CEL I ZAKRES PRACY
7. Ocena aktywności katalitycznej oraz stabilności preparatów immobilizowanych enzymów
Aktywność katalityczna zachowana przez preparaty po immobilizacji lipazy, jak i wpływ na nią takich parametrów jak: pH oraz temperatura katalizowanego procesu, to najważniejsze czynniki determinujące potencjalne wykorzystanie otrzymanych preparatów. Istotna jest również ocena, w jaki sposób ilość cykli katalitycznych oraz czas magazynowania wpływają na zmiany właściwości hydrolitycznych otrzymanych systemów enzymatycznych. W ramach niniejszej dysertacji zdefiniowano również parametry kinetyczne unieruchomionych enzymów. Natomiast możliwość aplikacyjnego zastosowania preparatów po immobilizacji potwierdzono z wykorzystaniem reakcji transestryfikacji oleju rzepakowego z metanolem.
7.1. Aktywność katalityczna preparatów po immobilizacji
Aktywność katalityczną zachowaną przez preparaty po immobilizacji lipazy zdefiniowano w oparciu o modelową reakcję hydrolizy palmitynianu para-nitrofenylu (p-NPP) do para-nitrofenolu (p-NP) oraz kwasu palmitynowego, której przebieg schematycznie zaprezentowano na rys. 24.
W ramach przeprowadzonych badań sporządzono dwa roztwory R1 oraz R2. Roztwór pierwszy stanowił 10 mM roztwór p-NPP w propan-2-olu, który powstał w skutek rozpuszczenia 0,38 g p-NPP (Sigma-Aldrich, USA) w 100 ml propan-2-olu (Chempur, Polska). Roztwór R2 powstał poprzez rozpuszczenie 0,44 g Triton X-100 (Sigma-Aldrich, USA) oraz 0,11 g gumy arabskiej (Sigma-Aldrich, USA) w 100 ml buforu fosforanowego o pH=7 (Sigma-Aldrich, USA). Oba roztwory zostały następnie zmieszane w stosunku objętościowym równym 1:9, tworząc mieszaninę reakcyjną.
91 -NO2
O C C15H31
O
H2O C15H31COOH
OH NO2
Lipaza
Rys. 24. Modelowa reakcja hydrolizy palmitynianu para-nitrofenylu do para-nitrofenolu oraz kwasu palmitynowego
W celu przeprowadzenia modelowej reakcji enzymatycznej odmierzono 3 ml mieszaniny reakcyjnej do kuwety kwarcowej i dodano 5 mg wolnego enzymu oraz odpowiednią ilość preparatu po immobilizacji zawierającego 5 mg unieruchomionego białka. Reakcję prowadzono przez 120 s w kuwecie kwarcowej w temperaturze 30 °C, mieszając z szybkością 1000 obr/min, stale rejestrując zmiany absorbancji przy długości fali λ=410 nm. Pomiary prowadzono w termostatowanej komorze spektrofotometru Jasco UV 750 (Jasco, Japonia). Dla każdej z analizowanych próbek pomiary wykonano trzykrotnie w celu minimalizacji błędów. Stężenie uwolnionego para-nitrofenolu zostało określone z wykorzystaniem standardowej krzywej kalibracyjnej sporządzonej dla roztworów p-NP o stałym stężeniu.
Zachowaną aktywność katalityczną preparatów (AR) obliczono w oparciu o równanie 3:
= · 100% (3)
gdzie: AI charakteryzuje aktywność unieruchomionego enzymu, A0 to aktywność białka w formie wolnej.
7.2. Stabilność preparatów po immobilizacji
W ramach zrealizowanych badań zdefiniowano wpływ pH, temperatury, ilości cykli reakcyjnych oraz czasu magazynowania na aktywność wolnego enzymu oraz preparatów po immobilizacji lipazy.
W tym celu wykorzystano modelową reakcję hydrolizy p-NPP do p-NP, a do badań wybrano preparaty odznaczające się zachowaniem najwyższej aktywności katalitycznej. W każdym z przypadków pomiary spektrofotometryczne realizowano przy długości fali λ=410 nm, a wszystkie analizy wykonano w trzech powtórzeniach.
Wpływ pH analizowano w szerokim zakresie pH od 3 do 11. Pomiary wykonano po inkubacji wybranego preparatu po immobilizacji przez 2 h, w roztworze buforowym o zdefiniowanym pH.
Stabilność termiczną wolnych oraz unieruchomionych enzymów badano w zakresie temperatur 20–80 °C. Pomiary realizowano w termostatowanej komorze spektrofotometru Jasco UV 750.
92
-Przed przystąpieniem do pomiarów, w przypadku każdej z analiz, odczekano 5 min po ustabilizowaniu się temperatury.
Zmiany aktywności katalitycznej, a więc możliwość ponownego wykorzystania preparatów po immobilizacji określono na podstawie 15 lub 20 następujących po sobie cykli reakcyjnych. Po każdej z reakcji matrycę z unieruchomionym białkiem oddzielono od mieszaniny reakcyjnej poprzez odwirowanie i przemycie buforem fosforanowym. Dla każdego z otrzymanych systemów biokatalitycznych pomiary realizowano w pH i temperaturze, w których wykazują maksymalną aktywność katalityczną.
Wpływ czasu magazynowania na aktywność wolnych oraz unieruchomionych białek katalitycznych analizowano na przestrzeni 20 dni. Enzym w formie natywnej oraz immobilizowanej przechowywano w temperaturze 4 oraz 20 °C, co dwa dni badając zachowaną aktywność katalityczną.
7.3. Parametry kinetyczne preparatów po immobilizacji
Parametry kinetyczne, stałą Michaelisa-Menten (Km) oraz maksymalną szybkość reakcji (Vmax) [358] wolnych oraz unieruchomionych enzymów określono w oparciu o modelową reakcję hydrolizy palmitynianu para-nitrofenylu. W trakcie obliczeń wykorzystano wzory i zależności opracowane przez Lineweavera i Burka (równanie 4 oraz 5) [359]:
= !"[$]
&[$] (4)
'=
!"·
[$]+
!"
(5)
gdzie: [S] jest stężeniem substratu [M], V oraz Vmax to odpowiednio początkowa oraz maksymalna szybkość reakcji [U], natomiast Km to stała Michaelisa-Menten [M].
Parametry kinetyczne charakteryzują enzym oraz określają jego powinowactwo do substratu, a także opisują powstające opory dyfuzyjne w transporcie substratów do centrum aktywnego enzymu.
7.4. Reakcja transestryfikacji oleju rzepakowego z metanolem
W ramach niniejszej pracy doktorskiej podjęto także próbę praktycznego wykorzystania wytworzonych systemów biokatalitycznych w procesach transestryfikacji oleju rzepakowego z metanolem, które umożliwiają produkcję estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) – głównego składnika biodegradowalnego i nietoksycznego paliwa, jakim jest biodiesel. Ogólny schemat metanolizy trójglicerydów zawartych w olejach roślinnych katalizowanej przez lipazy został przedstawiony na rys. 25.
93
Rys. 25. Reakcja transestryfikacji olejów roślinnych z metanolem katalizowana przez lipazy
Do przeprowadzenia reakcji transestryfikacji wytypowano układy odznaczające się zachowaniem najwyższej aktywności katalitycznej, określonej na podstawie reakcji modelowej. Procesy prowadzono w kolbach stożkowych przy dwóch stosunkach objętościowych oleju rzepakowego (produkt komercyjny, Z.T. Kruszwica S.A., Polska) do metanolu (Chempur, Polska) – 2:1 oraz 5:1. W pierwszym przypadku do kolb odmierzono 5 ml oleju oraz 2,5 ml metanolu, a w drugim 7,5 ml oleju oraz 1,5 ml alkoholu metylowego. Reakcje metanolizy prowadzono w zakresie pH od 6 do 10, a jego wartość regulowano za pomocą 0,01 M roztworu NaOH (Chempur, Polska). Proces prowadzono w zmiennych warunkach temperatury (od 20 do 60 °C) oraz w różnych przedziałach czasowych (od 1 do 72 h). Reakcja została zainicjowana poprzez dodanie odpowiedniej ilości produktu po immobilizacji, który zawierał 5 mg unieruchomionego białka i umieszczeniu zawartości kolb w inkubatorze KS 3000 IC Control firmy IKA-Werke GmbH & Co. KG (Niemcy). Po zakończeniu procesu próbki zostały odwirowane na wirówce Centrifuge 5804 firmy Eppendorf (Niemcy) i poddane dalszym analizom. Jako próby kontrolne przeprowadzono także reakcje transestryfikacji z dodatkiem 5 mg wolnego enzymu, jak i bez dodatku biokatalizatora, w celu określenia wpływu warunków środowiska reakcji na wydajność procesu.
7.5. Chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas
W celu określenia konwersji trójglicerydów oraz stężenia estrów metylowych kwasów tłuszczowych wykorzystano chromatografię gazową sprzężoną ze spektrometrią mas (GC-MS). Analizy wykonano na chromatografie PEGASUS 4D GCxGC-TOFMS firmy Leco Corp. (USA), we współpracy z Zakładem Chemii Organicznej Wydziału Technologii Chemicznej Politechniki Poznańskiej.
W celu przygotowania próbki do analizy chromatograficznej odmierzono 50 µl roztworu po transestryfikacji oraz dodano do niego 10 µl heksadekanu (Sigma-Aldrich, USA), jako standardu wewnętrznego oraz 900 µl heksanu (Sigma-Aldrich, USA). Układ energicznie wymieszano i odwirowano z szybkością 5000 obr/min z wykorzystaniem wirówki MiniSpin firmy Chemland (Polska). Do analiz pobrano 800 µl mieszaniny, którą umieszczono w fiolce chromatograficznej.
Estry metylowe kwasów tłuszczowych (FAME) Glicerol
Trójglicerydy Metanol
94
-W badaniach wykorzystano kolumnę kapilarną BPX5 wyprodukowaną przez SGE Int. (Australia).
Gaz nośny stanowił hel, z szybkością przepływu wynoszącą 1 ml/min. Po nastrzyknięciu próbki temperatura pieca chromatograficznego została ustalona na poziomie 55 °C przez 5 min, a następnie podnoszona w tempie 10 °C/min do uzyskania 300 °C i utrzymywana przez 15 min. Źródło jonów spektrometru mas oraz linia bazowa zostały wyznaczone w temperaturze 250 °C. Kalibrację metody opracowano wykorzystując FAME Column Mix Standard (Sigma-Aldrich, USA) zawierający mieszaninę wzorców estrów metylowych kwasów tłuszczowych o stężeniu 1000 µg/ml.
95