Medycyna Weterynaryjna - Summary Medycyna Wet. 62 (10), 1158-1163, 2006

Praca oryginalna Original paper

Promieniowanie generowane przez lasery niskoener-getyczne ma dzia³anie biostymulacyjne na uszkodzo-ne tkanki. Pod wp³ywem promieni lasera powstaje kaskada zmian w tkankach wywo³ana absorpcj¹ foto-nów przez uk³ad oddechowy komórek (m.in. oksyda-zê cytochromow¹, NAD), co przyspiesza reakcje utle-niania i redukcji, a efektem tego jest wzrost zasobów energetycznych w komórkach. Pod wp³ywem naœwiet-lania zwiêksza siê transport jonów Ca2+_{, potasu i sodu}

przez b³onê komórkow¹, tak¿e wzrasta aktywnoœæ Na+_/K+ _{ATP-azy. W komórkach wzrasta synteza}

bia-³ek oraz synteza DNA i RNA, co w dalszej kolejnoœci powoduje proliferacjê komórek (15). Przyjmuje siê, ¿e promieniowanie w zakresie œwiat³a widzialnego ma korzystny wp³yw na mitochondria i funkcjonowanie ³añcucha oddechowego, a promieniowanie w zakresie podczerwieni wp³ywa stymuluj¹co na b³ony komór-kowe, zwiêkszaj¹c aktywn¹ wymianê jonów (12). Pod wp³ywem naœwietlania dochodzi do aktywacji uk³adu dope³niacza (27), co powoduje m.in. wzrost

przepusz-czalnoœci naczyñ i pobudzenie fagocytozy przez gra-nulocyty obojêtnoch³onne i monocyty. Ponadto ko-rzystnie wp³ywa na mikrokr¹¿enie i neoangiogenezê w uszkodzonych tkankach przez przyspieszenie proli-feracji komórek œródb³onka naczyñ (4) lub za poœred-nictwem czynników wzrostu (m.in., TGFb) (12).

Badania przeprowadzone na hodowlach komórek prekursorowych miêœni oraz izolowanych w³óknach miêœniowych wykaza³y, ¿e œwiat³o lasera pobudza ak-tywnoœæ i zwiêksza gromadzenie siê komórek sateli-tarnych w miejscach uszkodzenia w³ókien oraz proli-feracjê mioblastów (2, 24-26), hamuje natomiast ró¿-nicowanie siê komórek miogenicznych (2, 25). Pobu-dzenie komórek satelitarnych bêd¹cych w fazie spo-czynku i aktywnoœci proliferacyjnej komórek mioge-nicznych nastêpuje w wyniku aktywacji bia³kowych kinaz MAP/ERK (25). Kinazy pobudzaj¹ syntezê nukleotydów i bia³ek, transkrypcjê protoonkogenów, powoduj¹ rozluŸnienie struktury chromatyny i stymu-luj¹ translacjê (24). Dowiedziono równie¿, ¿e

pro-Wp³yw œwiat³a lasera

na regeneracjê w³ókien miêœniowych u œwiñ

MAREK PODBIELSKI, IWONA OTROCKA-DOMAGA£A, TADEUSZ ROTKIEWICZ

Zespó³ Anatomii Patologicznej Katedry Patologii i Farmakologii Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UWM, ul. Oczapowskiego 13, 10-718 Olsztyn

Podbielski M., Otrocka-Domaga³a I., Rotkiewicz T.

Effects of laser light on regenerating muscle fibres in pigs Summary

The aim of the study was to monitor the effects of radiation emitted by a low energy laser on regenerating the musculus longissimus lumborum in pigs. The muscle was damaged through injections of 10 cm3 _{of a 0.5%}

bupivacain solution. Analyses were carried out on 34 wbp gilts aged 10 weeks, with an average body weight of 20 kg. Infrared radiation was applied for 5 days at a wavelength of 830 nm emitted by a 100 mW laser with an energy density of 4 J/cm2_{. The animals were euthanized 6, 12, and 24 hours as well as 2, 3, 4, 5, 7, 10 and 14}

days after muscle damage. Muscle specimens were subjected to histopathology (HE, PAS acc. to McManus, HBFP, Feulgena, Unny), ultrastructure (TEM) and immunohistochemical analyses (PCNA, desmin, vimentin). Extensive blood extravasations were observed in the experimental pigs at the bupivacain injection site, which – after laser therapy – remained up to the second day, and in the control group – up to the fourth day of the experiment. Induced necrosis of muscle fibres was present up to day 14 in the control group and up to day 5 of the study in the experimental group. Numerous oval and fusiform, desmino positive and myoblasts were observed in the laser radiation-stimulated muscles as early as from day 2 of the experiment. Myoblasts were sporadic on day 2 in the control group, and it was observed that their number increased beginning from day 3. Myotubes and infrequent young fibres were observed in the experimental group as early as on day 3, and in the control group – on day 4. The results obtained indicate that bio-stimulation with laser light accelerates the regeneration process of necrosis muscle fibres due to more efficient phagocytosis of extravasated blood cells and necrosis of muscle fibres as well as the proliferation of myogenic cells. A substantially weaker effect of bio-stimulation was observed as far as the process of myoblast differentiation and growth of newly formed muscle fibres were concerned.

mieniowanie lasera chroni komórki miogeniczne przed apoptoz¹ (26).

Do tej pory przeprowadzono nieliczne badania nad wp³ywem œwiat³a emitowanego przez urz¹dzenia la-serowe na regeneracjê miêœni u zwierz¹t. Doœwiad-czenia takie wykonywano na szczurach (1, 30), ropu-chach (4, 5) i œwinkach morskich (8-11). W badaniach tych u¿ywano laseru helowo-neonowego (He-Ne), a uzyskane wyniki wskazywa³y na korzystny wp³yw na regeneracjê uszkodzonego miêœnia szkieletowego. Stosowanie laserów He-Ne u œwiñ jest nieuzasadnio-ne, ze wzglêdu na niewielk¹ g³êbokoœæ przenikania wi¹zki promieni do naœwietlanej tkanki. Dlatego ce-lowe jest zastosowanie laserów pó³przewodnikowych emituj¹cych œwiat³o o d³ugoœci fali 810, 830 i 904 nm, które przenika g³êboko do tkanek.

Celem badañ by³o przeœledzenie procesu regenera-cji miêœnia najd³u¿szego lêdŸwi musculus longissimus lumborum u œwiñ w oparciu o metody histopatologicz-ne, ultrastrukturalne i immunohistochemiczne po wy-wo³aniu eksperymentalnej martwicy w³ókien miêœnio-wych i zastosowaniu promieniowania emitowanego przez laser o niskiej mocy.

Materia³ i metody

Doœwiadczenie przeprowadzono za zgod¹ Lokalnej Ko-misji Etycznej (decyzja nr 24/2006/N) na losowo wybra-nych 34 loszkach rasy wbp. w wieku 10 tygodni o œredniej masie cia³a 20 kg, które podzielono na dwie grupy. Loszki ¿ywiono mieszank¹ pe³noporcjow¹ PT-1, zgodnie z nor-mami stosowanymi przy wychowie prosi¹t po odsadzeniu. Paszê zadawano dwa razy dziennie. Zwierzêta mia³y sta³y dostêp do wody. Grupa I – kontrolna obejmowa³a 17 pro-si¹t, u których do miêœnia najd³u¿szego lêdŸwi (m. longis-simus lumborum) wstrzykniêto po 10 cm3 _{0,5% markainy}

(chlorek bupiwakainy) produkcji Astra. Iniekcji œrodka znie-czulaj¹cego dokonywano po obu stronach krêgos³upa – po lewej stronie na wysokoœci 1-2 krêgu lêdŸwiowego oraz po stronie prawej na wysokoœci 4-5 krêgu lêdŸwiowego. Gru-pa II obejmowa³a równie¿ 17 prosi¹t, którym wstrzykniêto podobnie jak w grupie I markainê i dodatkowo zastosowa-no naœwietlanie promieniami podczerwonymi o d³ugoœci fali 830 nm emitowane przez laser. Wykonano po 5 zabie-gów przez 5 kolejne dni. Naœwietlania wykonywano meto-d¹ kontaktow¹, wykorzystuj¹c do tego celu laser CTL-1106 MX produkcji Laser Instruments. U¿ywany laser mia³ moc 100 mW, a gêstoœæ energii, jak¹ zastosowano, wynosi³a 4 J/cm2_{. Ka¿dorazowo naœwietlano powierzchniê o}

œredni-cy 2,5 cm. Pole tej powierzchni wyliczono ze wzoru: Ð · d2

S = = 4,90 cm2

4

gdzie S – pole powierzchni, a d – œrednica zmiany. Na tej podstawie obliczono czas ekspozycji naœwietla-nych tkanek na œwiat³o lasera, wyznaczaj¹c uprzednio wiel-koœæ zastosowanej energii:

4 J · 4,90 cm2

E =

ò

gdzie E – energia,

ò

E 19 600 mJ

t = _P = _{100 mW} = 196 sek. = 3 min. i 16 sek. gdzie t – czas, E – energia, P – moc lasera.

Pierwsze naœwietlanie wykonano po up³ywie 18 godzin od podania markainy, ka¿de nastêpne po up³ywie kolejnej doby.

Zwierzêta uœmiercano preparatem morbital po up³ywie 6, 12, i 24 godzin (po jednej sztuce) oraz po 2, 3, 4, 5, 7, 10 i 14 dniach (po dwie sztuki) po podaniu bupiwakainy. Bez-poœrednio po œmierci pobierano wycinki miêœni do bada-nia laboratoryjnego.

Badanie histopatologiczne. Pobrane wycinki miêœnia najd³u¿szego lêdŸwi utrwalano w buforowanej 10% for-malinie, a nastêpnie zatapiano w bloczki parafinowe. Uzyskane skrawki mikrotomowe z przekrojów pod³u¿nych i poprzecznych miêœnia barwiono HE, metod¹ PAS wg McManusa, metod¹ HBFP (Haematoxylin-Basic Fuchsin Picric Acid) oraz metodami Unny i Feulgena (13) w celu oznaczania kwasów nukleinowych. W preparatach sporz¹-dzonych z miêœni zwierz¹t uœmierconych w 7., 10. i 14. dniu, dokonano pomiarów pola powierzchni w³ókien miêœ-niowych w obszarze regeneracji. Pomiarów dokonano przy u¿yciu zestawu do komputerowej analizy obrazu skopowego, z³o¿onego z kamery Panasonic CCD, mikro-skopu Carl Zeiss Jena, karty akwizycji obrazu oraz progra-mu komputerowego LUCIA 3,52.

Analizê statystyczn¹ uzyskanych wyników przeprowa-dzono metod¹ analizy wariancji (test F) dla doœwiadczeñ jedno- i dwuczynnikowych. Do badania istotnoœci ró¿nic œrednich pól powierzchni badanych w³ókien miêœniowych zastosowano test q SNK (Studenta-Newmana-Keulsa).

Badania ultrastrukturalne. W grupie I do badania mikroskopowo-elektronowego pobierano wycinki miêœni od œwiñ uœmierconych po up³ywie 12 godzin oraz 4 i 7 dniach od podania markainy. W grupie II do badañ pobie-rano wycinki od prosi¹t uœmiercanych po 4 i 7 dniach. Wycinki miêœni utrwalano w 2,5% paraformaldehydzie i 2% aldehydzie glutarowym w buforze fosforanowym o pH 7,4 oraz p³ukano w buforze przez 24 godziny. Nastêp-nie materia³ powtórNastêp-nie utrwalano 2% czterotlenkiem osmu w buforze fosforanowym o pH 7,4, odwadniano w ci¹gu alkoholi i acetonie, i zatapiano w Eponie 812. Uzyskane skrawki ultracienkie barwiono standardowo i przegl¹dano przy pomocy mikroskopu elektronowego typu TESLA BS 500.

Badanie immunohistochemiczne. W badaniach okreœ-lano zachowanie siê wimentyny, desminy i PCNA (prolife-rating cell nuclear antigen). Do barwienia u¿yto przeciw-cia³ monoklonalnych, mysich, przeznaczonych dla skraw-ków parafinowych. Przeciwcia³a anty-PCNA (DAKO) sto-sowano w rozcieñczeniu 1 : 150, zaœ przeciwcia³a anty-desminowe (DAKO) i anty-wimentynowe (DAKO) stoso-wano w rozcieñczeniu 1 : 50. Zastosowane przeciwcia³a dla PCNA nale¿a³y do klonu PC-10 (Ig G₂ kappa), zaœ dla desminy i wimentyny by³y to klony D33 i V9 (Ig G₁ kap-pa). Po nawodnieniu preparatów przeznaczonych do ozna-czania PCNA, umieszczano je w buforze cytrynianowym o pH 6,0, nastêpnie w kuchence mikrofalowej gotowano dwa razy po 5 minut, przy mocy 650 W. Dalsze postêpo-wanie by³o wspólne dla wszystkich badanych antygenów. Preparaty inkubowano w obecnoœci H₂O₂ przez 15 minut,

p³ukano w PBS i dalej inkubowano przez 10 minut w 4% biotynylowanej surowicy bydlêcej. W dalszej kolejnoœci nak³adano na szkie³ka przeciwcia³a monoklonalne, tj. prze-ciwko PCNA na 1 godzinê, a przeprze-ciwko wimentynie i des-minie na 24 godziny. Barwienie wykonano metod¹ immu-noperoksydazow¹ z wykorzystaniem kompleksu extrawi-dyna-biotyna (metoda SAB). Wtórne przeciwcia³o kozie, biotynylowane anty-mysie (produkcji SIGMA), jak rów-nie¿ kompleks extrawidyna-peroksydaza stosowano w

roz-cieñczeniu 1 : 20. Jako chromogenu u¿yto AEC (karbazol). Kontrolê negatywn¹ wykonano z u¿yciem przeciwcia³ IgG₂ kappa i IgG₁ kappa, zaœ kontrolê pozytywn¹ przeprowa-dzono w skrawkach przygotowanych przez firmê DAKO.

Wyniki i omówienie

Miêœnie szkieletowe œwiñ charakteryzuj¹ siê wyso-k¹ wra¿liwoœci¹ na dzia³anie czynników uszkadzaj¹-cych. Po domiêœniowym wstrzykniêciu bupiwakainy

Tab. 1. Zmiany histopatologiczne po wstrzykniêciu bupiwakainy i stosowaniu laseroterapii

n a i m z j a z d o R _doœwD_iaiz_de_cñ_{zenia (k}G_onru_rtp_oa_lnI_{a) (poddan}G_aru_lap_sa_eroII_terapi)i i w r k a i n e i n y z c a n y W . 2 ₃1_mmi_iê_ês_œi_ne_iñ_e–_–r_oo_grlz_ae_ng_i³_ce_zone ograniczonewewszystkichmiêœniach . 3 12mmiiêêsœineiñe––roogrlzeagnilcezone e n c e b o e i n – ñ e i s ê i m 1 nieobecnewewszystkichmiêœniach . 4 ograniczonewewszystkichmiêœniach nieobecnewewszystkichmiêœniach n e i k ó ³ w a c i w tr a M . 4 pojedynczeobuma³rew³óknawewszystkichmiêœniach pojedynczeobuma³rew³óknawpo³owiebadanychmiêœni . 5 pojedynczeobuma³rew³óknawewszystkichmiêœniach niestwierdzono . 7 pojedynczeobuma³rew³óknaw3miêœniach niestwierdzono . 0 1 pojedynczeobuma³rew³óknawewszystkichmiêœniach niestwierdzono . 4 1 pojedynczeobuma³rew³óknawewszystkichmiêœniach niestwierdzono m e l p z o r – a w a r p a N j e n z c ¹ ³ i k n a k t 10. 1miêsieñ niestwierdzono w ó t y c o g a f i k e i c a N a c s j e i m o d n e i k ó ³ w a i n e z d o k z s u n iz d o g 6 d o a i n d . 5 o d ilczne ilczne . 7 obecnew3miêœniach obecnew2miêœniach . 0 1 nieilczne–obecnewewszystkichmiêœniach obecnew1miêœniu . 4 1 nieilczne–obecnewewszystkichmiêœniach obecnew2miêœniach æ œ o n c e b O w ó t s a l b o i m . 2 _mm_nio_ieb_jla_nst_¿iy₅o₀w_%al_Pne_CNi_An_-i_de_oil_dcz_an_tne_icm_hioblastywrzecionowate: m_pri_zo_eb_wla_as_¿t_ay_³yow_PCal_Nn_Ae_-di_oilc_dazn_tne_iemioblastywrzecionowate; . 3 w_der_sz_mec_ii_no_on_-o_dw_oda_ate_tn;_io_ek.65%PCNA-dodatnie,w1miêœniu w_mr_iêze_œc_ni_io_an_co_hw_;pa_ote_nad_des₈m_0%ino_P-d_Co_Nd_Aa_-t_dn_oie_daw_tne_iewszystkich . 0 1 _ww₂2_mm_ii_êêœ_œnn_iia_ac_ch_h–_niepo_sj_te_wd_iy_en_rdc_zze_ono niestwierdzono . 4 1 w1miêœniu–pojedyncze niestwierdzono b u t o i m æ œ o n c e b O . 3 niestwierdzono w_w22m_mii_êêœ_œnn_ii_aa_cc_hh_n–_ieob_se_twcn_iee_rdn_zie_onilc_oznemiotuby . 5 _milc_iz_ên_œe_niw_ace_hwszystkich ilcznewewszystkichmiêœniach . 7 w_w22_mm_iiê_êœ_œn_ni_ia_acc_hh_––p_nio_eje_sd_twyn_ic_ez_rde_zono w_w2_2mm_ii_êêœ_œnn_ii_aa_cc_hh–_–p_nio_eje_sd_ty_wn_iecz_rde_zono . 0 1 niestwierdzono w1miêœniu–pojedyncze . 4 1 niestwierdzono niestwierdzono h c y d o ³ m æ œ o n c e b O n e i k ó ³ w . 4 _ww₂2_mmi_iêêœ_œn_ni_ia_ac_ch_h––_nni_iee_silc_tz_wn_ie_erdzono w_w22m_mii_êê_œœ_nn_iia_ac_chh–_–pilc_oz_jn_ee_dyncze . 5 _ww2₂m_miiê_ꜜ_nn_ii_aa_cch_h–_–pil_oc_jz_ene_dyncze w_w13m_mii_êê_œœ_nn_iia_uc_–h_p–_ojil_ec_dzn_yne_cze . 0 1 h c a i n œ ê i m h c i k t s y z s w e w a n k ó ³ w e d o ³ m e z c n y d e j o p w_w31_mm_iiê_ꜜ_nni_iu_ac–_h–ilcz_pn_oe_jedyncze h c y d o ³ m w ê n y t n e m i w a n a j c k a e r a b a ³ s o z d r a b h c a n k ó ³ w bwa³ródkznoasch³abalubbrakreakcijnawimentynêwm³odych . 4 1 _mpo_iêje_œd_ny_ianc_cz_hewewszystkich w_w2_2mm_iiê_êœ_œn_ni_iaac_ch_h–_tylp_ko_oje_wd_³y_ón_kc_nz_ae_dorjza³e

u œwiñ wywo³ano martwicê skrzepow¹ w³ókien miêœ-niowych. Podobne rezultaty uzyskali inni autorzy (3, 19, 21, 23). Szczegó³owe zestawienie zmian mikro-skopowych w miejscu wstrzykniêcia bupiwakainy w poszczególnych dniach doœwiadczenia przedstawio-no w tab. 1.

Po szeœciu godzinach od aplikacji bupiwakainy stwierdzono we w³óknach miêœniowych zanik po-przecznego pr¹¿kowania, obecnoœæ wêz³owych skur-czy, ziarnisty lub grudkowy rozpad i wakuolizacjê w³ókien. W³ókna wybarwia³y siê na kolor czerwony przy barwieniu metod¹ HBFP. Stwierdzono odcinki w³ókien wykazuj¹cych zwiêkszon¹ pyroninoch³onnoœæ oraz wiêksz¹ iloœci substancji PAS dodatnich. Mar-twica w³ókien miêœniowych u œwiñ grupy kontrolnej by³a obecna do koñca doœwiadczenia i obejmowa³a wówczas pojedyncze w³ókna, natomiast u zwierz¹t grupy II ju¿ od 5. dnia nie stwierdzono jej obecnoœci. Uszkodzone w³ókna miêœniowe u œwiñ ulega³y rege-neracji, a tylko u jednej, z grupy kontrolnej, stwier-dzono naprawê uszkodzonego miêœnia przez rozplem tkanki ³¹cznej w³óknistej. Podobne wyniki po poda-niu bupiwakainy uzyskali inni autorzy u ró¿nych ga-tunków zwierz¹t (3, 16, 19, 21, 23), co wskazuje na du¿¹ przydatnoœæ tego modelu doœwiadczalnego w ba-daniach nad regeneracj¹ miêœni.

Po domiêœniowej aplikacji bupiwakainy stwierdzo-no u œwiñ wylewy krwawe o ró¿nej rozleg³oœci (21). Wynaczynieñ krwi nie stwierdzano po podskórnym podaniu bupiwakainy w okolicê badanych miêœni, wykazuj¹c jedynie jej dzia³anie miotoksyczne (3). Po 48 godzinach u œwiñ grupy II stwierdzono znacznie mniejsze wynaczynienia krwi w tkance œródmiêœnio-wej ni¿ w grupie kontrolnej. Po 3 dniach w grupie II zaburzenia w kr¹¿eniu nie wystêpowa³y, natomiast w grupie kontrolnej by³y obecne w 4. dniu doœwiad-czenia. Podobne wyniki badañ uzyskali Bibikova i wsp. (4), którzy ponadto wykazali w uszkodzonym miêœniu wczeœniejsz¹ i intensywniejsz¹ rewaskularyzacjê.

Regeneracja uszkodzonych miêœni szkieletowych w du¿ym stopniu zale¿y od sprawnego usuniêcia ob-umar³ych w³ókien. U œwiñ obu grup stwierdzono na-cieki komórek fagocytarnych w miêœniach ju¿ po 6 godzinach od uszkodzenia. Wœród tych komórek by³y pojedyncze makrofagi i komórki polimorfonuklearne. Po 12 godzinach przewa¿a³y komórki polimorfonu-klearne, a po 24 i 48 godzinach makrofagi, które wy-kazywa³y du¿¹ pyroninoch³onnoœæ. Po 3 dniach licz-ba komórek fagocytarnych w miejscu uszkodzenia miêœni u œwiñ zmniejsza³a siê, w grupie II spadek ten by³ wiêkszy. Podobne zmiany w sk³adzie naciekaj¹-cych komórkach w uszkodzonych miêœniowych stwier-dzili inni autorzy (19, 20).

Wzrost ekspresji PCNA w komórkach prekursoro-wych miêœni stwierdzono u œwiñ ju¿ po 6 godzinach po podaniu bupiwakainy. Po 24 godzinach ich liczba w miejscu uszkodzenia znacz¹co siê zwiêkszy³a, szcze-gólnie w grupie II. U szczurów pobudzenie komórek

stwierdzono po 12 godzinach od uszkodzenia (17) lub 25 godzinach (23), co prawdopodobnie zale¿y od ro-dzaju uszkodzenia, typu uszkodzonego miêœnia, ga-tunku zwierz¹t i rasy (18). U badanych œwiñ po 14 dniach stwierdzono tak¿e pojedyncze PCNA dodat-nie komórki satelitarne wokó³ prawid³owych w³ókien miêœniowych.

W drugim dniu po uszkodzeniu miêœni u œwiñ stwierdzano obecnoœæ mioblastów, których liczba wzrasta³a w kolejnych dniach. Ich aktywnoœæ prolife-racyjna by³a znacznie wiêksza u œwiñ poddawanych laseroterapii. Tworzy³y one rzêdy dziel¹cych siê ko-mórek u³o¿onych wzd³u¿ przetrwa³ych b³on podstaw-nych po uprz¹tniêtych w³óknach (ryc. 1). Podobne wyniki uzyskano u szczurów, u których wrzecionowate mioblasty uk³ada³y siê wzd³u¿ sarkolemy w³ókien ju¿ po 24 godzinach od uszkodzenia (3, 16, 19). U œwiñ po 48 godzinach od podania bupiwakainy stwierdzo-no liczne wrzeciostwierdzo-nowate mioblasty, które po 3 dniach ulega³y fuzji, jednak¿e tylko w grupie II stwierdzono

Ryc. 1. Du¿a liczba mioblastów PCNA-dodatnich (wybarwia-j¹cych siê na br¹zowo) u œwini z grupy II w 3. dniu po uszko-dzeniu. Barw. met. SAB, pow. 240 ×

Ryc. 2. Liczne mioblasty wrzecionowate i tworzenie siê mio-tub w 3. dniu po uszkodzeniu u œwini z grupy II. Barw. HE, pow. 480 ×

obecnoœæ miotub (ryc. 2). Ich liczba wzrasta³a do 5. dnia doœwiadczenia. Badania wykonane na gryzo-niach (16, 19, 23) równie¿ wykaza³y obecnoœæ miotub w miêœniach po 72 godzinach od wywo³ania martwi-cy. W j¹drach miotub w czwartym dniu doœwiadcze-nia stwierdzono zanik ekspresji PCNA. W kolejnych dniach zmniejsza³a siê liczba PCNA dodatnich mio-blastów, komórek satelitarnych oraz komórek tkanki ³¹cznej œródmiêœniowej. Wyniki te znajduj¹ potwier-dzenie w badaniach innych autorów (19, 23).

W czwartym dniu u œwiñ stwierdzono obecnoœæ m³odych w³ókien, które liczniej wystêpowa³y u œwiñ grupy II. Podobne wyniki uzyskali inni autorzy (16, 21). Po 7 dniach w miejscu regeneracji przewa¿a³y m³ode w³ókna, o ma³ej œrednicy, z s³abo zaznaczonym poprzecznym pr¹¿kowaniem i w ró¿nym stopniu pe-ryferyjnie po³o¿onymi j¹drami. Po 14 dniach m³ode w³ókna mia³y budowê w³ókien dojrza³ych.

Badaniem mikroskopowo-elektronowym potwier-dzono fuzjê mioblastów i powstawanie miotub oraz m³odych w³ókien miêœniowych. Ponadto stwierdzono u œwiñ filamenty kurczliwe w niektórych mioblastach i powstaj¹cych miotubach, które uk³ada³y siê chaotycz-nie b¹dŸ jednokierunkowo wzd³u¿ d³ugiej osi. Wyniki tych badañ znajduj¹ potwierdzenie w badaniach innych autorów (22).

Obecnoœæ w mioblastach wimentyny stwierdzono u œwiñ po 2 dniach od uszkodzenia miêœni. Komórki te posiada³y owalne j¹dra i uk³ada³y siê wzd³u¿ prze-trwa³ej b³ony podstawnej w³ókien. Po 4 dniach reak-cja na wimentynê by³a silna w mioblastach, a w ko-mórkach ulegaj¹cych fuzji by³a s³aba. W miotubach a tak¿e w m³odych w³óknach reakcja na wimentynê by³a s³aba lub œladowa. Rozmieszczenie wimentyny w komórkach i miotubach by³o równomierne. Jedno-czeœnie wzrasta³a ekspresja desminy, co potwierdza pogl¹d o zastêpowaniu wimentyny przez filamenty miêœniowo-specyficzne w dojrzewaj¹cych w³óknach (ryc. 3). Pogl¹d ten potwierdzaj¹ badania innych

autorów (28, 29), choæ wystêpuj¹ du¿e rozbie¿noœci w okreœleniu czasu zastêpowania wimentyny przez desminê (7, 14).

Analizuj¹c uzyskane wyniki pomiarów pola w³ókien miêœniowych stwierdzono brak istotnego wp³ywu la-seroterapii na rozmiar œredniego pola powierzchni w³ókien miêœniowych. Jedynie w 10. i 14. dniu mo¿na zaobserwowaæ istotne ró¿nice. Analizuj¹c wp³yw cza-su trwania doœwiadczenia na wielkoœæ œredniego pola powierzchni w³ókien stwierdzono, ¿e nie ma on istot-nego wp³ywu w grupie I, natomiast w grupie II mia³ istotny wp³yw na wartoœæ œredniego pola powierzchni odtwarzanych w³ókien miêœniowych. Wykazano, ¿e istotne ró¿nice wystêpuj¹ tylko miêdzy 7. i 14. dniem doœwiadczenia. Wspó³dzia³anie (interakcja) obu bada-nych czynników nie by³a istotna, co oznacza, ¿e wraz z up³ywem czasu regeneracji miêœni obserwowano podobn¹ tendencjê wzrostu œredniego pola powierzch-ni odnawiaj¹cych siê w³ókien miêœpowierzch-niowych (tab. 2).

Naœwietlanie promieniami lasera spowodowa³o u œwiñ przyspieszenie procesów odnowy uszkodzo-nych w³ókien miêœniowych. Przyspieszenie odnowy polega³o na pobudzeniu fagocytowania i usuwaniu wy-naczynionych krwinek i obumar³ych w³ókien miêœnio-wych. Znacznie s³abszy wp³yw promieni lasera zaob-serwowano na proces ró¿nicowania siê mioblastów i dojrzewanie nowo powsta³ych w³ókien, co potwier-dza wyniki uzyskane w badaniach in vivo (2). Wydaje siê, ¿e istniej¹ ograniczone mo¿liwoœci wywierania wp³ywu na przyspieszenie procesu regeneracji i doj-rzewania odnawiaj¹cych siê w³ókien. Weiss i Oron (30) stwierdzili, ¿e regeneracja postêpuje szybciej w stre-fie s¹siaduj¹cej z nieuszkodzonymi w³óknami, ni¿ w centrum uszkodzenia. Tak¹ sam¹ zale¿noœæ stwier-dzono w badaniach w³asnych. Wystêpowanie tego fe-nomenu nie do koñca zosta³o wyjaœnione. Najpraw-dopodobniej spowodowane jest to uwalnianiem czyn-ników chemotaktycznych oraz lepszym zaopatrzeniem tych obszarów przez naczynia w sk³adniki od¿ywcze i tlen (6). Pogl¹d ten potwierdzaj¹ badania prowadzo-ne in vitro z wykorzystaniem œwiat³a lasera na hodow-lach komórek miogenicznych (2).

Wnioski

1. Zastosowanie naœwietlania promieniami lasera uszkodzonych miêœni powoduje przyspieszenie

fago-Tab. 2. Analiza statystyczna powierzchni w³ókien miêœniowych (w µm2_{) u œwiñ w 7., 10. i 14. dniu doœwiadczenia}

Objaœnienia: a, b, c, A, B, C – œrednie oznaczone ró¿nymi lite-rami ró¿ni¹ siê istotnie – ma³ymi przy p £ 0,05, du¿ymi przy p £ 0,01 ñ e iz D a i n e z c d a i w œ o d GrupaI Grupa II Grupy³¹cznie 17. 341,33±43,56a _{365,58±20,41}A _{352,14±15,74}AB . 0 1 404,59±27,21b _{452,84±25,17}B _{418,12±14,53}AB . 4 1 434,58±25,21c _{526,28±27,14}C _{491,53±18,95}BA

Ryc. 3. Intensywna reakcja na obecnoœæ desminy w m³odych w³óknach miêœniowych u œwini z grupy II w 7. dniu po uszko-dzeniu. Barw. met. SAB, pow. 240 ×

cytozy obumar³ych w³ókien, wzmaga proliferacjê ko-mórek miogenicznych i ró¿nicowanie siê mioblastów, w mniejszym stopniu wp³ywa na dynamikê dojrzewa-nia nowo powsta³ych w³ókien miêœniowych.

2. Mo¿liwoœci zwiêkszania tempa regeneracji w okresie formowania siê i dojrzewania nowych w³ó-kien miêœniowych s¹ ograniczone w du¿o wiêkszym stopniu ni¿ w okresie uprz¹tania martwiczych tkanek i proliferacji komórek miogenicznych.

Piœmiennictwo

1.Azarova V. S., Popova M. F., Iliasova S. G.: Effects of autotransplantation of minced muscle tissue and subsequent laser therapy on recovery of the muscle injured by irradiation. Bjull. Eksp. Biol. Med. 1990, 110, 311-316. 2.Ben-Dov N., Shefer G., Irinitchev A., Wernig A., Oron U., Halevy O.:

Low--energy laser irradiation affects satellite cell proliferation and differentiation in vitro. Biochim. Biophys. Acta 1999, 148, 372-380.

3.Benoit P. W., Belt W. D.: Destruction and regeneration of skeletal muscle after treatment with a local anesthetic, bupivacain (Marcain). J. Anat. 1970, 107, 547-556.

4.Bibikova A., Belkin V., Oron U.: Enhancement of angiogenesis in regenera-ting gastrocnemius muscle of the toad (Bufo viridis) by low-energy laser irradiation. Anat. Embryol. Berl. 1994, 190, 597-602.

5.Bibikova A., Oron U.: Promotion of muscle regeneration in the toad (Bufo Viridis) gastrocnemius muscle by low-energy laser irradiation. Anat. Rec. 1993, 235, 374-380.

6.Bischoff R.: Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibres in cul-ture. Dev. Biol. 1986, 115, 129-139.

7.Bornemann A., Schmalbruch H.: Desmin and vimentin in regenerating muscles. Muscle&Nerve 1992, 15, 14-20.

8.Buliakova N. V., Telegina T. A., Iliasova S. G., Bekhoev I. D., Azarova V. S.: Effects of helium-neon laser on regeneration capacity of skeletal muscles of adult guinea pigs. Bjull. Eksp. Biol. Med. 1992, 113, 411-414.

9.Buliakova N. V.: Effects of minced muscle tissue implantation and sub-sequent laser therapy on regeneration of skeletal muscles in guinea pigs. Bjull. Eksp. Biol. Med. 1992, 114, 97-100.

10.Buliakova N. V., Azarova V. S.: A comparative study of the regenerative abi-lity of skeletal muscles from adult rat and guinea pigs during laser therapy. Dokl. Akad. Nauk 1994, 337, 818-820.

11.Buliakova N. V.: Regenerative capacity of minced muscle tissue in newborn and adult guinea pigs. J. Exp. Pathol. 1992, 6, 115-121.

12.Calderhead R. G., Ohshiro T.: Progress in laser therapy. John Wiley&Sons, Chichester 1991.

13.Culling C. F. A.: Handbook of histopathological and histochemical techni-ques (Including museum technitechni-ques). Butterworths, London 1974. 14.Gard D. L., Lazarides E.: The synthesis and distribution of desmin and

vimentin during myogenesis in vitro. Cell 1980, 19, 263-275.

15.Glinkowski W., Pokora L.: Lasery w terapii. Laser Instruments, Warszawa 1993.

16.Helliwell T. R.: Lectin binding and desmin staining during bupivacaine--induced necrosis and regeneration in rat skeletal muscle. J. Pathol. 1988, 155, 317-326.

17.Maltin C. A., Harris J. B., Cullen M. J.: Regeneration of mammalian skeletal muscle following the injection of the snake-venom toxin, taipoxin. Cell. Tiss. Res. 1983, 232, 565-577.

18.McGeachie J. K., Grounds M. D.: Initiation and duration of muscle precur-sor replication after mild and severe injury to skeletal muscle. Cell. Tiss. Res. 1987, 248, 125-130.

19.Ono K., Abe J. I., Kagawa N., Ii K., Hizawa K.: Immunohistochemical ana-lysis of myoblast proliferation and differentiation in experimental skeletal muscle regeneration. Zentralbl. Pathol. 1993, 139, 231-237.

20.Orimo S., Hiyamuta E., Arahata K., Sugita H.: Analysis of inflamatory cells and complement C3 in bupivacaine-induced myonecrosis. Muscle&Nerve 1991, 14, 515-520.

21.Otrocka-Domaga³a I.: Wp³yw koenzymu Q10 i witaminy E na regeneracjê miêœni szkieletowych u œwiñ. Praca dokt., Wydz. Med. Wet., UWM Olsztyn 2002.

22.Robertson T. A., Grounds M. D., Mitchell C. A., Papadimitriou J. M.: Fusion between myogenic cells in vivo: an ultrastructural study in regenerating murine sceletal muscle. J. Struct. Biol. 1990, 105, 170-182.

23.Saito Y., Nonaka I.: Initiation of satallite cell replication in bupivacaine--induced myonecrosis. Acta Neuropathol. Berl. 1994, 88, 252-257. 24.Shefer G., Barash I., Oron U., Halevy O.: Low-energy laser irradiation

enhances de novo protein synthesis via its effects on tranaslation-regulatory proteins in skeletal muscle myoblasts. Biochim. Biophys. Acta 2003, 1593, 131-139.

25.Shefer G., Oron U., Irintchev A., Wering A., Halevy O.: Skeletal muscle cell activation by low-energy laser irradiation: a role for the MAPK/ERK path-way. J. Cell. Physiol. 2001, 187, 73-80.

26.Shefer G., Partridge T. A., Heslop L., Gross J. G., Oron U., Halevy O.: Low--energy laser irradiation promotes the survival and cell cycle entry of skeletal muscle satellite cells. J. Cell. Sci. 2002, 115, 1461-1469.

27.Œladowski D., Steer D., Willshaw A., Moore L., Clothier R., Balls M.: Com-plement photoactivation assay. Toxicology in vitro 1994, 8, 3-4.

28.Tokuyasu K. T., Maher P. A., Singer S. J.: Distributions of vimentin and desmin in developing chic myotubes in vivo. I. Immunofluorescence study. J. Cell. Biol. 1984, 98, 1961-1972.

29.Vater R., Cullen M. J., Harris J. B.: The expression of vimentin in satellite cells of regenerating skeletal muscle in vivo. Histochem. J. 1994, 26, 916--928.

30.Weiss N., Oron U.: Enhacement of muscle regeneration in the rat gastrocne-mius muscle by low energy laser irradiation. Anat. Embryol. Berl. 1992, 186, 497-503.

Adres autora: dr Marek Podbielski, ul. Oczapowskiego 13, 10-718 Olsz-tyn; e-mail: tadrot@uwm.edu.pl