Ocena ilości unieruchomionej CALB na powierzchni szkieletu gąbki morskiej

CEL I ZAKRES PRACY

14.3. Ocena ilości unieruchomionej CALB na powierzchni szkieletu gąbki morskiej

W celu określenia wpływu temperatury, pH, czasu immobilizacji oraz początkowego stężenia roztworu enzymu na ilość unieruchomionego białka wykorzystano metodę Bradford i na podstawie dalszych obliczeń zdefiniowano ilość osadzonego biokatalizatora w mg na 1 g nośnika, a uzyskane rezultaty zostały zaprezentowane w tabeli 23.

Tabela 23. Wpływ poszczególnych parametrów procesu immobilizacji lipazy typu B z Candida antarctica na ilość enzymu unieruchomionego na powierzchni szkieletu gąbki Hippospongia communis

Czas immobilizacji Temperatura [°C] Ilość unieruchomionego enzymu [mg/g]

Stężenie roztworu enzymu

1 mg/ml 3 mg/ml

5 6 7 8 9 5 6 7 8 9

1 h

4 18,56 18,13 16,47 15,21 14,62 34,04 33,30 30,18 27,60 26,86 20 17,93 17,86 14,98 13,18 12,81 32,94 32,75 27,42 24,10 23,55 50 17,42 14,62 13,7 12,65 12,14 32,02 26,86 25,21 23,18 22,26

2 h

4 28,36 27,58 24,82 22,14 20,72 52,07 50,60 45,63 40,66 38,09 20 27,29 26,49 19,63 18,95 18,16 50,78 48,58 36,06 34,78 33,30 50 27,29 24,81 18,95 15,74 14,93 50,05 45,63 34,78 28,89 27,42

Analizując rezultaty przedstawione w tabeli 23 należy jednoznacznie wywnioskować, że każdy z parametrów ma wpływ na ilość lipazy unieruchomionej na powierzchni szkieletu gąbki Hippospongia communis. Większe początkowe stężenie enzymu oraz wydłużenie czasu immobilizacji pozwalają na unieruchomienie większych ilości CALB, niezależnie od pH roztworu oraz temperatury, w której prowadzony jest proces. Dla przykładu, gdy immobilizacja jest prowadzona przez 120 min w 4 °C z roztworu białka o stężeniu 1 mg/ml unieruchomieniu ulega 28,36 mg lipazy, a stosując stężenie 3 mg/ml osadzone zostaje 52,07 mg enzymu na 1 g nośnika.

W trakcie przeprowadzonych badań zdefiniowano także wpływ temperatury, w jakiej prowadzona była immobilizacja, na ilość unieruchomionej lipazy. Porównując te same czasy immobilizacji, niezależnie od początkowej ilości białka w roztworze, największe ilości biokatalizatora zostały osadzone w temperaturze 4 °C. Niższa temperatura prowadzonego procesu zapewnia wyższą stabilność cząsteczek enzymu, a jednocześnie powoduje, że powstałe oddziaływania charakteryzują się mniejszą energią, co zwiększa ich trwałość oraz stabilność i umożliwia przyłączenie większej ilości lipazy.

Celem przeprowadzonych badań było również określenie wpływu pH roztworu lipazy, z którego prowadzono immobilizację na ilość unieruchomionego białka. Zaprezentowane dane wskazują, że immobilizacja największych ilości biokatalizatora, ponad 52 mg/g, możliwa jest z roztworu o pH 5, a zwiększanie zasadowości środowiska przekłada się na zmniejszenie ilości osadzonego białka,

157

-niezależnie od początkowej ilości enzymu oraz temperatury procesu. Tendencja ta jest wywołana przez fakt, że w środowisku lekko kwaśnym większa ilość grup funkcyjnych znajdujących się na powierzchni nośnika ulega protonowaniu, przez co zmienia się ich ładunek i zwiększa powinowactwo do ujemnie naładowanych cząsteczek biokatalizatora.

14.4. Aktywność katalityczna oraz stabilność układów po immobilizacji CALB

Jak wspomniano już we wcześniejszych rozdziałach niniejszej dysertacji, aktywność katalityczna zachowana przez unieruchomiony enzym to najważniejszy parametr determinujący jego potencjalne zastosowanie. Dlatego też w trakcie zrealizowanych prac zdefiniowano wpływ poszczególnych, początkowych warunków procesu na właściwości katalityczne powstałych układów immobilizowanych enzymów, a uzyskane rezultaty zostały zaprezentowane na rys. 62.

Rys. 62. Aktywność katalityczna lipazy typu B z Candida antarctica unieruchomionej na powierzchni szkieletu gąbki Hippospongia communis w zależności od temperatury oraz czasu immobilizacji.

Proces prowadzono w pH=7 z roztworu enzymu o stężeniu: a) 1 mg/ml oraz b) 3 mg/ml

158

-Zachowanie największej aktywności katalitycznej przez unieruchomioną lipazę obserwuje się, kiedy proces prowadzony jest w temperaturze 4 °C, niezależnie od czasu jego trwania oraz stężenia roztworu biokatalizatora. Jest to optymalna temperatura do przechowywania enzymu, a zatem w tych warunkach struktura białkowa pozostaje najbardziej stabilna. Podwyższenie temperatury wywołuje spadek właściwości hydrolitycznych unieruchomionej CALB, co jest najprawdopodobniej spowodowane częściową denaturacją termiczną enzymu, która ma miejsce podczas immobilizacji.

Wraz z wydłużaniem czasu immobilizacji obserwowane są wyższe wartości zachowanej aktywności, z wyjątkiem układu powstałego po 120 min immobilizacji z roztworu białka o stężeniu 3 mg/ml.

Jest to zjawisko analogiczne z obserwowanym dla innych nośników, które jest efektem nagromadzenia zbyt dużych ilości cząsteczek biokatalizatora, co w konsekwencji prowadzi do powstania zawady przestrzennej i wystąpienia oporów dyfuzyjnych ograniczających wydajność przemiany katalitycznej.

Niemniej jednak zastosowanie roztworu zawierającego więcej białka pozwala na immobilizację większych ilości enzymu, co bezpośrednio przekłada się na zachowanie wyższej aktywności przez powstałe układy. Systemy biokatalityczne powstałe z zastosowaniem roztworu lipazy o stężeniu 3 mg/ml odznaczają się zachowaniem o ponad 20% większej aktywności niż produkty wytworzone z wykorzystaniem roztworu zawierającego 1 mg/ml białka, w tych samych warunkach procesowych.

Zachowaniem najwyższej aktywności hydrolitycznej, około 90%, odznacza się produkt po immobilizacji prowadzonej w temperaturze 4 °C przez 60 min z wykorzystaniem roztworu białka o stężeniu 3 mg/ml. Ze względu na to, układ ten został wybrany do dalszych analiz związanych z określeniem wpływu poszczególnych parametrów reakcyjnych na zmiany jego właściwości katalitycznych.

Wpływ pH oraz temperatury na zmiany aktywności wolnej oraz unieruchomionej lipazy z Candida antarctica badano w zakresie pH od 3 do 11 oraz temperatury od 10 do 80 °C. Uzyskane rezultaty zaprezentowano na rys. 63.

Zmiany optymalnych warunków, dla najwyższej aktywności katalitycznej są wyraźnie zauważalne w przypadku pH. Natywna lipaza wykazuje maksimum swoich właściwości w pH=7, a unieruchomiona w pH=8. Należy również podkreślić, że zimmobilizowane białko wykazuje ponad 90% swoich właściwości hydrolitycznych w zakresie pH od 6 do 9, podczas gdy w przypadku wolnej formy enzymu, nawet nieznaczne zmiany wartości pH środowiska reakcji wywołują gwałtowne obniżenie aktywności.

Optymalna temperatura, w której wolny i unieruchomiony enzym wykazują najwyższą aktywność to odpowiednio 30 i 40 °C. Natomiast natywna forma lipazy wykazuje ponad 80% aktywności w 30 i 40 °C, to w przypadku immobilizowanego białka, zakres temperatur jest dużo szerszy i mieści się w granicach od 30 do 60 °C.

Poprawa odporności na działanie pH oraz temperatury jest wynikiem powstania oddziaływań pomiędzy enzymem a nośnikiem, które stabilizują cząsteczkę białka i chronią ją przed denaturacją wywołaną niekorzystnymi warunkami reakcji. Usztywniona zostaje cała cząsteczka enzymu, co powoduje,

159

-że trzecio- i czwartorzędowa struktura białka są bardziej odporne na zachodzenie w nich zmian konformacyjnych [385,389].

Rys. 63. Wpływ: a) pH oraz b) temperatury na aktywność katalityczną wolnej oraz unieruchomionej na powierzchni szkieletu gąbki Hippospongia communis lipazy typu B z Candida antarctica

Ze względu na możliwość wykorzystania powstałych układów biokatalitycznych w procesach przemysłowych koniecznym było określenie wpływu ilości następujących po sobie cykli reakcyjnych oraz czasu magazynowania na zmiany aktywności hydrolitycznej wolnego oraz unieruchomionego białka.

Uzyskane rezultaty zaprezentowano na rys. 64.

Ze względu na fakt, że wolna forma białka jest rozpuszczalna w środowisku reakcji, nie może zostać wykorzystana więcej niż jeden raz. Lipaza unieruchomiona na gąbce Hippospongia communis utrzymuje dobre właściwości katalityczne, bowiem zachowuje ponad 80% swojej początkowej aktywności nawet po przeprowadzeniu 20 cykli reakcyjnych. Fakt ten może zostać wytłumaczony poprzez wytworzenie wspomnianych już wcześniej, silnych oddziaływań enzym-nośnik co utrudnia wymycie lipazy z powierzchni gąbki i dodatkowo stabilizuje strukturę białkową [383]. Co więcej, wytworzenie mocnych

0 20 40 60 80 100

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Aktywność katalityczna [%]

pH Wolna lipaza

Immobilizowana lipaza

0 20 40 60 80 100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

AKtywność katalityczna [%]

Temperatura [°C]

Wolna lipaza

Immobilizowana lipaza b)

160

-oddziaływań ułatwia także oddzielenie systemu biokatalitycznego od mieszaniny reakcyjnej poprzez klasyczne odwirowanie.

Rys. 64. Wpływ: a) ilości cykli katalitycznych oraz b) temperatury i czasu magazynowania na aktywność katalityczną wolnej oraz unieruchomionej na powierzchni szkieletu gąbki Hippospongia communis

lipazy typu B z Candida antarctica

Natywne białko jest niestabilne w trakcie przechowywania w temperaturze 20 °C w roztworze buforowym i bardzo szybko traci swoją aktywność. Po 20 dniach magazynowania w tych warunkach zachowuje tylko 30% początkowej aktywności. Immobilizacja w znaczący sposób podnosi stabilność lipazy typu B z Candida antarctica. Niezależnie od temperatury przechowywania, enzym związany z nośnikiem zachowuje ponad 80% początkowych właściwości hydrolitycznych po 20 dniach. Fakt ten może zostać wyjaśniony poprzez ochronny wpływ szkieletu gąbki morskiej, który zabezpiecza białko przed zmianami zachodzącymi w jego strukturze w trakcie magazynowania [455].

70 75 80 85 90 95 100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Aktywność katalityczna [%]

Cykle katalityczne Immobilizowana lipaza

0 20 40 60 80 100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Aktywność katalityczna [%]

Dni Immobilizowana lipaza w 4 °C Immobilizowana lipaza w 20 °C Wolna lipaza w 4 °C

Wolna lipaza w 20 °C b)

161

-14.5. Testy aplikacyjne układów po immobilizacji – reakcja transestryfikacji oleju rzepakowego z metanolem

W celu potwierdzenia możliwości praktycznego wykorzystania lipazy unieruchomionej na powierzchni gąbki morskiej, powstałe układy enzymatyczne wykorzystano w procesie transestryfikacji oleju rzepakowego z metanolem. W tabeli 24 oraz na rys. 65 przedstawiono uzyskane rezultaty, dzięki którym zobrazowano wpływ poszczególnych warunków procesu metanolizy na zawartość trójglicerydów (TG), estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) oraz glicerolu, a także na konwersję trójglicerydów zawartych w oleju rzepakowym. W procesie wykorzystano system biokatalityczny charakteryzujący się najwyższą aktywnością, a więc powstały po immobilizacji prowadzonej w temperaturze 4 °C przez 60 min z wykorzystaniem roztworu białka o stężeniu 3 mg/ml.

Tabela 24. Wpływ temperatury, pH, czasu oraz stosunku objętościowego oleju do metanolu (Vo:Vm) na proces transestryfikacji oleju rzepakowego z metanolem prowadzonego z wykorzystaniem

immobilizowanej na gąbce Hippospongia communis lipazy typu B z Candida antarctica oraz na skład mieszaniny poreakcyjnej

Najbardziej znaczącymi parametremi wpływającymi na konwersję trójglicerydów są temperatura oraz stosunek objętościowy oleju do metanolu (Vo:Vm). Całkowita przemiana zawartych trójglicerydów do FAME nastąpiła kiedy reakcję prowadzono w 40 °C, w pH=10, przy stosunku objętościowym oleju do metanolu 2:1, a proces prowadzono przez 24 h. Zmiana stosunku objętościowego oleju do metanolu na

162

5:1, przy zachowaniu pozostałych parametrów, powoduje wyraźne obniżenie wydajności konwersji (do ok. 65%), natomiast zmiana pH z 10 na 7 obniża wydajność do około 3%. Najwyższą konwersję substratów obserwowano w temperaturze 40 °C, co jest bezpośrednio związane z maksymalną aktywnością, którą immobilizowany enzym wykazuje również w 40 °C (rys. 63b).

Podobne obserwacje zostały poczynione przez Calero i współpracowników, którzy najwyższą konwersję trójglicerydów zawartych w oliwie z oliwek z wykorzystaniem lipazy immobilizowanej na żywicy jonowymiennej odnotowali w temperaturze 40 °C [456]. Wyniki innych badań, opisujące transestryfikację prowadzoną z udziałem etanolu, wskazują, że optimum temperaturowe tego procesu to 20 °C, jednak są to wartości dla katalizatora będącego wolną formą białka [457].

W ramach przeprowadzonych badań obliczono także stężenie estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) w wybranych próbkach. Otrzymane wyniki zaprezentowano na rys. 65 i porównano z otrzymanymi dla próbek, które uzyskano prowadząc proces w zróżnicowanych warunkach.

Największe stężenie FAME, ponad 900 mg/ml, odnotowano dla próbki, w której doszło do całkowitej konwersji trójglicerydów (T=40 °C, pH=10, Vo:Vm=2:1 czas 24 h). Obniżenie temperatury reakcji do 20 °C skutkuje znaczącym obniżeniem stężenia FAME, które w tych warunkach wynosi 290 mg/ml.

W przypadku, kiedy proces transestryfikacji prowadzony jest przez godzinę, zmiana temperatury oraz stosunku objętościowego oleju do metanolu nie ma większego wpływu na wydajność reakcji, a dopiero podniesienie pH z 7 do 10 skutkuje znacznym zwiększeniem stężenia FAME w analizowanych próbkach.

Podobne badania zostały wykonane przez Dizge i Keskinlera, którzy przeprowadzili transestryfikację oleju rzepakowego z metanolem. Uzyskano wysokie stężenie FAME, jednak przy zastosowaniu stosunkowo dużego, bo wynoszącego 6:1, stosunku objętościowego metanolu do oleju [458].

Przeprowadzone badania udowadniają, że lipaza typu B z Candida antarctica unieruchomiona na powierzchni szkieletu gąbki morskiej z gatunku Hippospongia communis, może pełnić rolę efektywnego

20 °C 40 °C

Rys. 65. Zawartość estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) w próbkach po reakcji transestryfikacji prowadzonej w różnych warunkach (pH, czas, stosunek Vo:Vm)

163

-biokatalizatora reakcji transestryfikacji oleju rzepakowego z metanolem. Powstały system biokatalityczny umożliwia konwersję trójglicerydów do FAME, z wysokimi wydajnościami, i może zostać wykorzystany w przemysłowych procesach produkcji biodiesla.

164

-P ODSUMOWANIE

Celem niniejszej rozprawy doktorskiej było przeprowadzenie procesu immobilizacji proteazy z Aspergillus oryzae, jak i lipaz: Amano Lipase A z Aspergillus niger, lipazy typu B z Candida antarctica oraz lipazy z Aspergillus niger na powierzchni hydroksyapatytu, krzemionki, materiałów kompozytowych krzemionka-lignina i chityna-lignina, a także zmodyfikowanej chityny i gąbek: Luffa cylindrica oraz Hippospongia communis. W toku badań zdefiniowano właściwości katalityczne otrzymanych układów, scharakteryzowano wpływ początkowych warunków procesu na ich parametry, jak i określono zmiany aktywności hydrolitycznej wywołane przez temperaturę, pH, czas magazynowania oraz ilość następujących po sobie cykli reakcyjnych. Co więcej, możliwość praktycznego zastosowania wytworzonych układów zweryfikowano w oparciu o reakcję transestryfikacji oleju rzepakowego z metanolem.

W pierwszym etapie zrealizowanych badań wykorzystano materiał nieorganiczny – hydroksyapatyt i na jego powierzchni unieruchomiono proteazę z Aspergillus oryzae. Wyniki analizy elementarnej, parametry struktury porowatej oraz FTIR potwierdziły skuteczne osadzenie białka.

W oparciu o powyższe rezultaty, a także dane uzyskane dzięki metodzie Bradford zdefiniowano wpływ czasu trwania immobilizacji oraz początkowego stężenia roztworu enzymu na ilość unieruchomionego biokatalizatora. Stwierdzono, że najwięcej enzymu zostaje osadzone gdy immobilizacja realizowana jest przez 96 h z roztworu o stężeniu 7 mg/ml, jednak biorąc pod uwagę aspekt ekonomiczny, jako najbardziej korzystny czas immobilizacji wytypowano 24 h, ze względu na fakt, że zaadsorbowana zostaje zbliżona ilość białka co w przypadku 96-godzinnego procesu. Określono ponadto wydajność immobilizacji i wykazano, że osiągnięcie najwyższej, ponad 75-proc. wydajności umożliwia 96-godz. immobilizacja realizowana z wykorzystaniem roztworu zawierającego 3 mg enzymu na 1 ml buforu.

Kolejny etap zrealizowanych badań związany był z wykorzystaniem innego nośnika pochodzenia nieorganicznego – krzemionki typu zol-żel, na powierzchni której zimmobilizowano Amano Lipase A z Aspergillus niger. Zastosowanie spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera umożliwiło zweryfikowanie efektywnego naniesienia białka na powierzchnię materiału krzemionkowego, a zarazem potwierdziło, że zaproponowana technika immobilizacji lipazy jest skuteczna. Dokonano także oceny wpływu warunków procesu (czas, stężenie enzymu) na parametry struktury porowatej nośnika oraz ilość unieruchomionego enzymu. Wykazano, że największe zmiany obu parametrów zachodzą po procesie realizowanym przez 96 h z wykorzystaniem roztworu lipazy o stężeniu 7 mg/ml. Co więcej, potencjał dzeta układów otrzymanych po immobilizacji przyjmuje wartości poniżej -30 mV w środowisku zasadowym, co wskazuje, że w tych warunkach są one stabilne elektrokinetycznie.

W następnej części pracy uwagę zwrócono na materiały kompozytowe typu krzemionka-lignina oraz chityna-lignina, które wykorzystano do unieruchomienia odpowiednio lipazy typu B z Candida antarctica (CALB) oraz lipazy z Aspergillus niger (LAN). Warto zaznaczyć, że tego rodzaju materiały, jako nośniki enzymów, nie były uprzednio opisane w literaturze przedmiotu.

165

-Wyniki badań uzyskane z zastosowaniem mikroskopii sił atomowych (AFM) potwierdziły skuteczne naniesienie CALB na powierzchnię matrycy krzemionka-lignina, a dodatkowo umożliwiły ocenę zmian morfologii nośnika wywołanych przeprowadzeniem procesu immobilizacji. Rezultaty metod spektroskopowych (FTIR i XPS), dowiodły obecności charakterystycznych grup funkcyjnych oraz zmian w składzie powierzchniowym układów przed i po immobilizacji, co dodatkowo potwierdziło efektywne unieruchomienie lipazy. Należy również wspomnieć, że dzięki wykonanym analizom oraz ich wynikom możliwym było podjęcie próby zdefiniowania mechanizmu interakcji pomiędzy matrycą i białkiem, który w omawianym przypadku oparty jest na oddziaływaniach wodorowych.

Rezultaty węglowego magnetycznego rezonansu jądrowego (¹³C CP MAS NMR), zmiany w procentowej zawartości węgla, azotu oraz tlenu w próbkach przed i po immobilizacji oraz linie widm XPS poszczególnych pierwiastków potwierdzają efektywne naniesienie lipazy z Aspergillus niger na powierzchnię materiału chityna-lignina. Dzięki wynikom otrzymanym z wykorzystaniem metody Bradford ocenie poddano także wpływ czasu i stężenia lipazy na ilość unieruchomionego białka. Stwierdzono, że im dłuższy jest czas prowadzenia procesu i wyższa początkowa zawartość LAN w buforze, tym więcej biokatalizatora może zostać unieruchomione. Największa ilość lipazy (20,3 mg/g) zostaje osadzona po procesie trwającym 96 h z roztworu LAN o stężeniu 3 mg/ml. W trakcie przeprowadzonych analiz scharakteryzowano także właściwości elektrokinetyczne powstałych systemów biokatalitycznych w zakresie pH od 2 do 12. Uzyskane wartości potencjału dzeta, przebieg krzywych elektrokinetycznych, a także wyniki ¹³C NMR oraz XPS sugerują adsorpcyjny charakter powstałych połączeń i wskazują na dominujący udział oddziaływań wodorowych.

W ramach zrealizowanych prac wykorzystano także chitynę, której powierzchnię sfunkcjonalizowano związkami z grupy poliedrycznych oligomerycznych silseskwioksanów: Methacryl POSS cage mixture (MPOSS) oraz Vinyl POSS cage mixture (VPOSS) w celu zwiększenia powinowactwa do enzymów. Wyniki spektroskopii Ramana dowiodły efektywnej funkcjonalizacji powierzchni biopolimeru, a rezultaty analizy termograwimetrycznej wykazały, że wytworzone materiały charakteryzują się zwiększoną odpornością na działanie temperatury, w porównaniu z niemodyfikowaną chityną. W oparciu o otrzymane widma FTIR układów po immobilizacji potwierdzono skuteczne naniesienie lipazy typu B z Candida antarctica. Uzyskane dane wskazują także, że większość cząsteczek biokatalizatora charakteryzuje wyższe powinowactwo do grup funkcyjnych zawartych w strukturze związku modyfikującego, co powoduje przyłączenie białka bezpośrednio do związku typu POSS, a nie do powierzchni chityny. Dowodzi to również zasadności przeprowadzonej modyfikacji chityny.

Przeprowadzono również ocenę możliwości wykorzystania nośników organicznych pochodzenia roślinnego. W tym celu wykorzystano gąbkę Luffa cylindrica. W oparciu o zdjęcia SEM gąbki przed i po immobilizacji lipazy z Aspergillus niger scharakteryzowano morfologię nośnika oraz jej zmiany w wyniku przeprowadzonego procesu. Otrzymane zdjęcia, wraz z wynikami analiz FTIR oraz elementarnej stanowią niepodważalny dowód wskazujący na skuteczne naniesienie enzymu na powierzchnię nośnika.

Dodatkowo zmiany zawartości węgla oraz azotu w powstałych układach pośrednio potwierdzają, że czas

166

-procesu oraz początkowa zawartość enzymu mają przełożenie na ilość unieruchomionego biokatalizatora.

Zdefiniowano także parametry kinetyczne wolnej lipazy z Aspergillus niger oraz preparatu po jej unieruchomieniu na powierzchni gąbki roślinnej (stała Michaelisa-Menten (Km), maksymalna szybkość reakcji (Vmax)). Ponad dwukrotnie większa wartość stałej Km preparatu po immobilizacji wskazuje na zmniejszenie powinowactwa biokatalizatora do substratów reakcji, a jednocześnie powoduje obniżenie wartości Vmax, z 7,19 U/mg dla wolnej LAN do 4,98 U/mg dla unieruchomionego białka.

Następny etap prac polegał na wykorzystaniu szkieletu gąbki morskiej z gatunku Hippospongia communis do immobilizacji lipazy typu B z Candida antarctica (CALB). W oparciu o analizę zdjęć z mikroskopu optycznego oraz skaningowego określono budowę nośnika, jak i potwierdzono skuteczne unieruchomienie CALB poprzez obecność agregatów enzymu na powierzchni nośnika. Kolejnym dowodem potwierdzającym efektywność zastosowanej techniki immobilizacji są wyniki analizy XPS, wskazujące na istotne zmiany w zawartości węgla, azotu i tlenu w badanych układach katalitycznych. Co więcej, przesunięcia maksimów energii wiązań poszczególnych linii widm XPS dostarczają dodatkowych informacji na temat powstałych oddziaływań i wskazują, że mają one charakter adsorpcyjny. W trakcie badań wnikliwie przeanalizowano wpływ początkowych warunków procesu immobilizacji na ilość osadzonej CALB i wykazano, że najwięcej enzymu, ponad 52 mg na 1 g nośnika unieruchomiono po procesie realizowanym przez 2 h, z roztworu białka o pH=5, stężeniu 3 mg/ml i w temperaturze 4 °C. To właśnie te warunki umożliwiają aktywację powierzchniowych grup funkcyjnych nośnika, jak i zapewniają najwyższą stabilność białka.

Kluczowym etapem badań zrealizowanych w ramach przedkładanej dysertacji była ocena właściwości katalitycznych zachowanych przez unieruchomione enzymy. Scharakteryzowano i w szerokim zakresie przeanalizowano wpływ czasu procesu (od 1 do 96 h), a także początkowego stężenia białka w roztworze buforowym (od 0,5 do 7 mg/ml) na zachowanie aktywności katalitycznej. W tabeli 25 zestawiono i zaprezentowano otrzymane rezultaty oraz parametry, w których wytworzono poszczególne systemy białkowe.

Tabela 25. Maksymalna aktywność katalityczna zachowana przez wytworzone preparaty po immobilizacji oraz warunki, w których zostały otrzymane

167

-Uzyskane dane jednoznacznie potwierdzają zachowanie wysokiej aktywności katalitycznej przez wytworzone w trakcie badań układy unieruchomionych enzymów. Najlepszymi właściwościami charakteryzują się: Amano Lipase A z Aspergillus niger zimmobilizowana na krzemionce typu zol-żel, lipaza typu B z Candida antarctica unieruchomiona na powierzchni materiału krzemionka-lignina oraz lipaza z Aspergillus niger osadzona na gąbce roślinnej z gatunku Luffa cylindrica. Zachowują one odpowiednio 93,6, 92,4 oraz 84,7% aktywności niezwiązanego białka. W trakcie badań wykazano ponadto, że najdłuższy czas prowadzenia procesu potrzebny do uzyskania preparatów o wysokiej aktywności, 24 h, konieczny był podczas unieruchamiania CALB na powierzchni zmodyfikowanej MPOSSem chityny. Natomiast już po 1 h trwania immobilizacji, najlepsze właściwości wykazywała lipaza typu B osadzona na materiale krzemionka-lignina oraz szkielecie gąbki z gatunku Hippospongia communis. Uzyskane wyniki wskazują również, że zależnie od wykorzystanego nośnika konieczne było zastosowanie początkowych roztworów o różnej zawartości białka. Najmniejsze stężenie 1 mg/ml, umożliwiło zachowanie najwyższej aktywności przez lipazy unieruchomione na powierzchni materiału krzemionka-lignina oraz gąbki roślinnej. Lipazy unieruchomione na materiale chityna-lignina oraz szkielecie gąbki morskiej Hippospongia communis wykazują najlepsze właściwości katalityczne, gdy do ich przygotowania wykorzystano roztwory o stężeniu 3 mg/ml. Preparaty enzymatyczne powstałe w oparciu o niemodyfikowaną, jak i modyfikowaną chitynę, dla uzyskania najwyższej aktywności wymagają zastosowania roztworu białka o stężeniu 5 mg/ml oraz różnych czasów immobilizacji, odpowiednio 1 oraz 24 h. Najwyższe początkowe stężenie enzymu (7 mg/ml) konieczne było przy wykorzystaniu jako nośnika

W dokumencie Poznań 2017 (Stron 156-200)