PRACA DYPLOMOWA MAGISTERSKA

1 POLITECHNIKA WARSZAWSKA

WYDZIAŁ

INŻYNIERII MATERIAŁOWEJ

PRACA DYPLOMOWA

MAGISTERSKA

Milena Zieleniewska

Poliuretanowe podłoża do hodowli tkanek z poliolu na bazie oleju rzepakowego i różnych typów izocyjanianów

Polyurethane scaffolds for tissue culture growth from a polyol based on rapeseed oil and different types of isocyanates

Nr albumu: 211021

Promotor: dr hab. inż. Joanna Ryszkowska Warszawa, 2012

2 Składam serdeczne podziękowania

mojej Promotorce Pani dr hab. inż. Joannie Ryszkowskiej za cenne wskazówki i pomoc w realizacji niniejszej pracy.

Podziękowania składam również Pani mgr inż. Monice Auguścik.

3

Spis treści:

1.Wstęp i cel pracy ...5

2.Przegląd literatury ...6

2.1.Biomateriały w inżynierii tkankowej ...6

2.1.1. Dobór materiałów i sposoby ich badania ...6

2.1.1.1. Badania degradacji materiałów...9

2.1.1.2. Testy proliferacji ... 10

2.1.1.3. Badania działania cytotoksycznego ... 10

2.1.1.4. Badania implantacyjne ... 11

2.1.1.5. Badania genotoksyczności i rakotwórczości ... 12

2.1.2. Inżynieria tkankowa ... 12

2.1.3. Rusztowania komórkowe ... 13

2.1.3.1. Materiały na podłoża ... 16

2.1.3.2. Metody formowania porowatych podłoży ... 18

2.2. Poliuretany ... 21

2.2.1. Substraty i otrzymywanie poliuretanów ... 21

2.2.1.1. Izocyjaniany ... 21

2.2.1.2. Poliole ... 22

2.2.1.3. Przedłużacze łańcucha ... 24

2.2.1.4. Katalizatory ... 24

2.2.1.5. Reakcje otrzymywania poliuretanów ... 24

2.2.2. Zastosowanie poliuretanów ... 27

2.2.2.1. Pianki poliuretanowe... 28

2.2.3. Degradacja poliuretanów ... 30

3. Część eksperymentalna ... 30

3.1. Wytworzenie materiałów ... 30

3.1.1. Surowce ... 30

3.1.2. Otrzymywanie trójwymiarowych podłoży o porowatej architekturze ... 31

3.1.3. Wytworzone materiały ... 33

3.1.4. Sposób przygotowania roztworów i prowadzenia degradacji ... 33

3.2. Metodyka badań ... 34

3.2.1. Spektroskopia w podczerwieni ... 34

4

3.2.2. Analiza termograwimetryczna... 34

3.2.3. Różnicowa kalorymetria skaningowa ... 35

3.2.4. Skaningowa mikroskopia elektronowa ... 35

3.2.5. Analiza dynamiczno-mechaniczna ... 35

3.3. Wyniki badań i dyskusja ... 36

3.3.1. Charakterystyka budowy chemicznej ... 36

3.3.2. Analiza termograwimetryczna... 45

3.3.3. Różnicowa kalorymetria skaningowa ... 48

3.3.4. Skaningowa mikroskopia elektronowa ... 52

3.3.4.1. Określenie wpływu rodzaju izocyjanianów na architekturę materiałów ... 52

3.3.4.2. Określenie wpływu ekspozycji w SBF ... 56

3.3.5. Analiza dynamiczno-mechaniczna ... 58

4.Podsumowanie i wnioski końcowe ... 62

Streszczenie ... 65

Abstract ... 67

Bibliografia ... 69

5 1. Wstęp i cel pracy

Problem braku dawców wielokrotnie wyklucza przeszczep całych narządów, jako terapię w leczeniu licznych chorób, dla których nie ma alternatywnej kuracji. Inżynieria tkankowa otwiera nowe możliwości poprawy jakości życia, przyczynia się do rozwoju medycyny, pozwala na regenerację lub zastąpienie chorych i uszkodzonych tkanek¹. Ostatnie lata przyniosły ogromne postępy w opracowywaniu substytutów tkanek i narządów. Część z nich jest już komercyjnie dostępna, jednak większość pozostaje w fazie badań ze względu na szczególne wymagania stawiane materiałom przeznaczonym do kontaktu z organizmami żywymi. Wyniki badań klinicznych są obiecujące, jednak nadal muszą być prowadzone intensywne prace nad coraz lepszymi materiałami, które dadzą możliwość uratowania każdego organu.

Naukowcy dążą do uzyskania funkcjonalnego materiału, którego zadaniem będzie wspomaganie procesu regeneracyjnego tkanki z jednoczesnym spadkiem liczby powikłań.

Regeneracja całkowicie zniszczonych lub uszkodzonych tkanek oraz narządów jest prawdopodobnie najbardziej perspektywistycznym kierunkiem aplikacji polimerów biomedycznych².

Niniejsza praca magisterska ukierunkowana jest na opracowanie nowych materiałów mających służyć jako podłoże do hodowli komórkowych w celu przygotowania produktu inżynierii tkankowej. W ramach pracy wykonane zostaną porowate, poliuretanowo- mocznikowe podłoża do hodowli tkanek kostnych z poliolu na bazie oleju rzepakowego i różnych typów izocyjanianów. Celem pracy jest określenie wpływu zastosowanego diizocyjanianu oraz czasu mieszania uzyskanego prepolimeru z przedłużaczem łańcucha na otrzymane materiały.

6 2. Przegląd literatury

2.1. Biomateriały w inżynierii tkankowej

Większość publikacji z dziedziny inżynierii tkankowej definiuje ją jako dyscyplinę wykorzystującą zasady nauk inżynierskich i przyrodniczych w celu wytwarzania biologicznych substytutów odtwarzających, podtrzymujących i polepszających działanie zniszczonych tkanek i organów¹.

Biomateriałami nazywamy materiały, które samodzielnie lub w złożonym systemie mogą oddziaływać w kontrolowany sposób z elementami żywego układu, w procesie diagnostycznym lub terapeutycznym, w weterynarii lub medycynie. Cechują się biotolerancją, a więc zgodnością biologiczną i harmonią interakcji z żywą materią. Po wprowadzeniu do organizmu nie wywołują stanu zapalnego bądź chronicznych lub ostrych reakcji³.

2.1.1. Dobór materiałów i sposoby ich badania

Podczas planowania badań materiałów przeznaczonych na implanty, należy wziąć pod uwagę wiele aspektów takich jak właściwości fizyczne, chemiczne, elektryczne, mechaniczne, morfologiczne, toksykologiczne. Niebezpieczeństwo związane ze stosowaniem implantów może obejmować objawy krótkotrwałe (działanie drażniące, uczulające, hemolityczne, trombogenne) oraz objawy odległe (działanie uczulające, toksyczne przewlekłe lub subchroniczne, genotoksyczne, rakotwórcze, teratogenne). Prawidłowa ocena wyrobów implantacyjnych wymaga labilnego doboru metod badań, związanych z ich przeznaczeniem.

Z tej przyczyny charakterystyka materiałów z jakich został wykonany implant jest jednym z pierwszych kroków jakie należy podjąć w celu oceny wyrobu. Należy w niej wziąć pod uwagę:

- sposób wytworzenia materiału,

- wprowadzone dodatki i zanieczyszczenia pochodzące z procesu wytwarzania, - substancje, które ulegają wymywaniu,

- produkty degradacji,

- właściwości gotowego wyrobu,

- możliwości interakcji w gotowym wyrobie⁴.

Zakres, w jakim powinien być badany dany materiał jest zależny od rodzaju tego materiału, jego zastosowania i funkcji jaką ma pełnić. Charakterystyka materiałowa jest

7 podstawą do oceny ryzyka, jakie wiąże się z użytkowaniem tego materiału. Badania, które należy wziąć pod uwagę przy ocenie biologicznej są określone przez odpowiednie normy takie jak: ISO 10993-1. Największe wymagania są stawiane materiałom wprowadzanym do organizmu na stałe (wszczepy). Podstawą oceny nowych materiałów jest określenie punktów odniesienia, wzorców, zarówno tych pozytywnych jak i negatywnych (w zależności od rodzaju badania)⁵.

Do wytwarzania implantów stosowane są materiały, które ze względu na pochodzenie można podzielić na materiały syntetyczne i naturalne. Materiały syntetyczne otrzymywane są w procesie technologicznym, naturalne pozyskiwane są bezpośrednio ze źródeł roślinnych bądź zwierzęcych. Najważniejszymi zaletami materiałów pochodzenia naturalnego są: słaba reakcja zapalna tkanek biorcy po implantacji, degradacja zachodząca pod wpływem naturalnie występujących enzymów oraz niska toksyczność in vitro. Jednak jedną z podstawowych przeszkód w stosowaniu materiałów pochodzenia naturalnego jest utrudniona kontrola zjawisk zachodzących w kontakcie z tkankami biorcy, której przyczyną jest niepowtarzalna charakterystyka, zależna od pochodzenia materiału. Ta cecha praktycznie uniemożliwia standaryzację produktów wykonanych z tych materiałów. Kolejną przeszkodą w stosowaniu tych materiałów jest niska wytrzymałość mechaniczna, co utrudnia przeprowadzanie na nich nawet prostych operacji manualnych podczas przygotowywania i implantacji⁶.

Materiały wytworzone przez człowieka można podzielić na cztery grupy: metale, polimery, materiały ceramiczne i kompozytowe. Do końca lat 50-tych największą popularnością cieszyły się materiały metaliczne, jednak stale rosnące wymagania stawiane materiałom biomedycznym sprawiają, że udział materiałów polimerowych i kompozytów rośnie. Na Rys.1 przedstawiono diagram przedstawiający udział materiałów implantacyjnych stosowanych w ostatnich latach.

8 Rys.1. Udział materiałów implantacyjnych stosowanych w ostatnich latach⁷.

Najbardziej popularne wśród materiałów do zastosowań medycznych są polimery. Są to tworzywa o szerokim spektrum właściwości fizycznych, chemicznych i materiałowych.

Polimery mogą przyjmować postać litą, porowatą, stałą bądź włóknistą, przetwarzane są w dowolne formy (proste i złożone). Niestety mimo przyjmowania różnych form właściwości mechaniczne znacznej części materiałów polimerowych są niezadowalające z punktu widzenia medycyny. Polimery resorbowalne mogą powodować stany zapalne (związane z degradacją materiału). Tworzywa, które nie ulegają degradacji w środowisku biologicznym wymagają stałej kontroli ich zachowania w organizmie bądź zabiegu chirurgicznego po zakończeniu procesu regeneracji^4,8.

Biomateriały metaliczne (stopy kobaltowo-chromowe, stal nierdzewna, tytan i powłoki tytanowe) narażone są na procesy korozyjne w środowisku biologicznym. Mogą także powodować alergię (chrom, nikiel). Ich właściwości mechaniczne znacznie przewyższają właściwości mechaniczne tkanek, co grozi niebezpieczeństwem przeniesienia całego obciążenia na implant z pominięciem tkanki. Aplikowanie implantów metalicznych wyklucza także stosowanie takich metod, jak rezonans magnetyczny czy tomografia komputerowa^4,9,10.

Materiały ceramiczne charakteryzują się wysoką biozgodnością z tkanką kostną.

Odporność na korozję, podobieństwo do naturalnego minerału występującego w kościach, a także dobre wyniki badań in vivo oraz in vitro zapowiadały tę grupę materiałów bardzo obiecująco. Jednak parametry mechaniczne (kruchość, niewielka odkształcalność, niski moduł

9 sprężystości, niska wytrzymałość) sprawiły, że grupa ta stanowi najczęściej dodatek do materiałów implantacyjnych^4,11,12.

Ponieważ żadna z opisanych wyżej grup materiałów nie jest w stanie sprostać wymaganiom stawianym materiałom dla medycyny, trwają ciągłe poszukiwania rozwiązań, które pozwoliłyby otrzymać materiały o optymalnych parametrach mechanicznych, biologicznych i chemicznych.

2.1.1.1.Badania degradacji materiałów

Aby określić ryzyko kliniczne zastosowania implantu konieczna jest analiza możliwości jego rozkładu i mechanizmów degradacji. Na degradację wyrobów ma wpływ wiele czynników, takich jak lokalne środowisko czy umiejscowienie anatomiczne.

Powstawanie produktów degradacji powiązane jest ze zmianą masy materiałów, uwalnianiem związków z powierzchni, odwarstwianiem się konstrukcji i jej pękaniem, a także migracją składników między materiałami w wyrobach wieloskładnikowych. Zmiana masy materiału może mieć miejsce na etapie produkcji, sterylizacji, procesów zachodzących w trakcie przechowywania. Wymywanie, reakcje chemiczne, depolimeryzacja, migracja prowadzi do uwalniania związków z powierzchni materiałów. Produkty degradacji polimerów powstają głównie na skutek rozerwania wiązań chemicznych w procesach hydrolitycznych bądź utleniania w środowisku wodnym. Na rodzaj i stopień degradacji polimerów mogą również wpływać czynniki biologiczne, np. enzymy czy aktywność komórkowa. Przeprowadzając badanie degradacji polimerów należy wziąć pod uwagę gęstość usieciowania, średnie masy cząsteczkowe, pozostałość monomerów i związków cząsteczkowych, a także stabilność termiczną, zakres przemiany topnienia, zawartość metali i katalizatorów, lepkość w stanie stopionym. Zależnie od przeznaczenia implantu i rodzaju degradacji badania przeprowadzane są w różnych roztworach i buforach⁴. Najpopularniejszym roztworem jest płyn symulujący płyny fizjologiczne SBF (Simulated Body Fluid), zawierający sole NaCl, NaHCO3, KCl, K2HPO4·3H2O, MgCl2·6H2O, CaCl2·2H2O, Na2SO4, (CH2OH)3CNH2 w ilościach zgodnych z tymi, które są zawarte w osoczu krwi ludzkiej¹³. Zastosowanie tego roztworu opisane jest między innymi w pracy [14], w której to przeprowadzane testy w SBF, prowadzone metodami elektrochemicznymi mają na celu określenie odporności korozyjnej tytanu pokrytego warstwą fosforanową uzyskaną metodą IBAD. Jako medium degradacyjne stosowane są także buforowane sole fosforanowe PBS (Phosphate Buffered Saline). Stosowane w pracy [15] w testach długoterminowych, w celu określenia zmian właściwości mechanicznych oraz

10 absorpcji i ubytku masy¹⁶. Stosowany jest także Roztwór Ringera, buforowany roztwór soli, wykorzystany w pracy [17], gdzie przedstawiono zmiany zachodzące na powierzchni anodowanych próbek tytanu i jego implantowych stopów Ti6Al4V ELI oraz Ti6Al7Nb zanurzonych w roztworze.

2.1.1.2.Testy proliferacji

Testy proliferacji są szeroko stosowane w inżynierii tkankowej do badania czynników wzrostu, substancji odżywczych oraz kontroli środków chemioterapeutycznych lub cytotoksycznych¹⁸. Cechą powierzchni wpływającą na proliferację osteoblastów jest hydrofobowość/hydrofilowość materiału. Generalnie materiały o powierzchniach hydrofilowych charakteryzują się wyższą proliferacją. Jednak powierzchnie zbyt hydrofilowe, przypominające swą strukturą żele, powodują obniżenie adhezji komórek. Zwielokrotnienie proliferacji można osiągnąć także przez dobór kształtu i wielkości porów. Optymalna wielkość porów pozwalająca uzyskać wysoką proliferację osteoblastów waha się w granicach 75-200 µm, wielkość porów zawarta w przedziale 250-300 µm pozwala na namnażanie się komórek włóknistej tkanki chrzęstnej¹⁹. Czynnikiem powierzchniowym, który wpływa na adsorpcję i adhezję komórek są właściwości fizykochemiczne powierzchni materiału.

Domenowość ułożenia grup polarnych i niepolarnych, a także powinowactwo powierzchni mają wpływ na rozkład i łatwość tworzenia się zogniskowanych miejsc przeszczepu²⁰. Na szybkość narastania komórek na powierzchnię materiału mają wpływ takie parametry powierzchniowe jak: chropowatość, energia powierzchniowa, budowa chemiczna powierzchni²¹. Popularnym testem oceny liczby komórek na powierzchni badanych materiałów jest test XTT. Opiera się on na zdolności metabolicznie aktywnych, żywych komórek do przeprowadzania reakcji chemicznej, podczas której enzym mitochondrialny, powoduje przekształcenie substratu XTT (2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5- [(phenylamino) carbonyl]-2H- tetrazolium hydroxide) w rozpuszczalny w wodzie, pomarańczowy produkt – formazan, którego ilość jest mierzona spektrofotometrycznie przy pomocy czytnika typu ELISA (Fluostar Optima, BMG Labtech) przy długości fali 450 nm^20,22,23. Liczba komórek oceniana jest także na podstawie testu BCA – badanie stężenia białka z kwasem bicinchoniowym, oraz na podstawie ilości DNA – test PicoGreen²⁴.

2.1.1.3. Badania działania cytotoksycznego

Testy z żywymi komórkami są podstawowymi badaniami jakie przeprowadza się w celu określenia działania toksycznego materiałów medycznych. Opracowane zostały różne

11 modele biologiczne z wykorzystaniem plemników i pierwotniaków, hodowli komórkowych, które pozwalają przeprowadzić wstępne badania pod kątem możliwości działania toksycznego substancji wymywanych. Są to badania szybkie i niedrogie. Charakteryzują się także wysoką czułością, która jest wynikiem izolacji kultur komórkowych, na skutek czego komórki pozbawione są mechanizmów ochronnych. Badanie działania cytotoksycznego jest pierwszym krokiem w kierunku określenia biozgodności badanego wyrobu. Jeżeli otrzymany wynik jest negatywny to znaczy, że materiał jest wolny od szkodliwych substancji wymywanych bądź też ich ilość jest niewystarczająca by wywołać ostrą reakcję. Jednak badanie to nie wystarcza by uznać materiał za w pełni biozgodny, jest to jedynie pierwszy etap testów. Pozytywny wynik jest sygnałem świadczącym o zbyt wysokiej zawartości substancji ekstrahowanych. W tej sytuacji należy przeprowadzić dalsze badania w celu określenia przydatności wyrobu do zastosowań klinicznych^4,9,10.

2.1.1.4. Badania implantacyjne

Bezpośrednim sposobem oceny wpływu implantu na otaczające go tkanki jest jego przeszczep do organizmu zwierzęcia laboratoryjnego. W wyniku tego badania otrzymujemy informację odnośnie miejscowej reakcji organizmu po implantacji tworzywa. Metoda ta nie daje oceny wpływów systemowych materiału na cały organizm. Miejscowy odczyn jest oceniany przez porównanie reakcji tkanek na badany materiał z reakcjami tych tkanek na materiał kontrolny. Wybierając materiał kontrolny brane jest pod uwagę jego zastosowanie kliniczne i fakt, że powinno ono być jak najbardziej zbliżone do planowanego zastosowania badanego materiału. Implantacja jest przeprowadzana u zwierząt tego samego gatunku, w jednakowych warunkach i odpowiadających sobie miejscach anatomicznych. Na reakcję tkanek po implantacji mają wpływ takie cechy materiału jak: kształt, twardość, gęstość, sposób wykończenia powierzchni. Aplikowana próbka jest wytworzona, wykończona i wysterylizowana metodami przewidzianymi dla gotowego wyrobu. Przy wyborze zwierząt do badań brane są pod uwagę różne reakcje w zależności od gatunku. Przy doborze czasu badania ważny jest przewidywany okres, po którym odpowiedź biologiczna tkanek osiągnie stan stałej reakcji. Badania miejscowej reakcji wykonywane są na poziomie makroskopowym i mikroskopowym. Poziom makroskopowy pozwala na ocenę charakteru, rodzaju i rozległości zaobserwowanych zmian. Ocena mikroskopowa zawiera dane dotyczące rozległości stanu zapalnego, rozmieszczenia i liczby komórek tego stanu, zmian w strukturze komórek otaczających, a w przypadku implantów o powierzchni porowatej, ilości tkanek wypełniających pory^4,9.

12 2.1.1.5. Badania genotoksyczności i rakotwórczości

Istnieją trzy typy wpływu genotoksycznego: wpływ na DNA, aberracje chromosomalne oraz mutacje genowe. Z tej przyczyny konieczne jest przeprowadzenie badań in vitro, które mogą być w większości wykonywane na kulturach komórkowych lub mikroorganizmach. Szczegółowe opisy testów, jakie są wymagane, zawarte są w zaleceniach Organizacji Współpracy Ekonomicznej i Rozwoju. Najpowszechniej stosowane są testy mutacji genetycznych, przeprowadzane na bakteriach z rodzaju Escherichia lub Salmonella, testy na mysich komórkach szpiku kostnego, a także testy na kulturach komórek jajnika chomika^4,9.

Rakotwórczość jest potencjalną zdolnością materiału, lub jego produktów degradacji będących w kontakcie z żywym organizmem, do inicjacji i indukowania wzrostu komórek zmienionych rakowo. Testy takie należy przeprowadzić w przypadku implantów wszczepianych na stałe. Podstawowe znaczenie w ocenie rakotwórczości mają informacje dotyczące dystrybucji, metabolizmu, wchłaniania i wydalania chemikaliów pochodzących z wyrobu. Testy przeprowadzane są na zwierzętach^4,9.

2.1.2.Inżynieria tkankowa

W inżynierii tkankowej można wyróżnić trzy różne podejścia. Pierwsze z nich zakłada użycie wyizolowanych komórek bądź substytutów komórkowych w celu zastąpienia komórek, które są odpowiedzialne za pożądane funkcje. Ma tu miejsce wstrzyknięcie zawiesiny komórkowej w celu regeneracji uszkodzonej tkanki lub narządu.

Drugie podejście opiera się na dostarczeniu do organizmu czynników indukujących wzrost tkanki (czynników wzrostu). Niestety oba te sposoby obecnie mają ograniczone zastosowanie i mogą być wykorzystywane jedynie w przypadku niewielkich uszkodzeń.

Trzecie i zarazem najważniejsze oferuje hodowlę komórek na trójwymiarowym rusztowaniu. Proces rekonstrukcji uszkodzonych tkanek przebiega etapowo i składa się z określonej sekwencji²⁵.

W inżynierii tkankowej podstawą są komórki, które mogą pochodzić z różnych źródeł, stąd też wynika ich klasyfikacja:

- ksenogeniczne - pochodzące od obcego gatunku,

- allogeniczne - przeszczep następuje w obrębie tego samego gatunku,

- syngeniczne - jednorodne, pochodzące od osobników identycznych genetycznie, - autologiczne - przeszczep w obrębie tego samego ustroju²⁶.

13 Komórki macierzyste i prekursorowe określa się jako komórki proliferacyjnie nieaktywne. Są one obecne w małej liczbie we wszystkich głównych tkankach. Ze wszystkich potencjalnych źródeł komórek, najmniej inwazyjnym i najłatwiejszym sposobem ich otrzymania jest pobranie ze szpiku kostnego droga przezskórnej biopsji. Stosowanie komórek autologicznych daje możliwość uniknięcia problemów z układem immunologicznym, organizm nie potraktuje ich jako obcych.

Uzyskany w procesie biopsji materiał zostaje poddany obróbce polegającej na uwolnieniu komórek z naturalnej macierzy, która otacza je w organizmie. Pozyskane komórki są wysiewane na rusztowaniach komórkowych (in vitro) symulujących macierz zewnątrzkomórkową. Tak przygotowany nośnik wraz z wysianymi na nim komórkami jest umieszczany w komorze bioreaktora, w której to zachodzi proces namnażania komórek.

Bioreaktor zapewnia właściwe warunki środowiskowe, dostarczenie pożywki hodowlanej oraz czynników wzrostu (Rys. 2).

Rys. 2. Kolejne etapy wytwarzania substytutów tkanek lub organów metodami inżynierii tkankowej (www.bionova.com.au)

2.1.3. Rusztowania komórkowe

Naturalna regeneracja uszkodzonych tkanek jest w przypadku wielu ich typów praktycznie niemożliwa. Sposobem na rozwiązanie tego problemu jest zastosowanie w miejscu uszkodzenia sztucznego rusztowania (skafoldu), które ułatwia proces regeneracji.

Odpowiada ono za proces scalania komórek w tkanki, wpływa na ich kształt i ruch, a także stanowi dla nich mechaniczną podporę. Rusztowania wykonane z materiałów naturalnych

14 bądź syntetycznych powinny w jak największym stopniu odzwierciedlać cechy i funkcje naturalnej matrycy. Po spełnieniu swojego zadania wszczepiony materiał powinien ulegać stopniowej degradacji na rzecz naturalnej matrycy, nie powodując przy tym negatywnych dla organizmu ludzkiego konsekwencji^3,4.

Skafoldy służą między innymi do uzupełniania kości uszkodzonych na skutek resekcji nowotworów, obrażeń poniesionych w nieszczęśliwych wypadkach, złamań, będących konsekwencją chorób (np. osteoporozy). Tworzywo takie będzie mogło zregenerować lub zastąpić uszkodzoną tkankę w organizmie i przywrócić jej funkcję.

Szkielet człowieka nadaje ciału kształt i stanowi podporę dla narządów. Jego podstawowym materiałem budulcowym jest tkanka kostna. Odznacza się ona impregnacją istoty międzykomórkowej solami, węglanami wapnia i magnezu oraz fosforanami tworzącymi krystaliczne struktury (hydroksyapatyty) nadające tej tkance dużą twardość.

Kość jest materiałem kompozytowym, gdzie rolę osnowy spełnia organiczna istota bezpostaciowa wraz z substancją nieorganiczną – hydroksyapatytem. Rolę struktury nośnej pełnią włókna kolagenowe. Ukształtowanie i struktura kości w ciele człowieka są dostosowane do funkcji, jaką pełni. Kości są zdolne do dopasowywania się do obciążeń, jakie muszą przenosić. Charakterystyczna jest także stosunkowo niska masa i struktura porowata przy zachowaniu wysokich właściwości wytrzymałościowych.

Ruch kości następuje w wyniku skurczów przymocowanych do nich mięśni szkieletowych. Układ kostny, nerwowy oraz mięśniowy stanowią narząd ruchu. Tkankę kostną pod względem anatomiczno-histologicznym tworzą trzy rodzaje komórek: osteocyty, osteoklasty i osteoblasty. Organiczna matryca wraz z wodą i solami organicznymi stanowią substancję międzykomórkową. Zadaniem osteoblastów jest wytworzenie kości, osteocyty odpowiadają za jej utrzymanie, a osteoklasty zapewniają jej resorpcję. Resorpcja i tworzenie kości sprawiają, że kość tkana podlega przemianie w koncentryczną kość blaszkowatą.

Składają się na nią włókna kolagenowe, układ kanałów Haversa oraz blaszki śródmiąższowe, ułożone tak, by zapewnić maksymalną siłę kości w przeliczeniu na jej objętość. Komórki wytwarzające nową tkankę kostną, czyli osteoblasty, są otaczane przez zrąb kostny i przemieniają się w dojrzale osteocyty. Osteocyty produkują wypustki komórkowe służące do transportu międzykomórkowego⁴.

Skafoldy stanowią specyficzne podłoże dla żywych komórek. Aby dobrze spełniały swą funkcję należy projektować ich budowę tak, aby jak najdokładniej przypomniały swoją

15 strukturą macierz zewnątrzkomórkową, która występuje we wszystkich żywych komórkach.

Macierz ta, w warunkach organizmu ludzkiego, odpowiada za właściwości mechaniczne tkanki, utrzymuje jej strukturę, umożliwia dostarczanie składników pokarmowych do komórek dzięki swej porowatej budowie, oraz stanowi dla nich przyczep. Zbudowana jest głównie z białek kolagenowych i niekolagenowych oraz różnego rodzaju innych składników:

hydroksyapatytu, keratyny, płynu tkankowego, kwasu hialuronowego - zależnie od tkanki, w której występuje⁴.

Porowate podłoża do hodowli tkanek kostnych muszą spełniać szereg warunków, by dobrze pełniły swą funkcję^4,15. Należą do nich:

- trójwymiarowa struktura, zawierająca ilość porów, umożliwiającą przyłączenie komórek, ich proliferację i wytwarzanie własnej macierzy zewnątrzkomórkowej,

- odpowiednia budowa chemiczna powierzchni skafoldów, odpowiadająca za absorpcję białek,

- połączona siec porów zapewniająca dopływ składników pokarmowych oraz odprowadzanie produktów przemiany materii. W celu uzyskania odpowiednich warunków migracji komórek i płynów należy dążyć do osiągnięcia wysokiego udziału porowatości otwartej, a także wytworzyć połączenia porów o świetle nie mniejszym niż średnia wielkość komórki,

- biokompatybilność i bioresorbowalność materiału o kontrolowanej szybkości degradacji, - nietoksyczne i łatwo usuwalne produkty rozkładu,

- środowisko sprzyjające namnażaniu komórek,

- powtarzalna architektura skafoldu dostosowana rozmiarem i kształtem do wymogów klinicznych,

- odpowiednio dobrane właściwości mechaniczne i fizyczne rusztowania, umożliwiające integrację oraz współdziałanie skafoldu z naturalną tkanką. Wytrzymałość mechaniczna rusztowania powinna być maksymalnie zbliżona do wytrzymałości mechanicznej tkanki, którą ma zastępować.

Opisane parametry idealnego skafoldu charakteryzowane są różnymi wielkościami i w różnych skalach. Wielkość porów zawarta w przedziale 15 – 300 nm najczęściej podlega ocenie metodami takimi jak skaningowa mikroskopia elektronowa bądź mikroskopia konfokalna. Wytrzymałość mechaniczna, oceniana jest zwykle w skali makroskopowej, np. w statycznej próbie rozciągania lub ściskania.

Idealny implant, mający zastąpić uszkodzoną kość, powinien się charakteryzować dobrym połączeniem z tkanką kostną, poprzez wytworzenie wiązania chemicznego oraz złącza biologicznego. Zespół Hulberta prowadził badania nad szybkością wrastania tkanki

16 kostnej w materiały porowate CaO-Al2O3. Naukowcy ci wykazali, że dla porów o rozmiarach 15-40 µm zachodzi słaba penetracja porowatego implantu przez tkankę włóknistą, natomiast pory o średnicy co najmniej 200 µm umożliwiają bardzo dobre przerastanie implantu kością^27,28. Podczas opracowywania porowatych implantów kostnych, oprócz odpowiednio ukształtowanej porowatości, należy wziąć pod uwagę jej negatywny wpływ na wytrzymałość materiałów. Coraz bardziej zaawansowane metody badawcze oraz szeroka wiedza opisująca wpływ białek na proces proliferacji komórek, pozwalają na analizę właściwości powierzchniowych w skali nano. Dobór odpowiedniego materiału jest jednak najistotniejszy dla procesu wytwarzania trójwymiarowych struktur.

2.1.3.1. Materiały na podłoża

Materiały na matryce polimerowe dobierane są w zależności od przeznaczenia.

Obecnie stosowane są metale, ceramika oraz polimery, które znajdują najszersze zastosowanie ze względu na duże możliwości sterowania ich właściwościami fizycznymi, chemicznymi i mechanicznymi.

Poliestry alifatyczne są główną grupą materiałów stosowanych do otrzymywania trójwymiarowych podłoży. Zalicza się do nich takie polimery jak: poli(kwas glikolowy) (PGA), poli(ε-kaprolakton) (PCL), poli(kwas mlekowy) (PLA). Charakteryzują się biodegradowalnością i bioresorbowalnością. Rusztowania z tych materiałów ulegają dość szybkiej degradacji, przy czym szybkość degradacji tych polimerów maleje według przedstawionej kolejności: PGA> P(D,L–LA)> P(L–LA)> PCL. Czas degradacji polimeru może wynosić od kilku tygodni (np. L, D-PLA) do kilku lat (np. L-PLA)²⁹. Degradacja tych materiałów zachodzi w wyniku hydrolizy wiązań estrowych łańcucha głównego³⁰.

Poliestry alifatyczne ulegają degradacji na drodze hydrolizy wiązań estrowych łańcucha głównego, zaś produkty ich rozkładu zostają włączone w cykl metaboliczny Krebsa.

Mechanizm degradacji materiałów jest różny w zależności od pH środowiska, co schematycznie przedstawiono na Rys. 3.

17 pH ≤ 7

pH > 7

Rys. 3. Schemat degradacji hydrolitycznej wiązania estrowego w środowisku neutralnym, kwaśnym bądź zasadowym¹⁵.

Na szybkość degradacji ma wpływ wiele czynników takich jak: historia termiczna, skład chemiczny, polidyspersyjność, ciężar cząsteczkowy, czynniki środowiskowe, krystaliczność, morfologia łańcucha polimerowego, obecność chemicznie reaktywnych składników w masie polimeru, obecność różnego rodzaju dodatków, hydrofilowość, postać materiału (zwłaszcza porowata). Czas życia polimeru, a także jego parametry fizyczne i mechaniczne mogą być modyfikowane przez otrzymywanie jego kopolimerów z monomerami wpływającymi na stopień jego krystaliczności, biozgodność, biodegradowalność^31,32,33. Produkty degradacji PLA, PGA, PGLA, PCL są nietoksyczne, jednak duża ilość kwasowych produktów degradacji może prowadzić do lokalnych stanów zapalnych. PLA lub PGA są stosowane często jako materiały referencyjne dla nowo opracowywanych materiałów w inżynierii tkankowej.

18 Obecnie prowadzone są na szeroką skalę badania nad poliuretanami jako materiałami na podłoża do hodowli tkanek kostnych. Ich unikalna budowa chemiczna, osiągana dzięki możliwości modyfikacji substratów oraz warunków syntezy, pozwala na uzyskanie materiałów o szerokim spektrum właściwości mechanicznych, fizycznych i biologicznych^34,35,36. Podstawowym kryterium badań ze względu na przeznaczenie jest tempo rozkładu oraz nietoksyczność produktów powstających po degradacji³⁷. Możliwość modyfikacji składu poliuretanów pozwala na uzyskanie materiałów o kontrolowanym tempie degradacji, dzięki czemu można uniknąć niepożądanych reakcji implantacji, takich jak lokalnego zakwaszenia środowiska wokół implantu. Stosowanie odpowiednich substratów zapewnia nietoksycznośc powstających substratów zarówno warunkach in vitro jak i in vivo.

2.1.3.2. Metody formowania porowatych podłoży

Istnieje wiele metod otrzymywania materiałów porowatych. Metody stosowane do wytwarzania rusztowań polimerowych determinują geometrię, architekturę, a także właściwości mechaniczne wytworzonego materiału³⁸. Do najpopularniejszych należą:

- metoda SCPL (ang. Solvent Casting & Particulate Leaching)

Metoda ta umożliwia dobranie porowatości preparatów. Roztwór polimeru wlewany jest do formy zawierającej cząsteczki porogenne. Zależnie od wymaganej średnicy porów stosuje się sole nieorganiczne (najczęściej NaCl), żelatynowe kulki bądź sacharozę.

Następnym krokiem jest odparowanie rozpuszczalnika i usunięcie substancji porotwórczej.

Wadą tej metody są trudności w usunięciu pozostałości rozpuszczalnika i porogenu, które mogą niekorzystnie wpływać na kultury komórkowe^15,39.

- wytwarzanie pianek z fazą gazową

Sposobem bezrozpuszczalnikowym na otrzymanie struktur porowatych jest wykorzystanie sprężonego gazu obojętnego (CO2 lub N2). W tej metodzie materiał poddawany jest przesycaniu gazem w czasie od kilku do kilkunastu godzin. Po zmniejszeniu ciśnienia następuje desorpcja w wyniku której tworzone są pory. Materiał zmienia się w gąbkowatą, wypełnioną porami strukturę. Problemem w tej metodzie jest brak połączeń między pęcherzykami oraz niejednorodny rozkład porów.

Metodą otrzymywania porów jest także wprowadzenie łatwo lotnej cieczy w niskiej temperaturze. Po ogrzaniu ciecz przechodzi w gaz i wydziela się z układu tworząc strukturę

19 porowatą tworzywa, która utrwala się po ochłodzeniu. Metoda ta służy do wytwarzania porowatego PVC, polistyrenu oraz polietylenu.

Istnieje także możliwość wydzielania gazu w wyniku reakcji zachodzącej między substratami użytymi do wytworzenia materiału. Przykładem są pianki poliuretanowe, gdzie produktem nadającym porowatą strukturę jest CO₂, powstający w wyniku reakcji izocyjanianu z wodą¹⁵.

- emulgowanie, liofilizacja

W metodzie tej polimer traktowany jest emulsją, na którą składa się rozpuszczalnik i woda. Zanim nastąpi samoczynne rozdzielenie faz cieczy, mieszanina wlewana jest do formy i chłodzona ciekłym azotem. W procesie liofilizacji usuwana jest woda i rozpuszczalnik, co pozwala na otrzymanie porowatego rusztowania. Zaletą metody jest pominięcie procesu ługowania, jednak problem stanowią resztki rozpuszczalnika, które mogą być zagrożeniem dla hodowanych komórek. Otrzymane pory są nierównomiernie rozmieszczone w materiale i mają małe rozmiary^15,40.

- elektroprzędzenie

Metoda ta umożliwia otrzymanie włókien o średnicach nano- i mikrometrowych.

Roztwór stopionego polimeru przepuszczany jest przez dyszę przędzalniczą, podłączoną do wysokiego napięcia. Siły odpychania elektrostatycznego powodują wypuszczenie cienkiej, włóknistej wiązki. Naładowany przeciwnie lub uziemiony odbieralnik gromadzi strumień, zamieniający się w wypełnioną porami sieć. Głównymi zaletami tej metody jest możliwość otrzymania wysokiej porowatości (do 95%) i duża powierzchnia właściwa, wadą są słabe właściwości mechaniczne materiału otrzymanego tym sposobem^15,40.

- technologie CAM/CAD

W metodzie tej wykorzystywane są programy wspomagające projektowanie i wytwarzanie materiałów. Trójwymiarowy model, wygenerowany w aplikacji CAD jest wytwarzany metodą osadzania topionego materiału bądź drukowany z użyciem sproszkowanego polimeru^15,40.

20 Na Rys. 4 przedstawiono skafoldy otrzymane różnymi technikami¹⁵.

- odlewanie połączone z wymywaniem cząstek

- termicznie indukowana separacja faz

- formowanie ze stopu

21 - spiekanie mikrosfer

Rys. 4. Różne techniki otrzymywania skafoldów¹⁵

2.2. Poliuretany

Wszechstronność poliuretanów pozwoliła na ich zastosowanie w wielu dziedzinach przemysłu. Zależnie od stosunku użytych monomerów, ich funkcyjności, rodzaju i stężenia katalizatora, modyfikatorów, otrzymuje się różnego rodzaju tworzywa poliuretanowe⁴⁰. Prowadzone są badania dotyczące zastosowania tych materiałów na podłoża do hodowli tkanek kostnych.

2.2.1. Substraty i otrzymywanie poliuretanów

Podstawowymi substratami do syntezy liniowych poliuretanów są:

- diizocyjaniany, - poliole,

- przedłużacze łańcucha.

Stosuje się też środki pomocnicze takie jak katalizatory, środki sieciujące, dodatki funkcjonalne i przetwórcze⁴¹.

W procesie otrzymywania podłoży do hodowli tkanek kostnych korzystne jest wytwarzanie liniowych poliuretanów, które będą łatwiej degradowały niż poliuretany usieciowane.

2.2.1.1. Izocyjaniany

Podstawowymi składnikami do otrzymywania poliuretanów są izocyjaniany, otrzymane w 1849 r. przez Wurtza. Ich reakcje ze związkami zawierającymi aktywne atomy

22 wodoru wykorzystał w 1937 r. Bayer, który wraz ze współpracownikami stworzył podstawy chemii i technologii polimerów. Izocyjaniany posiadają w strukturze bardzo reaktywną, zawierającą dwa skumulowane wiązania podwójne, grupę izocyjanianową o wzorze

−N=C=O⁴¹.

Do najpopularniejszych izocyjanianów należą: alifatyczne izocyjaniany liniowe:

diizocyjanian heksametylenu – HDI, cykliczne: 4,4'-diizocyjanian dicykloheksylenometanu HMDI, diizocyjanian izoforonu – IPDI, oraz aromatyczne: metyleno-difenylo-4,4'- diizocyjanian – MDI, 2,4-diizocyjanian toluilenu – TDI, m-diizocyjanian ksylenu – XDI⁴¹.

2.2.1.2. Poliole

Najczęściej stosowanymi poliolami są: poli(tlenek etylenu) – PEO, poli(tlenek propylenu) – PPO, poli(izobutylen) – PIB, poli(octan etylu) – PEA, poli(ε-kaprolakton) – PCL, czy poli(butadien) – PBD. Poliole odgrywają bardzo ważną rolę w produkcji poliuretanów^41,42. Zastosowanie polioli petrochemicznych jest niekorzystne z punktu widzenia produkcji, energii i kosztów. Zarówno z ekonomicznego jak i środowiskowego punktu widzenia pożądane jest, aby zastąpić poliole otrzymywane z ropy naftowej tymi, które można otrzymać z zasobów odnawialnych. Obecnie opracowywane są różne metody syntezy polioli z olejów roślinnych. Badania prowadzone są przede wszystkim nad modyfikacją olejów:

sojowego, rzepakowego, rycynowego, palmowego⁴².

Otrzymywanie polioli roślinnych na przykładzie oleju rzepakowego

Jednym z surowców roślinnych wykorzystywanych do syntezy polioli jest olej rzepakowy.

Poliole z oleju rzepakowego otrzymywane są metodą dwuetapową, która obejmuje utlenianie wiązań nienasyconych i otwarcie utworzonych pierścieni epoksydowych. W skład oleju rzepakowego wchodzą reszty kwasu oleinowego (ponad 60% mas.) z jednym wiązaniem podwójnym⁴². Na Rys. 5 przedstawiono schemat struktury chemicznej oleju rzepakowego.

23 Rys. 5. Schemat struktury chemicznej oleju rzepakowego⁴²

Pierwszym etapem otrzymywania poliolu roślinnego jest poddawanie oleju rzepakowego reakcji niepełnego utleniania nadkwasem octowym w celu uzyskania epoksydowanego oleju rzepakowego (Rys. 6).

Rys. 6. Utlenianie oleju rzepakowego z użyciem nadkwasu octowego⁴². Symbole R’, R” – reszty kwasowe

Kolejnym etapem syntezy jest reakcja pełnego otwarcia pierścieni oksiranowych z użyciem glikolu etylenowego i rezorcyny (Rys. 7).

Rys. 7. Otwieranie pierścieni oksiranowych glikolem dietylenowym i rezorcyną w epoksydowanym oleju rzepakowym⁴²

24 2.2.1.3. Przedłużacze łańcucha

Przedłużacze łańcucha w istotny sposób wpływają na poliuretany nadając im giętkość i elastyczność. Jako przedłużacze stosowane są między innymi: alkohole (glikol etylenowy, 1- 4-butanodiol, 1-6-heksanodiol), diaminy (etylenodiamina, 1-2-propylenodiamina)⁴³.

2.2.1.4. Katalizatory

Największe zastosowanie do produkcji poliuretanów znalazły katalizatory aminowe, głównie aminy III-rz. np. trietylenodwuamina, trietyloamina, N-metylomorfolina.

Katalizatory te dodane w ilości 0,1-0,2% powodują znaczne przyspieszenie reakcji z izocyjanianami. Ich działanie polega na regulowaniu przebiegu reakcji spieniania i sieciowania. Drugą grupę katalizatorów stanowią związki ołowiu, cyny, kobaltu, miedzi np.

naftenian kobaltowy, kaprylan cynowy, naftenian miedziowy. Związki te katalizują reakcje polimeryzacji. Używanie obydwu typów katalizatorów daje osiągnięcie niezbędnej równowagi pomiędzy szybkością wzrostu makrocząsteczek polimeru a stopniem spieniania w porowatych poliuretanach⁴³.

2.2.1.5. Reakcje otrzymywania poliuretanów

Liniowe poliuretany są otrzymywane na skutek reakcji poliaddycji, która następuje w wyniku przeskoku atomu wodoru grupy hydroksylowej do atomu azotu grupy izocyjanianowej z utworzeniem wiązania charakterystycznego dla tej grupy materiałów- wiązania uretanowego (-O-C(O)-NH-). Zawierają one w łańcuchu głównym obok silnie polarnych ugrupowań uretanowych, grupy eterowe, estrowe, biuretowe i inne. Segmentowe poliuretany otrzymywane są w reakcji stopniowego wzrostu łańcucha makrocząsteczek (reakcja kopoliaddycji)^41,43(Rys. 8).

Rys. 8. Reakcje otrzymywania poliuretanów⁴¹

25 Jeżeli zastosujemy jako substraty reakcji diizocyjaniany i glikole, powstaną poliuretany o budowie liniowej. W reakcji izocyjanianów zawierających więcej niż dwie grupy izocyjanianowe w cząsteczce, lub związków wielohydroksylowych powstają poliuretany usieciowane⁴¹.

W celu otrzymania poliuretanów o dużym ciężarze cząsteczkowym proces należy prowadzić zachowując ściśle równowagowe stosunki grup funkcyjnych obu reagentów, ponieważ nadmiar jednego ze składników może prowadzić do zmniejszenia ciężaru cząsteczkowego polimeru⁴¹.

Proces otrzymywania poliuretanów w przemyśle prowadzi się z wykorzystaniem rozpuszczalnika (chlorobenzen), lub bezrozpuszczalnikowo (w masie). W celu osiągnięcia równomiernego rozkładu substratów w mieszaninie reakcyjnej należy zastosować intensywne mieszanie. Stosowana jest także metoda polikondensacji na granicy faz, w której substratami są dichloromrówczan glikolu i diamina⁴⁴.

W poliuretanach wyróżniamy chemicznie połączone segmenty sztywne (An = HS) oraz giętkie (Bm = SS)⁴⁵(Rys. 9).

Rys. 9. Budowa blokowych (segmentowych) poliuretanów zawierających segmenty giętkie i sztywne⁴⁵ Segmenty sztywne są produktem reakcji diiizocyjanianów i małocząsteczkowych dioli, zaś segmenty giętkie są wynikiem reakcji diizocyjanianów z makrodiolami typu polieterodioli, poliestrodioli, poliestro-eterodioli. Otrzymujemy poli(etero-uretany), poli(estro-uretany) lub poli(estro-etero-uretany). Obok małocząsteczkowych przedłużaczy łańcucha stosowane są także diaminy i pochodne mocznika prowadzące do otrzymania poli(uretano-moczników) i poli(uretano-biuretów).

26 Segmenty sztywne (polarne) silnie oddziaływają ze sobą w głównej mierze poprzez wiązania wodorowe i nie ulegają mieszaniu jednorodnemu w temperaturze poniżej 120°C z mniej polarnymi segmentami giętkimi. Następuje rozdział fazowy i powstaje mikroniejednorodna morfologia składająca się z domen miękkich i twardych. Pewna ilość pojedynczych segmentów sztywnych pozostaje rozproszona pomiędzy segmentami giętkimi, separacja mikrofazowa nie jest całkowita⁴⁵.

Zależnie od sposobu upakowania segmentów domeny mogą mieć charakter amorficzny lub krystaliczny. Zdolność poliuretanów do krystalizacji wzrasta wraz ze zmniejszaniem zawartości segmentów sztywnych i wydłużaniem segmentów giętkich. Wzrost stosunku molowego izocyjanianu do poliolu przekłada się na zwiększenie zawartości segmentów sztywnych a tym samym wzrost wytrzymałości, twardości i zmniejszenie elastyczności^43,45. Obecność wiązania wodorowego skutkuje separacją na domeny fazy twardej i miękkiej. Faza miękka może występować w postaci krystalicznej i amorficznej, faza twarda w postaci pseudokrystalicznej i amorficznej. Zależnie od procentowej zawartości poszczególnych segmentów domeny są połączone lub izolowane. Kształt domen izolowanych może być sferyczny, cylindryczny, elipsoidalny lub lamelarny (Rys. 10). Model domen połączonych stanowi strukturę dwu faz ciągłych⁴⁵.

Rys. 10. Schemat domen izolowanych i połączonych w poliuretanach segmentowych: a-domeny sferyczne, b-domeny elipsoidalne, c —domeny cylindryczne⁴⁵

27 Faza miękka jest osnową dla domen z fazy twardej przy zawartości segmentów sztywnych poniżej 45% masowych. Przebieg separacji fazowej zależy od temperatury. Jej wzrost prowadzi do częściowego rozpadu domen twardych. Domeny twarde znacznie polepszają wytrzymałość materiału⁴⁵.

2.2.2. Zastosowanie poliuretanów

Poliuretany znalazły zastosowanie w wielu aplikacjach. W zależności od warunków reakcji, funkcyjności użytych substratów oraz środków modyfikujących, otrzymywane są następujące tworzywa poliuretanowe:

- liniowe termoplastyczne poliuretany (folie, włókna, tworzywa przetwarzane metodą wtrysku),

- termoplastyczne elastomery poliuretanowe, - pianki poliuretanowe,

- poliuretanowe,

- -

- lakiery i powłoki ochronne, -

- wyroby powlekane np. sztuczna skóra.

Budowa chemiczna ma wpływ na właściwości poliuretanów. W wyniku ich ogrzewania w wysokich temperaturach następuje rozkład, jednak polimery otrzymane z dioli alifatycznych odznaczają się większą odpornością termiczną w porównaniu do tych zsyntezowanych z dioli aromatycznych. Tworzywa te są odporne na działanie czynników utleniających, tlenu, oraz roztworów kwasów. Charakteryzują się również trzykrotnie mniejszą chłonnością wody niż poliamidy.

Wytwarzane są i stosowane zarówno jako termoplasty jak i tworzywa reaktywne poliaddycyjne i polikondensacyjne, termo- i chemoutwardzalne. Mogą być przetwarzane klasycznymi metodami, a także energooszczędną metodą wtrysku reaktywnego. Ogromną zaletą PUR jest możliwość sterowania ich właściwościami fizycznymi i mechanicznymi, co daje możliwość ich dostosowania do wymagań konkretnej aplikacji medycznej.

28 2.2.2.1. Pianki poliuretanowe

Pianki poliuretanowe otrzymywane są w wyniku spieniania masy poliuretanowej metodą fizyczną bądź chemiczną⁴⁶.

W metodzie fizycznej do spieniania wykorzystywane jest ciepło egzotermicznej reakcji syntezy poliuretanu, dzięki czemu następuje odparowanie obecnej w środowisku procesu cieczy o dużej lotności (np. fluorotrichlorometan).

W metodzie chemicznej do środowiska reakcji dodawana jest woda. W wyniku reakcji H2O z grupą izocyjanianową poliuretanu wydziela się dwutlenek węgla odgrywający rolę poroforu⁴⁶ (Rys. 11).

Rys. 11. Spienianie poliuretanów – etap 1⁴⁶

W reakcji powstaje grupa aminowa, która może reagować z grupą izocyjanianową, tworząc pochodną mocznikową, która reagując z kolejną grupą izocyjanianową tworzy ugrupowanie biuretowe^45,47(Rys. 12).

Rys. 12. Spienianie poliuretanów – etap 2⁴⁶

Grupa izocyjanianowa może także reagować z ugrupowaniami uretanowymi. Powstaje pochodna alofaniowa⁴⁶(Rys. 13).

Rys. 13. Spienianie poliuretanów – etap 3⁴⁶

29 Do produkcji pianek poliuretanowych najczęściej stosowane są poliole polieterowe lub poliestrowe, zawierające w swych cząsteczkach co najmniej dwie grupy hydroksylowe.

Wykorzystywany jest także olej rycynowy i jego pochodne.

Do produkcji pianek elastycznych stosuje się mieszaniny polioli zawierające więcej składników dwufunkcyjnych. Do wytwarzania pianek sztywnych stosuje się większe dodatki polioli trój- lub więcej funkcyjnych. Od charakteru i funkcyjności poliolu zależą przede wszystkim właściwości pianki, takie jak wytrzymałość i odporność chemiczna.

Pianki poliuretanowe są otrzymywane metodą prepolimerową lub jednoetapową^43,46,48. Metoda prepolimerowa znajduje głównie zastosowanie do produkcji pianek sztywnych i półsztywnych. Jest to proces dwuetapowy (Rys. 14). W pierwszym etapie poliol reaguje z umiarkowanym nadmiarem diizocyjanianu w stosunku do grup wodorotlenowych poliolu.

Następuje przyłączenie izocyjanianu do grup końcowych poliolu. Powstaje produkt zawierający wolne grupy izocyjanianowe. Drugi etap polega na spienianiu powstałego prepolimeru poprzez mieszanie z wodą i ewentualnymi aktywatorami. Otrzymywana jest grupa aminowa i dwutlenek węgla, który jest czynnikiem spieniającym. Grupa aminowa reaguje z grupą izocyjanianową następnego łańcucha. Powstaje wiązanie mocznikowe.

Rys. 14. Schemat reakcji otrzymywania pianek poliuretanowych metodą prepolimerową⁴⁸

Metoda prepolimerowa jest stosowana wówczas, gdy potrzebna jest większa lepkość początkowa polimeru.

30 Metoda jednoetapowa polega na równoczesnym zmieszaniu wszystkich składników, a więc polioli, diiizocyjanianu, wody i czynników aktywujących. Proces może być prowadzony sposobem ciągłym lub periodycznym.

2.2.3. Degradacja poliuretanów

W wielu aplikacjach poliuretanów istotny jest przebieg ich degradacji. Zawartość segmentów sztywnych i giętkich, stopień separacji fazowej oraz rodzaj i ciężar cząsteczkowy użytych polioli ma wpływ na hydrofilowość, a tym samym przebieg degradacji poliuretanów.

Najłatwiej ulegają hydrolizie poliuretany otrzymane z poliestrodioli. Szybkość degradacji wzrasta wraz z wydłużaniem łańcucha poliestru. Bardziej odporne na degradację hydrolityczną są poliuretany zbudowane z poliwęglanów i polieterodioli. Zawartość segmentów sztywnych ma wpływ na degradację enzymatyczną. Wiąże się to z większą ilością wiązań wodorowych, które biorą udział w dezaktywacji potencjalnych miejsc rozpoczęcia degradacji^41,43.

3. Część eksperymentalna

3.1. Wytworzenie materiałów

3.1.1. Surowce

Do syntezy PURM zastosowano następujące substraty:

Diizocyjanian heksametylenu (HDI), Sigma-Aldrich, cz.

HDI jest ciekłą, bezbarwną substancją o drażniącym zapachu, gęstości ρ= 1,047 g/cm³ i masie molowej M=169,19 g/mol. W stanie wolnym jest substancją niebezpieczną, jego dawka śmiertelna wynosi LD₅₀=900mg/kg⁴⁹.

Diizocyjanian 4, 4’-metylenodicykloheksylu (HMDI), Sigma-Aldrich, cz.

HMDI jest ciekłą, bezbarwną substancją o drażniącym zapachu, gęstości ρ= 1,07 g/cm³ i masie molowej M=262,24 g/mol. Ma niską, w porównaniu do HDI toksyczność, jego dawka śmiertelna wynosi LD50=11000mg/kg⁴⁹.

Izocyjanian 3-izocyjanianometylo-3,5,5-trimetylo-cykloheksylowy (IPDI), Sigma- Aldrich, cz.

31 IPDI jest ciekłą, bezbarwną substancją o ostrym, drażniącym zapachu, gęstości ρ= 1,06 g/cm³ i masie molowej M=222,29 g/mol. Dawka śmiertelna wynosi 4825 mg/kg⁴⁹.

Poliol rzepakowy (RZ/2E) wytworzony z oleju rzepakowego w Zakładzie Doświadczalnym ,,Organika” Sp. z o.o

Poliol RZ/2E jest mieszaniną pochodnych trójglicerydu kwasów tłuszczowych (głównie kwasu hydroksyoleinowego pochodzenia roślinnego). Jest on otrzymywany w wyniku epoksydowania nienasyconych wiązań reszt kwasów tłuszczowych, a następnie zastąpieniu grup epoksydowych grupami hydroksylowymi⁵⁰.

Woda destylowana

3.1.2. Otrzymywanie trójwymiarowych podłoży o porowatej architekturze

Syntezę PUR przeprowadzono metodą prepolimerową w masie z wykorzystaniem reaktora próżniowego zaopatrzonego w mieszadło mechaniczne z możliwością regulacji obrotów oraz czujnik temperatury. Stosunek molowy użytych reagentów wynosił 2:1:1 (izocyjanian : poliol : przedłużacz). Metoda prepolimerowa w masie umożliwia kontrolę przebiegu reakcji, a tym samym właściwości końcowego produktu. Synteza prowadzona w masie gwarantuje pełne przereagowanie substancji organicznych. Schemat procesu syntezy prowadzonego w ramach pracy przedstawiono na Rys. 15.

Tworzenie prepolimeru:

+ ^{HO R' OH}

N C O O C N R

NH C

O R N C O

O NH C O

R O C N

O

( )

Przedłużenie łańcucha

N C O + H₂O + O C N

NH C NH O

+ ^CO2

32 Rys. 15. Schemat syntezy poliuretanomoczników⁵⁰

Pierwszy etap syntezy polega na wytworzeniu prepolimeru. Jest to związek złożony z cząsteczek o wysokiej masie cząsteczkowej, rzędu 1000 – 10000 g/mol, zakończonych grupami izocyjanianowymi. Powstaje on dzięki tworzeniu wiązań uretanowych w reakcji cząsteczek poliolu i diizocyjanianu. Po pierwszym etapie reakcja może zostać zatrzymana.

Drugi etap, w którym tworzony jest poliuretan rozpoczyna się po dodaniu małocząsteczkowych związków, które w zależności od funkcyjności mogą pełnić różną rolę.

Jeśli ilość grup funkcyjnych wynosi w nich 2 to dochodzi do przedłużania cząsteczek prepolimeru, jeśli funkcyjność wynosi 2 lub 3, następuje przedłużanie i rozgałęzianie jego cząsteczek, gdy jest większa niż 3 może zachodzić proces sieciowania. W przypadku syntezy poliuretanomoczników (PURM) jako przedłużacza łańcucha używa się wody. Woda dzięki wolnej parze elektronowej reaguje z grupami izocyjanianowymi prepolimeru dając w efekcie dwutlenek węgla i grupę aminową. Grupa aminowa, także dzięki wolnej parze elektronowej reaguje z pozostałymi grupami izocyjanianowymi tworząc wiązanie mocznikowe. PURM powstają także w trakcie reakcji prepolimeru z aminami. W ramach pracy jako przedłużacza użyto wody.

W procesie syntezy poliuretanomoczników wyróżniono następujące kroki:

odwodnienie poliolu w reaktorze w czasie 1h w temperaturze 110 C przy 560 obr/min,

dozowanie izocyjanianu w temperaturze 63 C 2 C,

wytwarzanie prepolimeru w czasie 45 min w temperaturze 60 C 2 C, dozowanie przedłużacza (woda),

mieszanie pod ciśnieniem atmosferycznym i odlewanie mieszanki polimerowej, dodanie chlorku sodu (w stosunku chlorek sodu : poliuretanomocznik 2:1), mieszanie,

aż do otrzymania jednorodnej mieszaniny,

wygrzewanie materiału przez 20 godzin w suszarce laboratoryjnej (temperatura 110 C),

wymywanie soli wodą destylowaną przez 7 dni.

Po wygrzaniu w suszarce laboratoryjnej materiał został wyjęty z foremnika i pocięty na kształtki o grubości ok. 1 cm dla ułatwienia wypłukiwania soli. Tak przygotowane kształtki

33 były mieszane w zlewce przy użyciu mieszadła magnetycznego. Dla przyspieszenia procesu wymywania soli wodę wymieniano kilka razy dziennie. Po wymyciu soli kształtki suszono przez 4 doby w próżniowej suszarce laboratoryjnej.

3.1.3. Wytworzone materiały

W Tab. 1 zamieszczono zestawienie składu i oznaczenia wytworzonych materiałów.

Tab. 1. Wykaz próbek PURM różniących sie użytym izocyjanianem i czasem mieszania prepolimeru z wodą

oznaczenie próbki izocyjanian poliol przedłużacz

czas mieszania prepolimeru z wodą [min]

M11 IPDI RZ/2E H2O 40

M12 IPDI RZ/2E H2O 60

M13 IPDI RZ/2E H2O 80

M21 HDI RZ/2E H2O 10

M22 HDI RZ/2E H2O 20

M23 HDI RZ/2E H2O 30

M31 HMDI RZ/2E H2O 40

M32 HMDI RZ/2E H2O 60

M33 HMDI RZ/2E H2O 80

3.1.4. Sposób przygotowania roztworów i prowadzenia degradacji

W celu oceny bioaktywności i przebiegu degradacji wytworzonych materiałów, przeprowadzono testy w symulowanym płynie fizjologicznym (SBF), o składzie jonowym zbliżonym do składu osocza krwi ludzkiej. Roztwór SBF przygotowano w oparciu o recepturę T. Kokubo charakteryzującą się stężeniem jonów soli nieorganicznych zbliżonym do stężenia w osoczu krwi ludzkiej¹³ (Tab. 2).

Tab. 2. Stosunek jonów w osoczu krwi ludzkiej i płynie SBF

Stężenie [mM]

Na⁺ K⁺ Mg2⁺ Ca²⁺ Cl^- HCO3-

HPO42-

SO42-

Osocze

krwi 142 5 1,5 2,5 103 27 1 0,5

SBF 142 5 1,5 2,5 147,8 4,2 1 0,5

Próbki zanurzone w SBF przechowywane były w temperaturze 37 C w wytrząsarce (60 obr/min). Badania prowadzono metodą dynamiczną, w której roztwór wymieniano co 7 dni,

34 przez cały okres trwania eksperymentu. Rusztowania badano po 1, 2 i 3 miesiącach. Po wyjęciu z roztworu SBF próbki suszono przez 4 doby w suszarce próżniowej w temperaturze 37°C, po czym ponownie zważono. Próbki o wymiarach 10x10x5 mm wycięto z kształtek przy użyciu skalpela, a następnie zważono.

3.2. Metodyka badań

Otrzymane poliuretanomoczniki scharakteryzowano wykorzystując następujące metody i techniki badawcze:

Spektroskopia w podczerwieni (ATR FT-IR) Analiza termograwimetryczna (TGA)

Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC) Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) Analiza dynamiczno-mechaniczna (DMA)

3.2.1. Spektroskopia w podczerwieni

Budowę chemiczną otrzymanych poliuretanomoczników, oraz zmiany zachodzące po ekspozycji w płynie SBF analizowano na podstawie widm absorpcyjnych w podczerwieni, zarejestrowanych na spektrofotometrze Nicolet 6700 (Thermo Electron Corporation) z przystawką ATR (Attenuated Total Reflection). Do badań zastosowano próbki o grubości 4 mm. Każdą próbkę skanowano 64 razy w zakresie liczb falowych 4000-400 cm^-1. Badanie wykonano dla wszystkich materiałów. Obróbkę wyników wykonano w programie Omnic Spectra 2.0 firmy Thermo Nicolet.

3.2.2. Analiza termograwimetryczna

Analizę termograwimetryczną przeprowadzono przy użyciu aparatu marki TA Instruments model Q500. Na podstawie krzywych TGA prowadzono obserwacje zmiany masy w funkcji temperatury próbek w stanie wyjściowym i po ekspozycji w płynie SBF.

Badane próbki o masie 10 ± 1 mg umieszczano na platynowych szalkach i ogrzewano w atmosferze gazu obojętnego z prędkością 10°C/min w zakresie od temperatury pokojowej do 600°C. Badanie wykonano dla materiałów w stanie wyjściowym i po 3-miesięcznej ekspozycji w płynie SBF. Obróbkę wyników wykonano w programie Universal Analysis 2000 wersja 4.7 A firmy TA Instruments.

35 3.2.3. Różnicowa kalorymetria skaningowa

Temperatury przemian fazowych i ich efekty termiczne wyznaczono z zastosowaniem Różnicowego Kalorymetru Skaningowego Q1000 (TA Instrument). Pomiary zostały wykonane w atmosferze helu przy użyciu hermetycznych tygli aluminiowych. Próbki o masie od 7,8 do 8,2 mg ogrzewano z prędkością 10°C/min w zakresie temperatur od -80°C do 200°C. Analizie poddano materiały w stanie wyjściowym i po 3-miesięcznej ekspozycji w płynie SBF. Obróbkę wyników wykonano w programie Universal Analysis 2000 wersja 4.7 A firmy TA Instruments.

3.2.4. Skaningowa mikroskopia elektronowa

Strukturę otrzymanych materiałów scharakteryzowano za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego SEM (Hitachi TM3000). Próbki obserwowane z użyciem mikroskopu elektronowego powinny cechować się odpowiednim przewodnictwem, dlatego przed obserwacją zostały napylone złotem za pomocą napylarki Polaron. Proces prowadzono przez 100 sekund przy natężeniu prądu 6 mA. Obserwacje próbek przeprowadzono przy napięciu przyspieszajacym 15 keV. Próbki przygotowano wycinając równoległoboki o boku ok. 1 cm z użyciem skalpela. Badanie wykonano dla wszystkich materiałów.

3.2.5. Analiza dynamiczno-mechaniczna

Analizę DMA przeprowadzono za pomocą DMAQ500 (TA Instruments). Próbki o wymiarach 10 x 10 x 5 mm (długość x szerokość x grubość) poddawano cyklicznemu ściskaniu, zadając odkształcenie 10% w temperaturze 37°C. Dynamiczne właściwości termomechaniczne, takie jak moduł stratności (E”), moduł zachowawczy sprężystości (E’), oraz mechaniczne tłumienie (tanδ), charakteryzują zachowanie się materiału poddawanego działaniu okresowo przykładanej siły. Poznanie tych właściwości jest szczególnie ważne w momencie, gdy właściwości mechaniczne zmieniają się bądź to w funkcji temperatury, bądź częstotliwości¹⁵. Analizie DMA poddano materiały w stanie wyjściowym i po 3-miesięcznej ekspozycji w płynie SBF. Obróbkę wyników wykonano w programie Universal Analysis 2000 wersja 4.7 A firmy TA Instruments.

36 3.3. Wyniki badań i dyskusja

3.3.1. Charakterystyka budowy chemicznej

W celu określenia budowy chemicznej otrzymanych materiałów poliuretanowych oraz warstw apatytowych wytrąconych na tych materiałach w wyniku zanurzenia w SBF, wykorzystano spektroskopię w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR).

Analiza FTIR stanu wyjściowego

Analiza FT-IR jest potwierdzeniem występowania w otrzymanych materiałach grup charakterystycznych dla poliuretanomoczników. Na Rys. 16 przedstawiono reprezentatywne widmo FT-IR dla materiału M33.

Rys. 16. Reprezentatywne widmo FT-IR materiału M33

W przedziale 3500-3100 cm^-1 występują sygnały będące wynikiem drgań rozciągających symetrycznych i asymetrycznych grupy N-H występującej w ugrupowaniu uretanowym i pochodnych mocznikowych. Pasmo dla liczby falowej 1539 cm^-1 świadczy o drganiach deformacyjnych nożycowych tejże grupy. Pasma dla liczb falowych 2917 cm^-1 i 2850 cm^-1 pochodzą od drgań rozciągających asymetrycznych i symetrycznych grupy –CH, ta sama grupa daje pasmo dla wartości 1448 cm^-1 będące skutkiem drgań deformacyjnych symetrycznych. Sygnały 1739 cm^-1 i 1650 cm^-1 świadczą o obecności grup karbonylowych C=O w ugrupowaniach -O-CO-NH-R i RC(O)NHR1. W przedziale 1226-1093 cm^-1

37 występują sygnały wynikające z drgań rozciągających grupy C-O i C-N występujących w poliuretanomocznikach. Wyniki analizy wszystkich materiałów zestawiono w Tab. 3, 4, 5.

Tab. 3. Zestawienie wyników FT-IR dla M33 Liczba

falowa [cm^-1] Wiązanie (drganie) Komentarz

3500 N-H (asymetryczne rozciągające)

obecność ugrupowań mocznikowych i poliuretanowych

3400 N-H (symetryczne rozciągające)

obecność ugrupowań mocznikowych i poliuretanowych

3350-3310 N-H (rozciągające)

obecność ugrupowań alofaniowych i biuretowych

2917 C-H (asymetryczne rozciągające) Obecność grup CH 2850 C-H (symetryczne rozciągające) Obecność grup CH

1739 C=O (rozciągające) obecność grupy estrowej RC(O)OR

1650 C=O (rozciągające) obecność grupy RC(O)NHR

1539 N-H (deformacyjne, nożycowe)

obecność ugrupowań mocznikowych i uretanowych

1448 C-H (deformacyjne, symetryczne) Obecność grup CH

1226-1093 C-N, C-O (rozciągające)

obecność ugrupowań mocznikowych i poliuretanowych