Analiza fizykochemiczna oraz morfologiczna preparatów unieruchomionych enzymów

Zarówno nośniki przed immobilizacją, jak i preparaty unieruchomionych enzymów poddano wnikliwej analizie fizykochemicznej oraz morfologicznej. Zastosowano w tym celu zaawansowane metody oraz techniki pomiarowe i badawcze, których opis zaprezentowano w niniejszym rozdziale. Wyniki przeprowadzonych analiz nie tylko umożliwiły charakterystykę zastosowanych nośników, lecz również posłużyły do potwierdzenia efektywności i skuteczności zaproponowanych metod immobilizacji enzymów.

Co więcej, w oparciu o otrzymane rezultaty możliwym było określenie wpływu poszczególnych parametrów procesu immobilizacji na właściwości wytworzonych układów biokatalitycznych. Dodatkowo wytypowano preparaty odznaczające się najlepszymi właściwościami wykorzystane następnie w testach katalitycznych.

6.1. Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera oraz spektroskopia Ramana

Spektroskopię w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR) oraz spektroskopię ramanowską wykorzystano do identyfikacji grup funkcyjnych obecnych w badanym materiale, które mogą potencjalnie brać udział w przyłączeniu białka, a także do potwierdzenia skutecznej immobilizacji enzymu na powierzchni danego materiału [348,349].

Analizę FTIR wykonano na aparacie Vertex 70 firmy Bruker (Niemcy), natomiast analizę spektroskopii Ramana przeprowadzono we współpracy ze Środowiskowym Laboratorium Unikalnej Aparatury Chemicznej Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu, na aparacie IFS 66v/s z przystawką Ramana FRA 106/S (Bruker, Niemcy).

Przed przystąpieniem do analizy FTIR konieczne było przygotowanie próbki, którą analizowano w postaci pastylki z KBr. W tym celu 1,5 mg badanej substancji utarto w moździerzu z 250 mg bezwodnego bromku potasu (Sigma-Aldrich, USA). Następnie mieszaninę sprasowano pod ciśnieniem 10 MPa i powstałą pastylkę umieszczono w komorze pomiarowej spektrometru. Analizę FTIR zrealizowano w zakresie liczby falowej 4000–400 cm^-1 z rozdzielczością 0,5 cm^-1.

86

-Widma ramanowskie analizowano w zakresie spektralnym 3500–250 cm^-1 w kuwetach kwarcowych z rozdzielczością spektralną wynoszącą 4 cm^-1. W pomiarach wykorzystano wstecznie rozproszone światło lasera o długości fali λ=520 nm.

6.2. Spektroskopia fotoelektronów wzbudzonych promieniowaniem rentgenowskim

Spektroskopia fotoelektronów wzbudzonych promieniowaniem rentgenowskim – XPS (ang. X-ray Photoelectron Spectroscopy) została wykorzystana do zdefiniowania rodzaju oddziaływań powstałych w próbkach po immobilizacji, jak i do określenia pierwiastkowego składu powierzchniowego analizowanych materiałów [350].

Analizy XPS zrealizowano w Instytucie Technologii Chemicznej Nieorganicznej i Inżynierii Środowiska Zachodniopomorskiego Uniwersytetu Technologicznego w Szczecinie, a w badaniach wykorzystano aparat firmy Prevac (Polska) z dołączonym hemisferycznym analizatorem energii elektronów SES 2002 firmy VG Scienta (Szwecja).

Materiały analizowano w postaci proszku, który naklejono z wykorzystaniem grafitowych krążków, do folii aluminiowej. W dalszej kolejności materiały wprowadzono do śluzy aparatu, gdzie przebywały pod ciśnieniem 1·10^-9 mbar. Emisja fotoelektronów została wymuszona poprzez lampę rentgenowską pracującą przy napięciu 15 kV i prądzie emisji 25 mA, zaopatrzoną w anodę glinową emitującą promieniowanie AlKα (hν=1486,6 eV). W czasie wykonywania widm przeglądowych energia przejścia PE wynosiła 100 eV, natomiast dla widm wysokiej rozdzielczości PE=50 eV. Przed przystąpieniem do pomiarów spektroskop został skalibrowany w oparciu o linię miedzi EB Cu 2p3/2=932,8 eV, srebra EB Ag 3d5/2 BE=368,3 eV oraz linię złota EB Au 4f7/2=84,0 eV.

6.3. Magnetyczny węglowy rezonans jądrowy – ¹³C CP MAS NMR

Spektroskopia ¹³C CP MAS NMR, a więc spektroskopia węglowego magnetycznego rezonansu jądrowego (ang. Solid-state Cross-Polarization Magic Angle Spinning Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance) to technika analityczna, która umożliwia określenie rodzajów atomów węgla, jakie występują w badanym materiale [351].

Badania spektroskopowe NMR wykonano we współpracy z Centrum Badań Molekularnych i Makromolekularnych Polskiej Akademii Nauk w Łodzi, w Samodzielnej Pracowni Badań Strukturalnych – Środowiskowym Laboratorium Analizy Związków Organicznych i Polimerów. Analizę wykonano z wykorzystaniem spektrometru Avance DRX 500 (Bruker, Niemcy). Aparat ten pozwala na rejestrację widma w zakresie częstotliwości 12–600 MHz oraz wykonanie widm dwuwymiarowych.

Analiza została wykonana poprzez umieszczenie ok. 100 mg analizowanej próbki na obrotowym statywie wykonanym z ditlenku cyrkonu o średnicy 4 mm, który umożliwia obrót próbki i jej odwirowanie pod kątem magicznym (ang. magic angle) przy częstotliwości 8 kHz. Widma ¹³C CP MAS NMR zarejestrowano przy częstotliwości 100,63 MHz w 4 mm próbniku. Do pomiarów wykorzystano pojedynczy

87

-impuls wzbudzający z rozprzęgającym protonem o wysokiej energii (powtarzalność -impulsu 10 s, szybkość obrotu 8 kHz).

6.4. Ocena morfologii i mikrostruktury z zastosowaniem skaningowej mikroskopii elektronowej oraz mikroskopii cyfrowej

Morfologię powierzchni wybranych nośników przed i po procesie immobilizacji enzymu oceniono z zastosowaniem skaningowego mikroskopu elektronowego – SEM (ang. Scanning Electron Microscope).

Zasada działania mikroskopu skaningowego polega na bombardowaniu powierzchni analizowanej próbki wiązką elektronów, a następnie na detekcji, przez odpowiednie detektory, różnych sygnałów (np. elektronów wtórnych czy wstecznie rozproszonych), po odbiciu od powierzchni próbki [352].

Analizę SEM wykonano przy współpracy z Wydziałową Pracownią Mikroskopii Elektronowej i Konfokalnej Wydziału Biologii Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu na mikroskopie EVO40 firmy Zeiss AG (Niemcy). Przed właściwym pomiarem powierzchnia próbki była pokrywana złotem przez 5 s przy użyciu napylarki PV205P (Balzers, Szwajcaria).

Zdjęcia cyfrowe matrycy przed i po unieruchomieniu enzymu wykonano na mikroskopie optycznym VHX 5000 firmy Keyence (Japonia).

6.5. Mikroskopia sił atomowych

Mikroskop sił atomowych – AFM (ang. Atomic Force Microscope) został wykorzystany w celu zobrazowania zmian zachodzących w topografii powierzchni nośnika przed oraz po procesie immobilizacji enzymu.

Pomiar rozpoczęto od naniesienia analizowanej substancji na powierzchnię nośnika aparatu, który stanowiła uprzednio mechanicznie oczyszczona mika. Cienka warstwa badanego materiału została naniesiona na mikę z wykorzystaniem metody spin coating. Do przeprowadzenia pomiaru wykorzystano dźwignię typu BudgetSensors All-in-One (USA), której częstotliwość rezonansu wynosiła około 150 kHz.

Do obróbki danych wykorzystano program WSxM [353].

Analizę AFM wykonano w Wielkopolskim Centrum Zaawansowanych Technologii na aparacie Agilent 5500 (USA), który pracował w trybie przerywanego kontaktu.

6.6. Ocena potencjału elektrokinetycznego (dzeta)

Potencjał dzeta badanych układów po immobilizacji wyznaczono w celu oceny ich stabilności elektrokinetycznej w szerokim zakresie pH. Badania wykonano na aparacie Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Wielka Brytania), który dodatkowo wyposażony jest w autotitrator MPT-2 [354].

W pomiarach wykorzystuje się połączenie elektroforezy oraz laserowego pomiaru ruchliwości cząstek w oparciu o efekt Dopplera. Jest to metoda ELS, z ang. Electrophoretic Light Scattering

88

-opierająca się na pomiarze szybkości migracji cząstek w cieczy pod wpływem pola elektrycznego, co nazywane jest ruchliwością elektroforetyczną. Potencjał dzeta nie jest wartością bezpośrednią i oblicza się go na podstawie zebranych doświadczalnie wartości ruchliwości elektroforetycznej, w oparciu o równanie Henry'ego (równanie 1):

= ^{( )} (1)

gdzie: µ – ruchliwość elektroforetyczna [mm·cm/V·s], ε – stała dielektryczna rozpuszczalnika [–], ζ – potencjał dzeta [mV], f(Ka) – funkcja Henry'ego, η – lepkość rozpuszczalnika [Pa·s].

W celu przeprowadzenia pomiaru, 0,01 g analizowanego materiału umieszczono w 25 ml 0,001 M roztworu NaCl, a następnie miareczkowano 0,2 M roztworem HCl lub 0,2 M roztworem NaOH do uzyskania pożądanych wartości pH, które kontrolowane było przy wykorzystaniu elektrody szklanej.

Pomiarów dokonano w zakresie pH od 2 do 11. Średni błąd pomiarowy potencjału dzeta wyniósł ±2 mV, natomiast błąd pomiaru wartości pH to 0,1.

6.7. Analiza elementarna

Analiza elementarna nośników przed immobilizacją oraz układów po unieruchomieniu enzymu pozwala na zaobserwowanie zmian procentowej zawartości takich pierwiastków jak: węgiel, azot, wodór oraz siarka w składzie badanego materiału. Pomiary wykonano na aparacie Vario EL Cube firmy Elementar Analysensysteme GmbH, Niemcy. Wśród zalet wykorzystanego urządzenia można wymienić możliwość analizy próbek o małej masie, dużą dokładność analizy, jak i możliwość pełnej automatyzacji procesu [355].

Pomiar polega na odważeniu ok. 10 mg analizowanej próbki i umieszczeniu jej w karuzeli urządzenia, z której badana substancja jest przenoszona do kolumny spalania, gdzie ulega spaleniu w temperaturze 1150 °C w atmosferze ultraczystego tlenu. Uzyskane gazy kierowane są do kolumny redukcyjnej (temp. 850 °C), gdzie ulegają kondensacji. W wyniku tego procesu powstaje mieszanina gazowa CO2, N2, H2O oraz SO2, które rozdzielane są na kolumnach adsorpcyjnych i wykrywane przez zestaw odpowiednich detektorów. Skutkiem tego uzyskuje się procentową zawartość poszczególnych pierwiastków w analizowanej próbce.

6.8. Charakterystyka parametrów struktury porowatej

W celu zdefiniowania wpływu procesu unieruchomienia enzymu na parametry struktury porowatej nośnika, w tym powierzchnię właściwą BET oraz całkowitą objętość i średnicę porów, wykorzystano aparat ASAP 2020 firmy Micromeritics Instrument Co. (USA). Powierzchnię właściwą określono

89

-wykorzystując metodę BET (Brunauera-Emmetta-Tellera), natomiast objętość i rozkład wielkości porów zdefiniowano w oparciu o model BJH (Barreta-Joynera-Halendy) [356].

Pomiar parametrów struktury porowatej opiera się na niskotemperaturowej adsorpcji azotu (temperatura -196 °C). Ze względu na złożoność procesu, próbki przed analizą należy odpowiednio przygotować. W tym celu poddaje się je odgazowaniu w komorze próżniowej, w temperaturze 120 °C przez 4 h, a następnie umieszcza się w porcie analitycznym, przez który do komory wprowadza się oczyszczony gaz (azot), który wypełnia kapilary materiału i ulega kondensacji. Powstaje pierwsza warstwa adsorpcyjna, a następnie kolejne (zjawisko adsorpcji wielowarstwowej), co prowadzi do całkowitego zapełnienia mezoporów. Z wykorzystaniem oprogramowania komputerowego oraz transformacji matematycznych możliwym było zdefiniowanie parametrów struktury porowatej.

6.9. Ocena stabilności termicznej – analiza termograwimetryczna

Ocenę stabilności termicznej analizowanych materiałów przeprowadzono na aparacie Jupiter STA 449F3, firmy Netzsch GmbH (Niemcy). W niniejszej pracy wykorzystano termograwimetrię – metodę analityczną, której zadaniem jest zobrazowanie jak zmienia się masa próbki pod wpływem zmian temperatury, a uzyskane wyniki przedstawia się w formie tzw. termogramu. W nieniejszej metodzie pomiary realizowane są w atmosferze azotu, powietrza, argonu, tlenu lub w próżni, a wzrostowi temperatury towarzyszy zazwyczaj ubytek masy próbki.

W niniejszej pracy pomiary realizowano w temperaturach w zakresie od 30 do 1000 °C, z krokiem 10 °C/min, w atmosferze gazu obojętnego, którym był azot. Uzyskane termogramy zostały przedstawione w formie zależności zmian masy próbki od temperatury.

6.10. Ocena ilości zimmobilizowanego enzymu – metoda Bradford

W celu określenia ilości enzymu unieruchomionego na powierzchni danego nośnika wykorzystano metodę opracowaną przez Marion M. Bradford [357]. Dzięki tej technice określono stężenie białka pozostałego w przesączach po unieruchomieniu enzymu i wykorzystując znane wartości początkowej ilości białka w roztworze oraz jego objętość, jak i ilość zastosowanego nośnika obliczono ilość miligramów enzymu, która została unieruchomiona na 1 gramie nośnika. Metoda Bradford opiera się na zjawisku przesunięcia maksimum absorpcji barwnika Coomassie Brillant Blue G-250 (CBB G-250) po jego związaniu z białkiem. W wyniku reakcji barwnika z białkiem roztwór zmienia swoje zabarwienie z brunatnego na niebieski, a natężenie barwy zależy od zawartości proteiny w analizowanej próbce.

W celu wykonania oznaczenia przygotowano roztwór barwnika zawierający 10 mg CBB G-250 (Sigma-Aldrich, USA), który rozpuszczono w 5 ml 96-proc. alkoholu etylowego (Chempur, Polska), 10 ml 85-proc. kwasu fosforowego(V) (Chempur, Polska) oraz 85 ml wody dejonizowanej. Aby wykonać pomiary spektrofotometryczne, przy długości fali λ=595 nm, do kuwety polistyrenowej odmierzono 4 ml przygotowanego odczynnika Bradford, 80 µl buforu fosforanowego o pH=7 oraz 20 µl analizowanego

90

-roztworu enzymu i pozostawiono na 10 min, po czym zmierzono absorbancję. Stężenie białka w próbce określono przy pomocy krzywej wzorcowej, którą sporządzono w oparciu o roztwory surowiczej albuminy wołowej (ang. bovine serum albumin) o znanym stężeniu.

6.11. Określenie wydajności immobilizacji proteazy

Wydajność procesu immobilizacji proteazy z Aspergillus oryzae na powierzchni hydroksyapatytu została określona z wykorzystaniem pomiarów spektroskopowych realizowanych zgodnie z metodą Bradford, w oparciu o równanie 2:

= ^{· %} (2)

gdzie: IY to wydajność immobilizacji [%], AI to ilość unieruchomionego enzymu, natomiast AT oznacza ilość unieruchomionego enzymu, przy 100-proc. wydajności.

7. Ocena aktywności katalitycznej oraz stabilności preparatów