez układ po immobilizacji, w przypadku którego unieruchomieniu uległo najwięcej enzymu może zostać wyjaśnione przez fakt, że wielowarstwowa adsorpcja oraz nagromadzenie
106
-zbyt dużej ilości cząsteczek enzymu w jednym miejscu może prowadzić do blokowania centrów aktywnych biokatalizatorów i w konsekwencji do obniżenia ich aktywności.
Tabela 12. Zachowana aktywność katalityczna Amano Lipase A z Aspergillus niger unieruchomionej na powierzchni krzemionki zol-żel