CEL I ZAKRES PRACY
8. Immobilizacja proteazy z Aspergillus oryzae na powierzchni hydroksyapatytu
Pierwszym etapem prac realizowanych w ramach przedkładanej dysertacji była immobilizacja proteazy z Aspergillus oryzae (PRT) na powierzchni hydroksyapatytu (HA), otrzymanego syntetycznie nośnika pochodzenia nieorganicznego. Wykazywane właściwości, jak i biozgodność oraz brak negatywnego wpływu na białka, powodują, że jest to interesujący materiał pod kątem jego wykorzystania w immobilizacji biokatalizatorów.
W toku zrealizowanych badań, potwierdzono skuteczne unieruchomienie enzymu, jak i zdefiniowano wpływ poszczególnych parametrów procesu, takich jak czas oraz wyjściowe stężenie roztworu białka na efektywność immobilizacji oraz ilość unieruchomionego białka [360]. Do tego celu zdecydowano się wykorzystać analizę spektroskopową i elementarną. Ponadto zdefiniowano parametry struktury porowatej, a ilość unieruchomionej proteazy oraz wydajność procesu obliczono bazując na wynikach pomiarów spektrofotometrycznych.
8.1. Analiza FTIR – charakterystyka grup funkcyjnych
W celu potwierdzenia efektywnego osadzenia proteazy na powierzchni nieorganicznej matrycy wykonano analizę FTIR produktów po 24-godzinnej immobilizacji z wykorzystaniem wyjściowych roztworów białka o różnym stężeniu. Otrzymane widma porównano z widmem zsyntezowanego hydroksyapatytu (rys. 26a). Najbardziej istotny zakres widma (pomiędzy 1700 a 1200 cm-1) został powiększony i zamieszczony na rys. 26b.
Rys. 26. Widma FTIR: a) hydroksyapatytu oraz układów po immobilizacji prowadzonej przez 24 h z roztworów enzymu o stężeniu 3, 5 oraz 7 mg/ml oraz b) widma FTIR analizowanych układów w zakresie liczby falowej 1700–1200 cm-1
Liczba falowa [cm-1]
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
0 500
0,9
0,9
0,9
1700 16001600 16001500 16001400 16001300 16001200
Liczba falowa [cm-1] Liczba falowa [cm-1]
Hydroksyapatyt (HA)
96
-Na widmie zsyntezowanego hydroksyapatytu widoczny jest wyraźny sygnał w zakresie liczby falowej 3550–3200 cm-1, który generowany jest przez drgania rozciągające grup hydroksylowych, natomiast sygnał z maksimum przy 1630 cm-1 związany jest z obecnością wody fizycznie zaadsorbowanej na powierzchni analizowanego materiału. Wyniki analizy FTIR wykazują także obecność pasm przy liczbach falowych: 1200, 1050 oraz 600 cm-1, które są charakterystyczne dla hydroksyapatytu i są następstwem występowania w jego strukturze drgań rozciągających grup fosforanowych PO43-. Podobnie, sygnał z maksimum przy 800 cm-1, przypisany jest do drgań jonów wodorofosforanowych (HPO42-) [361].
Na widmach FTIR układów po immobilizacji widoczne są dodatkowe pasma, których brak jest na widmie nośnika hydroksyapatytowego, a ich obecność jest pośrednim dowodem potwierdzającym skuteczne unieruchomienie białka katalitycznego. Są to pasma występujące przy liczbie falowej ok. 2900 cm-1, będące efektem obecności grup metylowych oraz metylenowych (–CH3 oraz –CH2) w strukturze enzymu. Sygnały potwierdzające immobilizację enzymu widoczne są także w zakresie 1700–1200 cm-1. Wśród nich warto odnotować pasmo z maksimum ok. 1650 cm-1, które pochodzi od drgań rozciągających wiązań C=C oraz pik przy 1400 cm-1, związany z obecnością wiązań –C–N w strukturze białka [362,363]. Widma FTIR układów po immobilizacji charakteryzują się również obecnością sygnałów przy liczbie falowej 700 oraz 490 cm-1, które pochodzą od drgań zginających oraz pozapłaszczyznowych wiązań węgiel-wodór budujących szkielet enzymu [364].
Warty odnotowania jest również fakt, że w przypadku widm produktów po immobilizacji zauważalny jest wzrost intensywności pasm, a także nieznaczne przesunięcia maksimów sygnałów w zakresie 1200–1000 cm-1, w porównaniu z widmem samego nośnika. Fakt ten tłumaczony jest obecnością w strukturze białka enzymatycznego wiązań –C–O oraz –C–O–C–, których maksima znajdują się odpowiednio przy ok. 1150 oraz 1050 cm-1. Podobne obserwacje dotyczą zwiększenia intensywności sygnału powyżej 3000 cm-1, związanego z obecnością grup hydroksylowych w białku oraz nośniku.
Obecność opisanych wyżej sygnałów, a także wzrost ich intensywności, jak i przesunięcia maksimów absorpcji to dowody dodatkowo potwierdzające skuteczne unieruchomienie proteazy na powierzchni hydroksyapatytu.
8.2. Analiza elementarna – ocena składu pierwiastkowego analizowanych materiałów
W celu potwierdzenia efektywnego osadzenia enzymu wykonano także analizę elementarną.
Określono zmiany zawartości takich pierwiastków jak węgiel, azot oraz wodór w próbkach po immobilizacji, w porównaniu ze składem elementarnym hydroksyapatytu. Zmiany te są następstwem różnego czasu prowadzenia procesu, jak i zmiennych stężeń początkowych roztworów białka. Rezultaty otrzymane dla wybranych próbek, zaprezentowano w tabeli 6.
Otrzymany w pierwszym etapie prac hydroksyapatyt charakteryzuje się zawartością węgla oraz wodoru na poziomie odpowiednio 0,22 oraz 1,07%, a także brakiem azotu w składzie pierwiastkowym.
97
-Zastosowana proteaza odznacza się natomiast zawartością w składzie pierwiastkowym 9,87% azotu, 38,45% węgla oraz 6,24% wodoru. Uzyskane rezultaty badań wykazały przyrost zawartości wszystkich analizowanych pierwiastków w układach po immobilizacji oraz obecność azotu. Zwiększenie procentowego udziału tych składników jest dowodem potwierdzającym skuteczną immobilizację enzymu ponieważ zarówno węgiel, azot, jak i wodór są podstawowymi pierwiastkami tworzącymi strukturę białkową proteazy [365].
Tabela 6. Wyniki analizy elementarnej zsyntezowanego hydroksyapatytu, proteazy z Aspergillu oryzae oraz wybranych układów powstałych po immobilizacji
Stężenie roztworu enzymu [mg/ml]
Czas immobilizacji [h]
Zawartość [%]
N C H
Hydroksyapatyt – 0,22 1,07
Proteaza z Aspergillu oryzae 9,87 38,45 6,24
3
1 0,10 0,32 1,13
24 0,11 0,33 1,14
96 0,11 0,34 1,14
5
1 0,10 0,37 1,14
24 0,12 0,38 1,15
96 0,12 0,39 1,15
7
1 0,12 0,41 1,16
24 0,13 0,44 1,19
96 0,13 0,44 1,19
Uzyskane rezultaty udowadniają nie tylko efektywne unieruchomienie proteazy, ale wskazują również, że czas immobilizacji oraz początkowe stężenie roztworu enzymu mają wpływ na ilość osadzonego białka katalitycznego. Najbardziej wyraźny wzrost procentowej zawartości wszystkich analizowanych pierwiastków został odnotowany w przypadku immobilizacji prowadzonej przez 96 h z roztworu enzymu o stężeniu 7 mg/ml. Zbliżone rezultaty analizy elementarnej uzyskano także dla układów powstałych po 24 h prowadzenia procesu, co może wskazywać, że w przypadku tych układów (powstałych po 24 oraz 96 h prowadzenie procesu), unieruchomieniu uległa największa ilość proteazy.
8.3. Analiza parametrów struktury porowatej
W kolejnym etapie badań zdefiniowano parametry struktury porowatej hydroksyapatytu oraz produktów po immobilizacji, w celu określenia wpływu czasu trwania procesu immobilizacji i początkowego stężenia roztworu białka na wielkość powierzchni właściwej, średnią średnicę porów, jak i ich całkowitą objętość. Uzyskane rezultaty przeprowadzonych analiz przedstawiono w tabeli 7.
98
-Zestawione dane eksperymentalne korespondują z wnioskami wyciągniętymi z wyników analizy elementarnej i wskazują, że czas immobilizacji oraz początkowe stężenie roztworu enzymu wpływają na obniżenie wartości wszystkich badanych parametrów struktury porowatej.
Hydroksyapatyt charakteryzuje się powierzchnią właściwą wynoszącą 26 m2/g, a także porami o średnicy 2,7 nm oraz objętości 0,018 cm3/g. Konsekwencją przeprowadzenia immobilizacji enzymu jest obniżenie wartości badanych parametrów struktury porowatej nośnika. Im dłuższy jest czas trwania procesu oraz większe stężenie roztworu białka, tym zmiany w wartościach poszczególnych parametrów są bardziej widoczne. Zmniejszenie wielkości powierzchni właściwej związane jest z unieruchomieniem proteazy bezpośrednio na powierzchni nośnika, natomiast zmniejszenie średnicy porów oraz spadek ich objętości są konsekwencją osadzenia białka we wnętrzu porów. Największe zmiany wartości poszczególnych parametrów zostały odnotowane dla układu po immobilizacji prowadzonej przez 96 h, z roztworu enzymu o stężenie 7 mg/ml. W tym przypadku dochodzi do ponad dwukrotnego zmniejszenia powierzchni właściwej (do 11 m2/g) oraz średnicy porów (do 1,3 nm) oraz ponad trzykrotnego obniżenia objętości porów, z wartości 0,018 cm3/g w przypadku hydroksyapatytu przed immobilizacją, do wartości 0,005 cm3/g dla matrycy z naniesioną proteazą. Należy jednak podkreślić, że zmiany wartości poszczególnych parametrów w przypadku 24 oraz 96-godzinnego trwania procesu, bez względu na początkowe stężenie enzymu, nie są duże, co wskazuje, że okres 24 h jest najbardziej optymalnym czasem dla prowadzenia immobilizacji proteazy na powierzchni hydroksyapatytu.
Tabela 7. Parametry struktury porowatej hydroksyapatytu oraz układów powstałych po immobilizacji proteazy Stężenie roztworu
Zmiany parametrów struktury porowatej, w tym zmniejszenie wielkości powierzchni właściwej, a także obniżenie wartości średniej średnicy porów oraz ich objętości są pośrednim dowodem potwierdzającym skuteczność przeprowadzonej immobilizacji [148].
99
-8.4. Określenie ilości unieruchomionego enzymu
W celu potwierdzenia wyciągniętych wcześniej wniosków podjęto próbę określenia ilości proteazy unieruchomionej na powierzchni hydroksyapatytu wykorzystując do tego metodę Bradford. W tabeli 8 przedstawiono wpływ czasu prowadzenia procesu oraz stężenia początkowego roztworu enzymu na ilość zimmobilizowanego białka we wszystkich wytworzonych preparatach enzymatycznych.
Na podstawie analizy danych zamieszczonych w tabeli 8 wykazano, że wraz z wydłużeniem czasu immobilizacji oraz zwiększeniem stężenia roztworu białka, z którego prowadzony jest proces, odnotowywany jest wzrost ilości unieruchomionego enzymu. Najwięcej enzymu, 132 mg białka na 1 g hydroksyapatytu zostało naniesione po 24 oraz 96 h immobilizacji realizowanej z roztworu o stężeniu 7 mg/ml.
Tabela 8. Ilość proteazy unieruchomionej na powierzchni hydroksyapatytu
Czas immobilizacji
Stężenie roztworu enzymu [mg/ml]
3 5 7
Ilość zimmobilizowanego enzymu [mg/g]
1 min 52 70 76
5 min 53 73 96
10 min 58 75 108
30 min 59 78 115
1 h 60 80 118
2 h 63 82 123
24 h 67 91 132
96 h 68 91 132
Co więcej, przedstawione dane wskazują, że proces adsorpcji białka najbardziej dynamicznie przebiega w początkowym okresie (do 60 min), gdy ilość miejsc aktywnych na powierzchni nośnika jest największa. Następnie obserwowany jest znacznie wolniejszy przyrost ilości unieruchomionego enzymu, a w przypadku 24 oraz 96 h trwania procesu, nie następuje wzrost ilości adsorbowanego białka co wskazuje, że czas 24 h jest bardziej korzystnym do prowadzenia immobilizacji proteazy na powierzchni hydroksyapatytu, ze względu na większą ekonomikę realizowanego procesu..
8.5. Wydajność procesu immobilizacji proteazy z Aspergillus oryzae
W oparciu o dane zaprezentowane w tabeli 8 oraz równanie 2 (rozdział 6.11) obliczono wydajność procesu immobilizacji proteazy na powierzchni hydroksyapatytu, a otrzymane dane zaprezentowano w tabeli 9.
Uzyskane dane wskazują, że ilość unieruchomionego enzymu nie jest bezpośrednio związana z wydajnością immobilizacji. Najwyższe wydajności przeprowadzonego procesu odnotowano dla roztworu
100
-enzymu o stężeniu początkowym 3 mg/ml, niezależnie od czasu jego trwania, natomiast wraz ze wzrostem początkowego stężenia biokatalizatora wydajność procesu maleje. Z kolei wydłużenie czasu unieruchamiania proteazy powoduje wzrost wydajności procesu. Należy również podkreślić, że dla każdego z wykorzystanych roztworów, po zaledwie jednej minucie procesu, jego wydajność przekracza ponad połowę maksymalnej wartości, co wskazuje, że ponad połowa z całej ilości zimmobilizowanego enzymu zostaje zaadsorbowana w pierwszym etapie procesu. Ta prawidłowość może zostać wytłumaczona przez fakt, że ze względu na relatywnie wysokie stężenie białka w roztworze większość miejsc aktywnych na powierzchni hydroksyapatytu zostaje wysycona już w początkowym etapie immobilizacji.
Tabela 9. Wydajność procesu immobilizacji proteazy na powierzchni hydroksyapatytu
Czas immobilizacji
Stężenie roztworu enzymu [mg/ml]
3 5 7
Wydajność immobilizacji [%]
1 min 57,8 46,7 36,2
5 min 58,9 48,7 45,7
10 min 64,4 50,0 51,4
30 min 65,6 52,0 54,8
1 h 66,7 53,3 56,2
2 h 70,0 54,7 58,6
24 h 74,4 60,7 62,9
96 h 75,6 60,8 63,0
Najwyższą wydajność immobilizacji, ponad 75%, odnotowano po 96-godzinnej immobilizacji prowadzonej z roztworu o stężeniu 3 mg/ml, a najniższą, nieco ponad 60%, dla roztworu białka o stężeniu 5 mg/ml. Warto jednak zauważyć, że podobnie jak w przypadku wcześniejszych analiz, nie zaobserwowano znaczących różnic pomiędzy wydajnościami procesu realizowanego w czasie 24 i 96 h.
Najwyższa wydajność immobilizacji została zaobserwowana dla roztworu proteazy o stężeniu 3 mg/ml, co jest wynikiem obecności na powierzchni hydroksyapatytu takiej ilości centrów adsorpcyjnych, które umożliwiają najbardziej wydajne osadzenie białka. Natomiast w przypadku stężenia 7 mg/ml, wydajność unieruchamiania jest o ponad 10% niższa, niż dla roztworu o stężeniu 3 mg/ml, ze względu na wysycenie dostępnych miejsc adsorpcyjnych na powierzchni nośnika.
Dla porównania, wydajność immobilizacji proteazy pozyskanej ze szczepu Bacillus, która została fizycznie związana z krzemionkowymi mikrosferami, wynosi poniżej 45% [366]. Z kolei syntetycznie otrzymany hydroksyapatyt, który posłużył jako nośnik dla lipazy z Candida rugosa umożliwił osadzenie tego enzymu z wydajnością przekraczającą 95%, co potwierdza duży potencjał tego materiału jako nośnika w procesie immobilizacji [367].
101