IN VITRO LEVEL OF L-ASCORBIC ACID RADICAL IN LENSES OF PATIENTS WITH SENILE OR DIABETIC CATARACT – PRELIMINARY STUDY
Katedra i Klinika Okulistyki Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie al. Powstańców Wlkp. 72, 70-111 Szczecin
Kierownik: prof. dr hab. n. med. Danuta Karczewicz
1 Zakład Fizyki Medycznej Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie ul. Ku Słońcu 12, 71-073 Szczecin
Kierownik: dr n. med. Wojciech Podraza
Summary
Introduction: To estimate the in vitro level of L-ascorbic acid radical in lenses of patients with senile or diabetic cataract using EPR (Electron Paramagnetic Resonance) spectroscopy.
Material and methods: 24 human cataractous nuclei obtained during extracapsular removal were used. 5 of them (21%) were from diabetic patients. The analysis was carried out at the Department of Medical Physics of the Pomera-nian Medical University using EPR spectroscopy. The in vitro level of L-ascorbic acid radical was calculated as the number of unpaired spins in the lens calculated in units · 1016/gram (spin/g), which is proportional to the in vivo level of vitamin C in lenses.
Results: The average L-ascorbic acid radical level in lenses of diabetic patients amounted 0.53 · 1016 spin/g ± 0.22 · 1016 spin/g, and was lower than in group of non-dia-betic patients in which it ranged 0.87 · 1016 spin/g ± 0.31 · 1016 spin/g (p = 0.036). There was no signifi cant correlation between L-ascorbic acid radical level and sex, age or visual acuity in these two groups of patients.
Conclusions: 1. EPR spectroscopy can be used to determine the in vitro level of L-ascorbic acid radical in human lenses. 2. The in vitro L-ascorbic acid radi-cal level in cataract lenses of patients with diabetes was lower than in patients without diabetes. 3. Lower in vitro
level of L-ascorbic acid radical in lenses of patients with diabetes means lower in vivo level of vitamin C, what suggests an increased intensity of free radical reactions in the group of patients with diabetes than in the group without diabetes.
K e y w o r d s: EPR spectroscopy – cataract – free radi-cals – vitamin C.
Streszczenie
Wstęp: Celem pracy było oznaczenie zawartości rodni-ka askorbylowego in vitro w soczewrodni-kach z zaćmą starczą i cukrzycową przy wykorzystaniu metody spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego (Electron Paramagnetic Resonance – EPR).
Materiał i metody: Do badań wykorzystano 24 soczewki usunięte z powodu zaćmy w Klinice Okulistyki PAM; 5 so-czewek (21%) pochodziło od pacjentów, którzy jednocześnie chorują na cukrzycę. Pomiary przeprowadzono, używając spektrometru EPR typ SE/X 2544. Określono zawartość in vitro wolnego rodnika askorbylowego, którego substratem in vivo jest witamina C.
Wyniki: W soczewkach pacjentów chorych na cukrzycę średni poziom rodnika askorbylowego wynosił 0,53 · 1016 spin/g ± 0,22 · 1016 spin/g i był statystycznie istotnie niższy
66 WOJCIECH GOSŁAWSKI, KATARZYNA MOZOLEWSKA-PIOTROWSKA, BOLESŁAW GONET I WSP.
niż w grupie bez cukrzycy, gdzie wyniósł 0,87 · 1016 spin/g ± 0,31 · 1016 spin/g (p = 0,036). Nie stwierdzono statystycznie istotnej różnicy poziomu rodnika askorbylowego w grupach z cukrzycą i bez cukrzycy w zależności od płci, ostrości wzroku oraz od wieku.
Wnioski: 1. Do określenia zawartości witaminy C in vivo w soczewkach ludzkich można wykorzystać metodę spek-troskopii EPR. 2. W soczewkach z zaćmą u osób chorych na cukrzycę badanych in vitro stwierdzono istotnie niższy poziom rodnika askorbylowego w porównaniu z osobami bez cukrzycy. 3. Obniżony poziom rodnika askorbylowego in vitro w soczewkach osób z cukrzycą oznacza obniżony poziom witaminy C w soczewce in vivo, co może sugerować większe natężenie reakcji wolnorodnikowych w porównaniu z pacjentami bez cukrzycy.
H a s ł a: spektroskopia EPR – zaćma – wolne rodniki – witamina C.
Wstęp
Istnieje wiele hipotez na temat przyczyn powstawania zaćmy. Jedną z nich jest teoria niszczącego działania reak-tywnych form tlenu [1, 2, 3]. Głównym źródłem wolnych rodników tlenowych w soczewce są reakcje fotochemiczne.
Rogówka absorbuje tylko promieniowanie o długości fali poniżej 290 nm, fale o większej długości swobodnie do-chodzą do powierzchni soczewki [4]. Chromatofory obecne w prawidłowej i zmętniałej soczewce, np. 3-hydroksyky-nurenina, są zdolne do inicjowania procesów fotooksy-dacyjnych, w wyniku których dochodzi do powstawania anionorodników ponadtlenkowych, tlenu singletowego, a następnie rodników hydroksylowych. Ich szkodliwe działanie na białka, lipidy i kwasy nukleinowe kumulu-je się wraz z wiekiem, zwłaszcza, że w miarę starzenia organizmu dochodzi w soczewce do obniżenia poziomu glutationu i kwasu askorbinowego, które są jej głównymi antyutleniaczami [1, 3, 5, 6, 7].
Wolne rodniki są uważane także za jeden z głównych czynników patogenetycznych w cukrzycy i zaćmie cukrzy-cowej [8, 9]. Istnieją doniesienia, że wysoki poziom glukozy nasila in vitro reakcje wolnorodnikowe w soczewkach [9].
Opublikowano także prace [10, 11, 12], w których donoszono o korzystnym wpływie witaminy C i innych antyoksydantów na spowolnienie rozwoju zaćmy starczej. W pracach tych nie oceniano jednak zawartości witaminy C w soczewkach, a jedynie jej poziom we krwi oraz diecie badanych osób.
Do badania reakcji wolnorodnikowych stosuje się meto-dy wykorzystujące spektroskopię elektronowego rezonansu paramagnetycznego (Electron Paramagnetic Resonance – EPR) [5, 9, 13, 14, 15]. Jedną z nich jest wolnorodnikowa metoda oznaczania witaminy C w tkankach, pozwalająca na przeprowadzanie badań in vitro bez użycia szkodliwych dla ludzi substancji trapujących [13, 14, 15]. Podstawą ozna-czeń jest fakt, że w warunkach in vitro, w próbkach
tka-nek organizmów żywych poddanych liofi lizacji i badanych z dostępem powietrza, obserwuje się wyraźny sygnał EPR, którego źródłem jest wolny rodnik askorbylowy powstający z kwasu L-askorbinowego (wit. C).
W warunkach in vivo kwas askorbinowy występuje w postaci anionu askorbinianowego, który wykazuje silne właściwości redukcyjne wobec wolnych rodników i blokuje ich zdolności oksydacyjne, co nazywane jest zmiataniem (scavenger). W wyniku tego procesu powstaje wolny rodnik askorbowy, względnie mało reaktywny z uwagi na silną delokalizację wolnego elektronu w wiązaniach pi. Większe nasilenie reakcji wolnorodnikowych in vivo będzie więc powodowało zwiększone przechodzenie anionu askorbi-nianowego do rodnika askorbowego, co spowoduje zmniej-szenie zawartości kwasu askorbinowego (wit. C). In vitro niższe stężenie rodnika askorbylowego skutkuje słabszym sygnałem EPR [13, l4, 15].
Celem pracy była próba określenia nasilenia reakcji wolnorodnikowych w soczewkach z zaćmą starczą i cu-krzycową na podstawie zawartości rodnika askorbylowego mierzonej in vitro metodą spektroskopii EPR.
Materiał i metody
Do badań wykorzystano 24 soczewki usunięte z powodu zaćmy metodą zewnątrztorebkową w Klinice Okulistyki PAM; 5 soczewek (21%) pochodziło od pacjentów, którzy jednocześnie chorują na cukrzycę. Średnia wieku pacjentów w momencie zabiegu wynosiła 65,2 ± 10,6 lat dla chorych z cukrzycą i 67 ± 12 lat dla chorych bez cukrzycy. W badanej grupie było 14 kobiet i 10 mężczyzn, przy czym kobiety stanowiły 60% w grupie z cukrzycą i 58% w grupie bez cukrzycy, a mężczyźni odpowiednio 40% i 42%. Ostrość wzroku w oczach z zaćmą wynosiła w obu grupach śred-nio 4/50. W 15 przypadkach (62,5%) zmętnienie soczewki obejmowało głównie jądro, w 6 przypadkach (25%) korę i w 3 przypadkach tylną torebkę (12,5%).
Soczewki, bezpośrednio po usunięciu z oka pacjen-ta, były umieszczane w probówce i oziębiane w ciekłym azocie do temperatury -180°C w celu zahamowania ich metabolizmu oraz przygotowania do liofi lizacji. Liofi lizacja trwała 3 godz. i odbywała się w liofi lizatorze LGA 05, po czym soczewki umieszczano w porcelanowych parow-nikach i rozcierano na proszek. Po upływie godziny próbki były ważone i umieszczane w cienkościennych kapila-rach kwarcowych o średnicy 4,8 mm. Właściwe pomiary przeprowadzano w Zakładzie Fizyki Medycznej PAM, wg opracowanej tam metodyki [13], używając spektrometru EPR typ SE/X 2544 produkcji Radiopan – Poznań, przy zachowaniu następujących warunków pomiaru: komo-ra rezonansowa RCX 660, częstotliwość 9,45 GHz, moc mikrofal ~3 mW, amplituda modulacji 100 kHz/0,2 mT, scan 20 mT/2 min, wzmocnienie 1 × 104. Uzyskiwano wykres sygnału EPR, będący pierwszą pochodną krzywej absorpcji próbki.
POZIOM RODNIKA ASKORBYLOWEGO IN VITRO W SOCZEWKACH Z ZAĆMĄ STARCZĄ I CUKRZYCOWĄ 67 W celu scharakteryzowania próbek wyznaczono
na-stępujące parametry sygnału EPR:
Δ B
1. pp (mT) – szerokość linii będąca szerokością międzypikową pierwszej pochodnej sygnału EPR.
I
2. rel – integralna intensywność względna sygnału uzyskana z porównania pola powierzchni pod krzywą ab-sorpcji próbki do pola powierzchni pod krzywą abab-sorpcji wzorca DPPH (diphenylopicrylohydrazyl)
gdzie: I0 – amplituda sygnału (w mm) w przeliczeniu na 10 mg suchej próbki.
N – liczba niesparowanych spinów przypadająca 3.
na 1 g próbki obliczona na podstawie wzorca DPPH, który zawiera 2,15 · 1016 spinów w każdym gramie.
N = Irel · 2,15 · 1016 spin/g
Opierając się na wartości N zbadano zależności poziomu rodnika askorbylowego od wieku, płci, ostrości wzroku przed zabiegiem oraz obecności lub braku cukrzycy.
Do analizy statystycznej otrzymanych wyników wy-korzystano następujące testy:
Test t-Studenta dla dwóch średnich z prób nieza-1.
leżnych, zweryfikowany dla poziomu istotności p < 0,05 oraz n + m - 2 stopni swobody, po sprawdzeniu, czy próby pochodzą z populacji o rozkładzie normalnym (testem Shapiro–Wilka), oraz zweryfikowaniu hipote-zy o równości wariancji (test F-Snedecora dla dwóch wariancji).
Współczynnik korelacji rang Spearmana.
2.
Test rangowanych znaków oraz test Wilcoxa dla 3.
prób niezależnych weryfi kowany dla poziomu istotności p < 0,05.
Wyniki
Średni poziom rodnika askorbylowego in vitro w ba-danych soczewkach wynosił 0,8 · 1016 spin/g ± 0,33 · 1016 spin/g, przy czym wyniki wahały się od 0,3 · 1016 spin/g do 1,37 · 1016 spin/g. W soczewkach pacjentów chorych na cukrzycę średni poziom rodnika askorbylowego wy-nosił 0,53 · 1016 spin/g ± 0,22 · 1016 spin/g i był niższy niż w grupie bez cukrzycy, gdzie wyniósł 0,87 · 1016 spin/g ± 0,31 · 1016 spin/g. Pomimo małej liczebności grup stwier-dzona różnica była istotna statystycznie przy poziomie istotności p = 0,036. Nie stwierdzono natomiast staty-stycznie istotnych różnic w zawartości rodnika pomiędzy kobietami a mężczyznami w badanych grupach (tab. 1).
Nie wykazano także istotnych zależności pomiędzy po-ziomem badanego rodnika a ostrością wzroku (tab. 2) lub wiekiem pacjentów (tab. 3) w momencie usuwania zmęt-niałej soczewki. Obserwacje te wymagają potwierdzenia na większej grupie pacjentów.
T a b e l a 1. Poziom rodnika askorbylowego w grupie z cukrzycą i bez
n – liczba pacjentów / number of patients
T a b e l a 2. Poziom rodnika askorbylowego w zależności od ostrości wzroku przed zabiegiem w grupach z cukrzycą i bez cukrzycy
(spin/g)
T a b l e 2. Level of L-ascorbic acid radical in relation to preoperative visual acuity in groups of diabetic and non-diabetic patients (spin/g)
Ostrość wzroku 0,5/50–1,5/50 0,63 · 1016
n = 1
n – liczba pacjentów / number of patients
Dyskusja
Wolne rodniki uważane są za jeden z podstawowych czynników patogenetycznych zarówno w zaćmie starczej, jak i cukrzycowej [9]. W cukrzycy jednak zmętnienie so-czewki pojawia się wcześniej i postępuje znacznie szybciej niż u osób bez tej choroby. Zmiany zachodzące w soczewce pod wpływem wolnych rodników dotyczą białek, lipidów i kwasów nukleinowych, przy czym kolejność i
dokład-68 WOJCIECH GOSŁAWSKI, KATARZYNA MOZOLEWSKA-PIOTROWSKA, BOLESŁAW GONET I WSP.
ny mechanizm tych procesów nie został jeszcze do końca wyjaśniony. Uważa się, że decydującymi dla powstania zaćmy korowej są uszkodzenia nabłonka soczewki, polega-jące na uszkodzeniach białek błonowych, czynności pompy sodowo-potasowej oraz peroksydacji lipidów, co w efekcie doprowadza do znacznej zmiany przepuszczalności błon komórkowych i zaburzenia gospodarki wodnej soczewki [2, 3, 4]. W zaćmie jądrowej natomiast nie stwierdza się zmian w zawartości wody, a za główny mechanizm zmętnienia soczewki uważa się tworzenie agregatów białkowych. Wolne rodniki tlenowe powodują utlenianie grup sulfhydrylowych białek i powstawanie mostków dwusiarczkowych, zwłasz-cza w obrębie alfa-krystalin ze względu na dużą zawartość grup -SH [3, 4].
Głównymi antyutleniaczami soczewki są glutation i kwas askorbinowy. Ich stężenia w tkankach oka są bardzo wysokie i np. stężenie witaminy C w cieczy wodnistej jest prawie 20-krotnie wyższe niż we krwi [4]. Stężenie substancji antyoksydacyjnych w soczewce (dysmutazy ponadtlenkowej, peroksydazy glutationowej, askorbinia-nowej reduktazy wolnych rodników oraz witaminy C) zmniejsza się wraz z wiekiem i narastaniem zmętnienia soczewki, co może być przyczyną wzrostu natężenia reakcji wolnorodnikowych w starszym wieku [1, 2, 3, 4, 6]. W badaniach własnych obie porównywane grupy, z cukrzycą i bez cukrzycy, nie różniły się pod względem wieku, rodzaju i stopnia zmętnienia soczewki (ostrość wzroku).
W soczewkach i ciele szklistym pacjentów z cukrzycą stwierdzono istotnie mniejszą zawartość białek z czynnymi grupami sulfhydrylowymi [8]. Białka soczewki były utle-nione w większym stopniu u pacjentów z zaawansowanymi cukrzycowymi powikłaniami ze strony siatkówki i
towa-T a b e l a 3. Poziom rodnika askorbylowego w zależności od wieku w grupach z cukrzycą i bez cukrzycy (spin/g)
T a b l e 3. Level of L-ascorbic acid radical in relation to the age in groups of diabetic and non-diabetic patients (spin/g)
Wiek
Below 50 years old
0,93 · 1016
n – liczba pacjentów / number of patients
rzyszyło temu obniżenie poziomu kwasu askorbinowego [8]. Jest to zgodne z otrzymanymi wynikami, w których stwierdzono istotne obniżenie poziomu rodnika askorby-lowego in vitro (co oznacza zmniejszenie zawartości wit. C in vivo) w soczewkach pacjentów z cukrzycą. Jednocze-śnie istnieją doniesienia na temat wpływu stężenia glukozy na powstawanie wolnych rodników w tkance soczewkowej.
W badaniach in vitro stwierdzono wzrost natężenia reakcji wolnorodnikowych przy podwyższeniu stężenia glukozy w roztworze [9, 15]. Pozwala to przypuszczać, że stwier-dzone w naszym przypadku obniżenie poziomu rodnika askorbylowego może świadczyć o większym natężeniu reakcji wolnorodnikowych w soczewkach z zaćmą u pa-cjentów chorych na cukrzycę. Obserwacje te wymagają potwierdzenia na większej grupie pacjentów.
Wnioski
Do określenia zawartości witaminy C in vivo w so-1.
czewkach ludzkich można wykorzystać metodę spektro-skopii EPR.
W soczewkach z zaćmą u osób chorych na cukrzy-2.
cę badanych in vitro stwierdzono istotnie niższy poziom rodnika askorbylowego w porównaniu z osobami bez cu-krzycy (p = 0,036).
Niższy poziom rodnika askorbylowego in vitro 3.
w soczewkach osób z cukrzycą w porównaniu z pacjen-tami bez cukrzycy oznacza niższy poziom wipacjen-taminy C w soczewce in vivo, co może sugerować większe natężenie reakcji wolnorodnikowych w soczewkach osób chorych na cukrzycę.
Piśmiennictwo
Jarmak A
1. .: Biochemiczne aspekty tworzenia się zmętnień soczewki.
Klin. Oczna, 1995, 97 (11–12), 348–352.
Kałużny J.J., Kałużny J
2. .: Współczesne poglądy na patogenezę i moż-liwości profi laktyki zaćmy starczej. Pol. Merkur. Lekarski, 1997, 2 (7), 76–77.
Marak G.E., de Kozak Y., Faure J.P
3. .: Free radicals and antioxidants
in the pathogenesis of eye diseases. Adv. Exp. Med. Biol. 1990, 264, 513–527.
Kałużny J.J., Jurgowiak M
4. .: Udział reaktywnych form tlenu w patoge-nezie wybranych chorób oczu. Klin. Oczna, 1996, 98 (2), 145–149.
Dillon J., Ortwerth B.J., Chignell C.F., Reszka K.J
5. .: Electron
paramag-netic resonance and spin trapping investigation of the photoreactivity of human lens proteins. Photochem. Photobiol. 1999, 69 (2), 259–264.
Jacques P.F., Chylack L.T. Jr, McGandy R.B., Hartz S.C
6. .: Antioxidant
status in persons with and without senile cataract. Arch. Ophthalmol.
1988, 106 (3), 337–340.
Reszka K.J., Bilski P., Chignell C.F., Dillon J
7. .: Free radical reactions
photosensitised by the human lens component, kynurenine: an EPR and spin trapping investigation. Free Radic. Biol. Med. 1996, 20 (1), 23–34.
Altomare E., Grattagliano I., Vendemaile G., Micelli-Ferrari T., 8.
Signorile A., Cardia L.: Oxidative protein damage in human diabetic eye: evidence of retinal participation. Eur. J. Clin. Invest. 1997, 27 (2), 141–147.
POZIOM RODNIKA ASKORBYLOWEGO IN VITRO W SOCZEWKACH Z ZAĆMĄ STARCZĄ I CUKRZYCOWĄ 69
Ansari N.H., Wang L., Erwin A.A., Church D.F
9. .: Glucose-dependent
formation of free radicals species in lens homogenate. Biochem. Mol.
Med. 1996, 51 (1), 68–71.
Valero M.P., Fletcher A.E., De Stavola B.L., Vioque J., Alepuz V.Ch
10. .:
Vitamin C is assotiated with reduced risk of cataract in a Mediterranean population. J. Nutr. 2002, 132 (6), 1299–1306.
Chylack L.T., Brown N.P., Bron A., Hurst M., Kopcke W., Thien U. et al.
11. :
The Roche European American Cataract Trial (REACT): a randomized clinical trial to investigate the effi cacy of an oral antioxidant micronu-trient mixture to slow progression of age-related catarct. Ophthalmic.
Epidemiol. 2002, 9 (1), 49–80.
Taylor A., Jacques P.F., Chylack L.T. Jr, Hankinson S.E., Khu P.M., 12.
Rogers G. et al.: Long-term intake of vitamins and carotenoids and odds of early age-related cortical and posterior subcapsular lens opacities.
Am. J. Clin. Nutr. 2002, 75 (3), 540–549.
Gonet B
13. .: Free-radical method for L-ascorbic acid determination in tissues of experimental animals. Curr. Top. Biophys. 1998, 18 (2), 202–204.
Gonet B
14. .: Wolne rodniki i witamina C a choroby sercowo-naczyniowe i nowotwory. Czyn. Ryz. 1998, 2–21.
Domek H
15. .: Witamina C jako wskaźnik reakcji wolnorodnikowych w cu-krzycy. [Maszynopis powielany] Pom. Akad. Med. Szczecin 1995.
A N N A L E S A C A D E M I A E M E D I C A E S T E T I N E N S I S
R O C Z N I K I P O M O R S K I E J A K A D E M I I M E D Y C Z N E J W S Z C Z E C I N I E 2008, 54, 2, 70–76
RAFAŁ RYŚKIEWICZ, ELŻBIETA GAWRYCH¹