Medycyna Weterynaryjna - Summary Medycyna Wet. 63 (1), 84-86, 2007

Medycyna Wet. 2007, 63 (1) 84

Praca oryginalna Original paper

Od wielu lat prowadzone s¹ liczne badania laborato-ryjne i kliniczne dotycz¹ce skutecznoœci profilaktycz-nej i terapeutyczprofilaktycz-nej preparatów moduluj¹cych uk³ad odpornoœciowy ró¿nych gatunków zwierz¹t. Na szcze-góln¹ uwagê zas³uguj¹ tu preparaty immunostymuluj¹-ce pochodzenia naturalnego – biostymulatory (11, 20), które przede wszystkim mo¿na wykorzystywaæ w eko-logicznej hodowli zwierz¹t, gdzie wymaga siê absolut-nej rezygnacji z suplementacji diety zwierz¹t syntetycz-nymi stymulatorami. Poza tym w hodowlach takich d¹¿y siê do metod nieinwazyjnego oddzia³ywania na organiz-my zwierzêce, a wiêc podawania m.in. stymulatorów odpornoœci, je¿eli jest to mo¿liwe, w formie najbardziej wygodnej, tzn. w paszach. Istotn¹ grupê stanowi¹ tutaj b-glukany (16, 20, 21, 26), a wœród nich b-1,3/1,6-D--glukan, wchodz¹cy w sk³ad œciany komórkowej dro¿d¿y z gatunku Saccharomyces cerevisiae. General-nie wykazano, ¿e b-glukany stymuluj¹ znacz¹co odpor-noœæ organizmu przeciw ró¿norodnym infekcjom wy-wo³anym przez wirusy, bakterie, grzyby i paso¿yty u wielu gatunków zwierz¹t (3, 8, 19, 24, 25). Jednak w dostêpnym piœmiennictwie odnotowano zaledwie dwie pozycje dotycz¹ce ochronnego efektu beta-gluka-nu u owiec w trakcie eksperymentalnie wywo³anego za-palenia wymienia (3) oraz wp³ywu beta-glukanu na sub-populacje leukocytów w gruczole mlekowym (24).

Niniejsze opracowanie stanowi kontynuacjê wczeœ-niejszych badañ, w których wykazano pozytywny wp³yw dodatku b-1,3/1,6-D-glukanu do pasz na cechy u¿ytkowoœci miêsnej oraz nieswoiste humoralne me-chanizmy obronne jagni¹t (9). Uzyskane efekty stymu-lacji odpornoœci humoralnej, stanowi³y zachêtê do oce-ny oddzia³ywania tego preparatu na kszta³towanie siê parametrów nieswoistej odpornoœci komórkowej.

Celem badañ by³a ocena wp³ywu b-1,3/1,6-D-glu-kanu podawanego w paszy na nieswoiste komórkowe parametry odpornoœci jagni¹t.

Materia³ i metody

Badania przeprowadzono na owcach pochodz¹cych ze stada hodowlanego Zak³adu Produkcyjno-Doœwiadczalnego w Ba³cynach, w gospodarstwie Zaj¹czki. Materia³ zwierzêcy stanowi³o 26 jagni¹t ss¹cych owcy kamienieckiej, w wieku 21 ± 7 dni, urodzonych w kotelni w 2005 r.

Uk³ad doœwiadczenia. Owce podzielono na 2 analogiczne grupy: I – kontroln¹ i II – doœwiadczaln¹, wed³ug nastêpuj¹-cych kryteriów: masa cia³a, p³eæ, data urodzenia, a tak¿e wiek ich matek. W ka¿dej grupie by³o po 13 jagni¹t – 7 tryczków i 6 maciorek, wszystkie pochodz¹ce z miotów bliŸniaczych. Jagniêta obu grup dokarmiano do 30. dnia ¿ycia sianem ³¹ko-wym i mieszank¹ treœciw¹ C-J do woli, a nastêpnie ¿ywiono zgodnie z normami dla jagni¹t hodowlanych, wprowadzaj¹c do zestawu pasz sianokiszonkê z traw i roœlin motylkowatych. W grupie doœwiadczalnej jagni¹t od samego pocz¹tku badañ

Wp³yw b-1,3/1,6-D-glukanu na nieswoiste

komórkowe mechanizmy obronne jagni¹t

ROMAN WÓJCIK, JOANNA MA£ACZEWSKA, SYLWIA TRAPKOWSKA, ANDRZEJ K. SIWICKI Zespó³ Mikrobiologii i Immunologii Klinicznej Katedry Chorób ZakaŸnych i Inwazyjnych

Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UWM, ul. Oczapowskiego 9, 10-957 Olsztyn Wójcik R., Ma³aczewska J., Trapkowska S., Siwicki A. K.

Influence of b-1,3/1,6-D-glucan on non-specific cellular defence mechanisms in lambs Summary

The aim of the study was to estimate the influence of b-1,3/1,6-D-glucan applied in feed on non-specific cellular immunity in lambs.

The study examined twenty six 21-28 day old lambs in two groups: I – control and II – experimental (7 rams and 6 ewes in each group). The animals were kept under identical zoohygienic and nutritional conditions. Lambs from group I were fed a basal control diet and lambs from group II were fed a diet containing b-1,3/1,6-D-glucan, at doses of 80 mg/kg/day. Blood was taken from the control and experimental groups before the lambs were fed a diet containing b-1,3/1,6-D-glucan, and 15, 30 and 60 days after administration of the diet. The respiratory burst activity (RBA) and potential killing activity (PKA) of blood phagocytes and proliferative response of blood lymphocytes (MTT) stimulated by mitogens concanavalin A (ConA) and lipopolisaccharide (LPS) were examined. The results indicated that when b-1,3/1,6-D-glucan was applied to food it statistically significantly increased the blood phagocyte and lymphocyte activity in the lambs until the end of experiment, compared to the control group.

Medycyna Wet. 2007, 63 (1) 85 zastosowano dodatek b-1,3/1,6-D-glukanu. Krew do badañ

pobierano z ¿y³y jarzmowej przed dodaniem b-1,3/1,6-D-glu-kanu do paszy oraz w 15., 30. i 60. dniu podawania tej sub-stancji, w celu oznaczenia i porównania kszta³towania siê wskaŸników nieswoistej odpornoœci komórkowej.

Zastosowano immunostymulator naturalny: Biolex-Beta HP firmy Inter Yeast Poland zawieraj¹cy b-1,3/1,6-D-glukan se-parowany ze œcian komórkowych dro¿d¿y z gatunku Saccha-romyces cerevisiae. Zalet¹ tego preparatu jest du¿a efektyw-noœæ biologiczna i stopieñ czystoœci – 85% b-1,3/1,6-D-glu-kan. Dodawano go do sk³adu mieszanki treœciwej C-J w iloœci 0,5%. Dzienna dawka glukanu pobranego przez jagniêta kszta³-towa³a siê na poziomie 80 mg/kg masy cia³a.

Ocena parametrów nieswoistej odpornoœci komórkowej. Badanie aktywnoœci metabolicznej fagocytów – Respiratory Burst Activity (RBA) na podstawie wewn¹trzkomórkowego wybuchu tlenowego po stymulacji PMA (Phormol Myristate Acetate) metod¹ spektrofotometryczn¹ (OD 620 nm) wg Chung i Secombes (5), badanie zdolnoœci do wewn¹trzkomór-kowego zabijania przez komórki ¿erne (polimorfonuklearne – PMN i mononuklearne – MN) metod¹ spektrofotometrycz-n¹ (OD 620 nm) PKA (Potential Killing Activity) wg Rooka i wsp. (15), badanie odpowiedzi proliferacyjnej limfocytów stymulowanych mitogenami (ConA – konkanawalina, LPS – lipopolisacharyd, PHA – fitohemaglutynina) przy pomocy me-tody MTT (3-[4,5-dimethylthiazoly-2yl]-2,5-diphenyltetra-zolium bromide - 3-[4,5-dimetylo-2-tiazolilo]-2,5-difenylo--2H-tetrazolinowy bromek) opisanej pierwotnie przez Mos-manna (10).

Wyniki opracowano statystycznie w uk³adzie jednoczynni-kowym ortogonalnym. Istotnoœæ ró¿nic miêdzy grupami we-ryfikowano przy pomocy testu t-Studenta.

Wyniki i omówienie

W badaniach przeprowadzonych na owcach, po raz pierwszy w takim uk³adzie u tego gatunku zwierz¹t, oceniono efekt stymulacyjnego dzia³ania naturalnego immunostymulatora – b-1,3/1,6-D-glukanu, na wybra-ne wskaŸniki nieswoistej odpornoœci komórkowej.

Mechanizm dzia³ania b-1,3/1,6-D-glukanu polega na wzajemnym jego oddzia³ywaniu ze swoistymi recepto-rami, znajduj¹cymi siê na powierzchni makrofagów, komórek NK (Natural Killer), limfocytów B i T oraz innych komórek immunokompetentnych. Komórki te identyfikuj¹ specyficzn¹ strukturê powierzchni tych cz¹stek jako obc¹ (antygen) i uruchamiaj¹ nieswoist¹ odpowiedŸ immunologiczn¹ za pomoc¹ czynników swoistych – przeciwcia³. Ponadto beta-glukan aktywu-je dope³niacz oraz pobudza wytwarzanie IL-1, IL-6, IL-10, IL-12 i TNF-a (1, 7, 13, 17, 23). Efektem tego jest podwy¿szony stan gotowoœci uk³adu odpornoœcio-wego do obrony organizmu przeciwko ró¿nym czynni-kom patogennym (wirusy, bakterie, grzyby, paso¿yty). Uzyskane w trakcie doœwiadczenia wyniki badañ, wskazuj¹ na istotny wp³yw b-1,3/1,6-D-glukanu na wybrane parametry odpowiedzi immunologicznej za-le¿nej od limfocytów i granulocytów u jagni¹t.

W grupie doœwiadczalnej jagni¹t od 15. do 60. dnia eksperymentu obserwowano statystycznie istotny wzrost aktywnoœci metabolicznej fagocytów krwi (RBA) w porównaniu z grup¹ kontroln¹ (ryc. 1). Wy¿-sze wartoœci RBA œwiadcz¹ o tym, ¿e komórki

fagocy-tuj¹ce s¹ bardziej sprawne, tzn. zdolne do skutecznego wybuchu tlenowego, a wiêc bardziej efektywnej elimi-nacji czynnika patogennego. Suzuki i wsp. (22) otrzy-mali podobne rezultaty badañ – zwiêkszon¹ produkcjê nadtlenku wodoru (H₂O₂) oraz wzrost aktywnoœci en-zymów lizosomalnych w makrofagach myszy po do-ustnym podaniu beta-glukanu. Ten preparat, jak zauwa-¿yli Ohno i wsp. (12) oraz Tokunaka i wsp. (23), wzma-ga³ tak¿e w makrofagach myszy wytwarzanie kolejne-go czynnika wybuchu tlenowekolejne-go – tlenku azotu (NO), jak te¿ aktywowa³ enzymy lizosomalne (21). Ponadto beta-glukan wykazuje zró¿nicowany wp³yw na aktyw-noœæ komórek fagocytarnych, w zale¿noœci od drogi jego aplikacji, co obserwowa³ Sakurai i wsp. (18) u myszy. Makrofagi tych zwierz¹t, po do¿ylnym (i.v.) wprowa-dzeniu beta-glukanu, zwiêkszy³y produkcjê H₂O₂ i in-terleukiny I (IL-1) oraz swoj¹ aktywnoœæ fagocytarn¹ w porównaniu z grup¹ kontroln¹. Natomiast w grupie myszy traktowanych beta-glukanem dootrzewnowo (i.p.) takiego zjawiska nie odnotowano.

W badaniach w³asnych u owiec stwierdzono równie¿ w grupie doœwiadczalnej, miêdzy 15. a 60. dniem po-dawania preparatu, statystycznie istotny wzrost (o 30%) wewn¹trzkomórkowej aktywnoœci bójczej fagocytów krwi (PKA) w porównaniu z grup¹ kontroln¹ (ryc. 2).

Ryc. 1. Aktywnoœæ metaboliczna fagocytów krwi (RBA) jag-ni¹t karmionych pasz¹ z dodatkiem b-1,3/1,6-D-glukanu Objaœnienia: * – ró¿nica statystycznie istotna p < 0,05 w stosun-ku do kontroli i badania 0

Ryc. 2. Wewn¹trzkomórkowa aktywnoœæ bójcza fagocytów krwi (PKA) jagni¹t karmionych pasz¹ z dodatkiem b-1,3/1,6--D-glukanu

Medycyna Wet. 2007, 63 (1) 86

Podobne zjawisko opisali równie¿ inni autorzy u my-szy (17, 18) oraz u krewetek (4).

Pozytywne dzia³anie beta-glukanu wyrazi³o siê tak-¿e wp³ywem na aktywnoœæ proliferacyjn¹ limfocytów krwi (MTT) jagni¹t stymulowanych zarówno ConA (ryc. 3), jak i LPS (ryc. 4), która mimo i¿ by³a w obu przypadkach statystycznie istotnie wy¿sza w grupach stymulowanych b-1,3/1,6-D-glukanem ni¿ w grupach kontrolnych przez ca³y okres doœwiadczenia, to jednak odnotowano ró¿nice w zale¿noœci od zastosowanego mitogenu. W przypadku ConA by³ to 25%, a LPS pra-wie 50% wzrost aktywnoœci proliferacyjnej limfocytów. Równie pozytywny stymuluj¹cy wp³yw miogenów (ConA, LPS, PHA) na limfocyty po zastosowaniu beta-glukanu stwierdzili inni autorzy u myszy i szczurów w badaniach in vivo i in vitro (2, 6, 14, 21).

Uzyskane u jagni¹t wyniki badañ, dotycz¹ce immu-nomoduluj¹cych w³aœciwoœci b-1,3/1,6-D-glukanu, wskazuj¹ na mo¿liwoœæ praktycznego wykorzystania tego preparatu w immunoprofilaktyce tych zwierz¹t, zw³aszcza w okresie zwiêkszonej zapadalnoœci na infekcje bakteryjne i wirusowe. Dodatkowo stanowi¹ zachêtê do dalszych badañ nad ewentualnym wykorzys-taniem tego preparatu do korygowania upoœledzonej odpornoœci u jagni¹t, jak i osobników doros³ych.

Piœmiennictwo

1.Abel G., Czop J. K.: Stimulation of human monocyte beta-glucan receptors by glucan particles induces production of TNF-alpha and IL-1 beta. Int. J. Immu-nopharmacol. 1992, 14, 1363-1373.

2.Bousquet M., Escoula M., Peurière S., Pipy B., Roubinet F., Chavant C.: Immu-nopharmacoloic study in mice of 2 beta-1,3, beta-1,6 polysaccharides (sclero-glucan and PSAT) on the activation of macrophages and T lymphocytes. Ann. Rech. Vet. 1989, 20, 165-173.

3.Buddle B. M., Pulford H. D., Ralston M.: Protective effect of glucan against experimentally induced staphylococcal mastitis in ewes. Vet. Microbiol. 1988, 16, 67-76.

4.Chang C. F., Chen H. Y., Su M. S., Liao I. C.: Immunomodulation by dietary beta-1,3-glucan in the brooders of the black tiger shrimp Penaeus monodon. Fish Shellfish Immunol. 2000, 10, 505-514.

5.Chung S., Secombes S. J.: Analysis of events occurring within teleost macro-phages during the respiratory burst. Comp. Biochem. Physiol. 1988, 89B, 539--544.

6.Hashimoto K., Suzuki I., Yadomae T.: Oral administration of SSG, a beta-glucan obtained from Sclerotinia sclerotiorum, affects the function of Peyer’s patch cells. Int. J. Immunopharmacol. 1991, 13, 437-442.

7.Kim H. M., Han S. B., Oh G. T., Kim Y. H., Hong D. H., Hong N. D., Yoo I. D.: Stimulation of humoral and cell mediated immunity by polysaccharide from mushroom Phellinus linteus. Int. J. Immunopharmacol. 1996, 18, 295-303. 8.Li J., Xing J., Li D., Wang X., Zhao L., Lv S., Huang D.: Effects of beta-glucan

extracted from Saccharomyces cerevisiae on humoral and cellular immunity in weaned piglets. Arch. Anim. Nutr. 2005, 59, 303-312.

9.Milewski, S., Wójcik R., Ma³aczewska J., Trapkowska S., Siwicki A. K.: Wp³yw b-1,3/1,6-D-glukanu na cechy u¿ytkowoœci miêsnej oraz nieswoiste humoralne mechanizmy obronne jagni¹t. Medycyna Wet. (w druku).

10.Mosmann T.: Rapidcolorimetric assay for cellular growth and survival: applica-tion to proliferaapplica-tion and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods 1983, 65, 55-63. 11.Nartowska J., Skopiñska-Ró¿ewska E., Siwicki A. K.: Nowe immunomodulato-ry pochodzenia roœlinnego, [w:] Siwicki A. K., Skopiñska-Ró¿ewska E., Œwi-derski F. (red.): Immunomodulacja – nowe mo¿liwoœci w ochronie zdrowia. Olsztyn, Edycja 2004, s. 7-21.

12.Ohno N., Egawa Y., Hashimoto T., Adachi Y., Yadomae T.: Effect of beta-glu-cans on the nitric oxide synthesis by peritoneal macrophage in mice. Biol. Pharm. Bull. 1996, 19, 608-612.

13.Pelizon A. C., Kaneno R., Soares A. M., Meira D. A., Satori A.: Immunomodu-latory activities associated with beta-glucan derived from Saccharomyces cere-visiae. Physiol. Res. 2005, 54, 557-564.

14.Ríos-Hernández M., Dos-Santos N. J., Silvia-Cardoso, Bello-Gárciga J. L., Pedroso M.: Immunopharmacological studies of beta-1,3-glucan. Arch. Med. Res. 1994, 25, 179-180.

15.Rook G. A., Steele W., Umar J., Dockrell H. M.: A simple method for the solubi-lization of reduced NBT and its use as a colorimetricassay for activation of human macrophages by gamma interferon. J. Immunol. Meth. 1995, 82, 161-167. 16.Sahoo P. K., Mukherjee S. C.: Effect of dietary beta-1,3 glucan on immune responses and disease resistance of healthy and aflatoxin B1-induced immuno-compromised rohu (Labeo rohita Hamilton). Fish Shellfish Immunol. 2001, 11, 683-695.

17.Sakurai T., Hashimoto K., Suzuki I., Ohno N., Oikawa S., Maruda A., Yado-mae T.: Enhacement of murine alveolar macrophage functions by orally admini-stered beta-glucan. Int. J. Immunopharmacol. 1992, 14, 821-830.

18.Sakurai T., Ohno N., Yadomae T.: Intravenously administered (1-3)-beta-D--glucan, SSG, obtained from Sclerotinia sclerotiorum IFO 9395 augments murine peritoneal macrophage functions in vivo. Chem. Pharm. Bull. 1992, 40, 2120-2124.

19.Siwicki A. K., Kazuñ K., G³¹bski E., Terech-Majewska E., Baranowski P., Trap-kowska S.: The effect of beta-1.3/1.6-glucan in diets on the effectiveness of anti-Yersinia ruckeri vaccine – an experimental study in rainbow trout (Oncorhyn-chus mykiss). Pol. J. Food Nutr. Sci. 2004, 54, 59-61.

20.Siwicki A. K., Klein P., Morand M.: Immunomodulacja – aktualny stan wiedzy, [w:] Siwicki A. K. (red.): Wp³yw ksenobiotyków na organizm zwierz¹t i cz³o-wieka. Olsztyn, IRS 1999, 93-102.

21.Suzuki I., Hashimoto K., Ohno N., Tanaka H., Yadomae T.: Immunomodulation by orally administered beta-glucan in mice. Int. J. Immunopharmacol. 1989, 11, 761-769.

22.Suzuki I., Tanaka H., Kinoshita A., Oikawa S., Osawa M., Yadomae T.: Effect of orally administered beta-glucan on macrophage function In mice. Int. J. Immu-nopharmacol. 1990, 12, 675-684.

23.Tokunaka K., Ohno N., Adach Y., Tanaka S., Tamura H., Yadomae T.: Immuno-pharmacological and immunotoxicological activities of a water-soluble (1-3)--beta-D-glucan, CSBG from Candida spp. Int. J. Immunopharmacol. 2000, 22, 383-394.

24.Waller K. P., Colditz I. G.: Effect of intramammary infusion of beta-1,3-glucan or interleukin-2 on leukocyte subpopulations in mammary glands of sheep. Am. J. Vet. Res. 1999, 60, 703-707.

25.Xiao Z., Trincado C. A., Murtaugh M. P.: Beta-glucan enhacement of T cell IFN gamma response in swine. Vet. Immunol. Immunopathol. 2004, 102, 315-320. 26.Yadomae T.: Structure and biological activities of fungal beta-1,3-glucans.

J. Pharmaceut. Soc. Japan 2000, 120, 413-431.

Adres autora: dr Roman Wójcik, ul. Oczapowskiego 13, 10-957 Olsz-tyn; e-mail: brandy@uwm.edu.pl

Ryc. 3. Aktywnoœæ proliferacyjna limfocytów krwi stymulo-wanych ConA jagni¹t karmionych pasz¹ z dodatkiem b-1,3/ /1,6-D-glukanu

Objaœnienia: jak na ryc. 1.

Ryc. 4. Aktywnoœæ proliferacyjna limfocytów krwi stymulo-wanych LPS jagni¹t karmionych pasz¹ z dodatkiem b-1,3/ /1,6-D-glukanu