Artyku³ przegl¹dowy Review
Ogólna charakterystyka rodzaju Campylobacter
Bakterie rodzaju Campylobacter, mikroaerofilne, spiralne, Gram-ujemne mikroorganizmy zaliczane do domeny Bacteria, typu Proteobacteria, klasy Epsilon-proteobacteria, s¹ aktualnie najczêciej izolowanym czynnikiem etiologicznym ludzkich stanów zapalnych przewodu pokarmowego. W ostatnim dziesiêcioleciu liczba przypadków zaka¿eñ mikroorganizmami rodzaju Campylobacter znacz¹co wzros³a w krajach uprzemys-³owionych, ponad dwukrotnie przewy¿szaj¹c liczbê ob-jawowych infekcji przypisywanych bakteriom rodzaju Salmonella (3).
Z 19 jak dot¹d opisanych gatunków drobnoustrojów nale¿¹cych do rodzaju Campylobacter ludzkie infekcje wywo³ywane s¹ g³ównie przez C. coli i C. jejuni (22). Kliniczna manifestacja infekcji bywa bardzo ró¿norod-na i waha siê od przypadków asymptomatycznych do ostrych stanów zapalnych jelit, którym towarzyszy d³u-gotrwa³a, krwawa i luzowata biegunka (22). W wiêk-szoci przypadków choroba ogranicza siê do stanu za-palnego jelit i wykazuje tendencje do samowyleczenia. U ludzi z niesprawnie dzia³aj¹cym uk³adem immunolo-gicznym zaka¿enie Campylobacter jest czêsto przyczy-n¹ systemowych infekcji oraz posocznicy. Infekcja
Cam-pylobacter czasami prowadzi do rozwoju chorób auto-immunizacyjnych, z których najgroniejsz¹ jest tzw. syn-drom Guillain-Barré (GB), zapalenie wielokorzeniowe obwodowego uk³adu nerwowego. Wyst¹pienie powik³añ ze strony uk³adu nerwowego uwarunkowane jest zarów-no gezarów-notypem patogenu, jak i gezarów-notypem organizmu gos-podarza (17).
Powa¿ny problem medyczny stanowi wzrastaj¹ca licz-ba ludzkich zaka¿eñ szczepami C. coli i C. jejuni opor-nymi na powszechnie stosowane w terapii antybiotyki (makrolidy, chinolony, tetracyklina), co spowodowane jest niew³aciwym stosowaniem antybiotyków w lecze-niu ludzi oraz zbyt czêstym stosowaniem tych substan-cji w hodowli zwierz¹t (1).
ród³a infekcji, transmisja patogenu, profilaktyka anty-Campylobacter
Do ludzkich infekcji Campylobacter (w krajach roz-winiêtych) dochodzi najczêciej przez spo¿ycie nieod-powiednio przygotowanego drobiu, nie pasteryzowane-go mleka lub zanieczyszczonej pa³eczkami patogenu wody (7). Niew¹tpliwie g³ównym ród³em zarazka s¹ kurczêta ulegaj¹ce kolonizacji oko³o 2.-3. tygodnia ¿y-cia. W pierwszych tygodniach ¿ycia przed infekcj¹
pta-Genetyczne podstawy kolonizacji przewodu
pokarmowego kurcz¹t przez bakterie rodzaju
Campylobacter
EL¯BIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA, ANNA GRABOWSKA, KSENIA SZYMANEK, AGNIESZKA WYSZYÑSKA
Zak³ad Genetyki Bakterii Instytutu Mikrobiologii Wydzia³u Biologii UW, ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa
Jagusztyn-Krynicka E. K., Grabowska A., Szymanek K., Wyszyñska A.
Colonization of the chick gastrointestinal tract by Campylobacter jejuni: a genetic analysis
Summary
Campylobacter spp, gramnegative microorganisms, are currently recognized as a major cause of human acute bacterial enteritis. This bacterium frequently promotes a commensal lifestyle in the gastrointestinal tracts of many animals including birds. The main route of human infections is through improperly handled or undercooked poultry meat. This review article intends to present up-to-date research regarding knowledge of how the bacterium establishes commensalism. To date only a few genes that apparently contribute to avian--gut colonization have been identified by standard genetic techniques such as isogenic mutant construction by gene replacement methodology. The post-genomic era has resulted in new instruments for analyzing virulence and commensalism-related mechanisms. The review outlines some currently conducted Campylobacter transcriptome and proteome analyses aimed at the explanation of the adaptation of the bacterium to different environments. The last part of the review concentrates on mechanisms which regulate the chicken gut colonization process, mainly the new, recently described, two-component signal transduction systems.
ki chroni wysoki poziom specyficznych przeciwcia³ mat-czynych (21). Mechanizm zapocz¹tkowania infekcji kur-cz¹t na farmach pozostaje niewyjaniony, lecz niezale¿-nie od ród³a zaka¿enia drobnoustrój rozprzestrzenia siê w stadach kurcz¹t bardzo szybko. Chocia¿ poziom ko-lonizacji jelit kurcz¹t jest bardzo wysoki (maksymalnie 1010 jtk/g zawartoci jelit) nie wywo³uje to u ptaków ob-jawów chorobowych. Fakt ten uniemo¿liwia eliminacjê ze stad osobników zainfekowanych. Do dalszego zanie-czyszczenia tusz kurcz¹t pa³eczkami Campylobacter dochodzi w rzeniach, tak ¿e oko³o 80% tusz kurcz¹t znajduj¹cych siê na rynku zawiera du¿e iloci tego drob-noustroju. Poniewa¿ dawka infekcyjna dla cz³owieka jest stosunkowo niska (102 jtk), do zaka¿eñ ludzi dochodzi stosunkowo ³atwo i czêsto.
Identyfikacja genów warunkuj¹cych zdolnoæ Campylobacter do kolonizacji jelit drobiu
Dotychczas najpowszechniej stosowan¹ metod¹ ba-dania funkcji genów by³a mutageneza ukierunkowana (insercyjna lub delecyjna), przeprowadzana technik¹ wy-miany alleli, umo¿liwiaj¹ca unieczynnienie konkretnych genów i nastêpnie analizê fenotypow¹ otrzymanych mu-tantów. Badania prowadzone w wielu laboratoriach wy-kaza³y z³o¿onoæ procesu kolonizacji przewodu pokar-mowego drobiu przez pa³eczki C. jejuni i udowodni³y, ¿e jest on determinowany aktywnoci¹ licznych genów. Mo¿na je zaliczyæ do kilku klas, które zostan¹ omówio-ne w dalszym tekcie.
Geny warunkuj¹ce ruchliwoæ. Rzêska u Campylo-bacter jest struktur¹ komórkow¹ warunkuj¹c¹ zdolnoæ mikroorganizmu do ruchu. W procesie budowy flagel-lum bierze udzia³ oko³o 50 genów. Pozbawienie bakterii mo¿liwoci poruszania siê znacznie obni¿a ich poten-cja³ kolonizacyjny. Aktywne przemieszczanie siê mikro-organizmu odgrywa kluczow¹ rolê w pierwszych eta-pach inwazji, zanim dotrze on do w³aciwej dla siebie niszy ekologicznej. Mutanty w genach maf (motility ac-cessory factor) oraz fla w szczepie C. jejuni 11168H cha-rakteryzuj¹ siê 100-krotnie obni¿on¹ zdolnoci¹ zasied-lania jelit kurcz¹t w porównaniu ze szczepem dzikim (13). Geny uczestnicz¹ce w procesie glikozylacji bia³ek. Glikozylacja jest jednym z powszechnych systemów modyfikacji bia³ek. Do niedawna uznawano ten typ mo-dyfikacji za typowy wy³¹cznie dla organizmów eukario-tycznych. W ostatnich latach wystêpowanie O-glikozy-lacji stwierdzono równie¿ w komórkach wielu gatunków bakterii, a N-glikozylacji w komórkach dwu rodzajów mikroorganizmów (Campylobacter i Wolinella) (20). N-glikozylacja bia³ek polega na przy³¹czaniu krótkich ³añcuchów wêglowodanowych do asparaginy sekwen-cji NXS/T. Locus (17 kb) genów odpowiedzialnych za ten proces u Campylobacter zosta³ nazwany pgl (protein glycosylation pathway) i obejmuje 13 genów. Geny ko-duj¹ce bia³ka bêd¹ce celem dzia³ania protein Pgl (ponad 30 protein) rozrzucone s¹ wzd³u¿ ca³ego genomu tej bak-terii (24). Unieczynnienie procesu N-glikozylacji pro-wadzi do zaburzeñ wielu procesów. Testy kolonizacji z u¿yciem mutantów pglH::kan/11168H przeprowadzo-ne na 2-tygodniowych oraz pglH::kan/81116 na 1-dnio-wych kurczêtach udokumentowa³y rolê transferazy
N-acetylogalaktozoaminy w ustanawianiu komensali-stycznych relacji miêdzy mikroorganizmem a gospoda-rzem.
Geny warunkuj¹ce wytworzenie polisacharydo-wych otoczek. Kluczowym czynnikiem kolonizacyjnym s¹ tak¿e produkty genów kps (capsular proteins synteta-se) odpowiadaj¹ce za wytworzenie otoczek CPS (cap-sular polysaccharide) warunkuj¹cych serotyp szczepu. Mutanty kpsM::kan/11168H nie zasiedla³y jelit 2-tygod-niowych kurcz¹t. Dowiadczenia przeprowadzone in vivo na fretkach oraz testy in vitro z wykorzystaniem linii ko-mórkowych, tak¿e wykaza³y znacz¹cy udzia³ CPS w pro-cesach kolonizacji i inwazji Campylobacter (4).
Geny warunkuj¹ce oddzia³ywania miêdzy komór-kami mikroorganizmu a enterocytami. Technika dys-rupcyjnej mutagenezy ukierunkowanej oraz testy fizjo-logiczne pozwoli³y scharakteryzowaæ, jako wa¿ny czyn-nik wirulencji/kolonizacji, tak¿e gen cadF (Campylobac-ter adhesion to Fn) koduj¹cy 37 kDa, zlokalizowane w b³onie zewnêtrznej bia³ko, odpowiedzialne za wi¹za-nie C. jejuni z fibronektyn¹. Mutanty C. jejuni F38011 w genie cadF utraci³y ca³kowicie zdolnoæ do koloni-zacji jelit ptaków, choæ odnajdywane by³y w wolu (25). Mutageneza przeprowadzana technik¹ wymiany alleli poz-woli³a zidentyfikowaæ jako czynnik uczestnicz¹cy w pro-cesie kolonizacji tak¿e gen ciaB o nieokrelonej do koñ-ca funkcji. Jego produkt uruchamia szereg zdarzeñ pro-wadz¹cych do wydzielenia bia³ek sekrecyjnych Cia, które umo¿liwiaj¹ wnikniêcie komórek bakterii w testach in vitro do niefagocytuj¹cych komórek gospodarza (15).
Globalne metody analizy genomów i transkryptomów bakteryjnych
W ostatnich latach obserwuje siê wyran¹ zmianê ja-kociow¹ metodyki badania procesów patogenezy; od identyfikacji i funkcjonalnej charakterystyki pojedyn-czych genów w kierunku eksperymentalnej analizy glo-balnej genomów, transkryptomów, proteomów czy in-tegromów komórek bakteryjnych.
Analiza in silico charakterystyka genomów Cam-pylobacter. Do niedawna znana by³a sekwencja nukleo-tydowa genomu jednego szczepu bakterii rodzaju Cam-pylobacter, a mianowicie C. jejuni NCTC 11168 (ludzki izolat kliniczny z roku 1977 r.) (19). W styczniu 2005 roku zsekwencjonowano genomy czterech innych szcze-pów oznaczonych: C. jejuni RM1221, C. coli RM2228 (naturalne izolaty od kurcz¹t) oraz C. lari RM2100 i C. upsaliensis RM3195 (ludzkie izolaty) (9). Genom bakterii rodzaju Campylobacter stanowi kolista cz¹stecz-ka DNA (1,641-1,778 Mb) o wielkoci zbli¿onej do wiel-koci chromosomu bakterii spokrewnionego rodzaju Helicobacter (~1,667 Mb) a oko³o trzy razy mniejsza od genomu Escherichia coli K12. Materia³ genetyczny Cam-pylobacter mog¹ stanowiæ równie¿ elementy pozachro-mosomalne, choæ nie s¹ one obecne we wszystkich szcze-pach (9).
Pomiêdzy piêcioma analizowanymi genomami zaob-serwowano ró¿nice strukturalne. Genom szczepu C. je-juni RM 1221 jest synteniczny w stosunku do genomu C. jejuni NCTC 11168, choæ zawiera cztery wintegro-wane elementy (profagi/wyspy genomowe). Tak¿e
po-równanie genomów C. jejuni i C. coli wykaza³o pewien poziom syntenii, podczas gdy genomy C. lari i C. upsa-liensis posiadaj¹ zupe³nie odmienn¹ organizacjê. Prze-prowadzona analiza porównawcza nie wykaza³a znacz¹-cych ró¿nic pomiêdzy wymienionymi powy¿ej genoma-mi w odniesieniu do regulacji procesów transkrypcji. Wszystkie koduj¹ trzy czynniki sigma RNAP oraz po-dobn¹ liczbê bia³ek uk³adów dwusk³adnikowych; piêæ z nich wydaje siê konserwatywnych wród przedstawi-cieli ró¿nych gatunków rodzaju Campylobacter (9).
Zawartoæ par (GC) w chromosomach analizowanych szczepów waha siê od 29,6% do 34,5%. Jednak ich roz-mieszczenie w materiale genetycznym nie jest równo-mierne. Cech¹ charakterystyczn¹ obszarów koduj¹cych jest nawet dwukrotnie wy¿sza liczba par GC (37%) ni¿ w rejonach niekoduj¹cych, gdzie wynosi ona oko³o 19% (9, 19). Analizowane genomy rodzaju Campylobacter charakteryzuj¹ siê wysok¹ gêstoci¹ genów dla C. je-juni sekwencje koduj¹ce stanowi¹ 94,3% (8).
Na podstawie analizy sekwencji nukleotydowych w genomach dwóch szczepów C. jejuni i jednego C. coli zidentyfikowano 1634-1835 otwartych ramek odczytu (ORF), koduj¹cych zarówno funkcjonalne bia³ka, jak i pseudogeny (7-47). Porównywanie sekwencji nukleo-tydowych genów Campylobacter z dostêpnymi w inter-netowych bazach danych pozwoli³o okreliæ funkcjê po-nad 75% protein. Reszta ORF posiada w bazach danych homologi o nieudokumentowanej funkcji lub s¹ to tzw. geny sieroce.
Genomy bakterii rodzaju Campylobacter cechuje nie-wielka liczba sekwencji insercyjnych (elementów IS brak w genomach C. jejuni, a w genomie C. coli zidentyfiko-wano ich zaledwie 5) oraz niska czêstoæ wystêpowania sekwencji repetytywnych. Opublikowaniu sekwencji nukleotydowej genomu C. jejuni szczepu NCTC 11168 towarzyszy³o stwierdzenie wyj¹tkowej rzadkoci wystê-powania funkcjonalnych operonów w stosunku do ge-nomów wiêkszoci znanych organizmów prokariotycz-nych.
Wiele genów, zw³aszcza tych zaanga¿owanych w pro-ces kolonizacji, jest silnie konserwatywnych. Wystêpu-j¹ we wszystkich przebadanych szczepach Campylobac-ter. S¹ to geny strukturalne rzêsek (region fla), geny uczestnicz¹ce w regulacji aparatu motorycznego (racR/S), warunkuj¹ce oddzia³ywania z komórkami eukariotycz-nymi (cadF, ciaB), koduj¹ce adhezyny (jlpA, peb1, cjaA) jak równie¿ koduj¹ce podjednostki cytotoksyny (cdt). Po-dobnie procesy metaboliczne wydaj¹ siê przebiegaæ podobnie z pewnymi ró¿nicami dotycz¹cymi cyklu kwa-sów trójkarboksylowych, podczas gdy geny warunku-j¹ce lekoopornoæ oraz odpowiedzialne za biosyntezê LPS-u, LOS-u i CPS-u wykazuj¹ wysoki stopieñ zró¿ni-cowania miêdzy szczepami (9).
Mutageneza transpozonowa, ró¿nicuj¹ca hybrydyza-cja. Strategia STM (signature-tagged mutagenesis) umo¿-liwia na drodze ró¿nicuj¹cej hybrydyzacji identyfikacjê w jednym eksperymencie wielu genów, których aktyw-noæ jest niezbêdna do prze¿ycia bakterii patogennych w organizmie gospodarza. Poniewa¿ jak dot¹d nie opra-cowano techniki mutagenezy transpozonowej in vivo sku-tecznej w odniesieniu do komórek rodzaju
Campylobac-ter, Hendrixson i DiRita w celu identyfikacji genów C. jejuni 81176 zaanga¿owanych w proces kolonizacji jelit lepych u 1-dniowych kurcz¹t, wykorzystali trans-pozon eukariotyczny, a proces transpozycji przeprowa-dzili in vitro stosuj¹c oczyszczony DNA chromosomal-ny (12). Tak przygotowachromosomal-ny preparat DNA wykorzysta-no do transformacji komórek C. jejuni 81176. Dalsze etapy techniki STM przebiega³y standardowo i dopro-wadzi³y do identyfikacji 29 mutantów w 22 ró¿nych ge-nach potencjalnie warunkuj¹cych zdolnoæ do zasiedla-nia przewodu pokarmowego kurcz¹t. Inaktywacja po-nad po³owy z nich (12 genów) objawia³a siê fenotypo-wo brakiem zdolnoci mikroorganizmu do ruchu. Ziden-tyfikowano wiele uprzednio scharakteryzowanych genów warunkuj¹cych ruchliwoæ oraz kilka nowych dotych-czas niebadanych. S¹ to: fliA (koduje podjednostkê s28 polimerazy RNA); fliR (jego produkt uczestniczy w bio-syntezie bia³ek strukturalnych flagellum); motA i motB (koduj¹ bia³ka motoryczne aparatu ruchu); rpoN (gen podjednostki s54 polimerazy RNA); cheY (nadrzêdny re-gulator procesów chemotaktycznych); flgK i pflA (ich produkty to proteiny strukturalne rzêski) oraz geny ozna-czone numerami Cj0248, Cj0454, Cj0618, Cj0883, któ-re nie posiadaj¹ odpowiedników w dostêpnych, kompu-terowych bazach danych. Mutanty we wszystkich genach wykazywa³y obni¿on¹ zdolnoæ zasiedlania jelit (10-100 razy) w porównaniu ze szczepem dzikim C. jejuni 81176. Szczepy defektywne w pozosta³ych dziesiêciu genach, zidentyfikowane w tym eksperymencie, zachowa³y zdol-noæ do poruszania siê, ale równie¿ kolonizowa³y jelita kurcz¹t na ni¿szym poziomie, co potwierdzi³o wczeniej-sze obserwacje, ¿e aktywne przemieszczanie siê, choæ jest istotnym czynnikiem wirulencji Campylobacter, nie odgrywa krytycznej roli w procesie kolonizacji jelit pta-ków. Do tej grupy nale¿a³y mutanty w genach uczestni-cz¹cych w procesie N-glikozylacji bia³ek (plgE, plgF i plgH), które zasiedla³y przewód pokarmowy kurcz¹t na poziomie oko³o 100-1000 razy ni¿szym ni¿ szczep dziki. Podobny fenotypowy efekt inaktywacji genu ob-serwowano w przypadku mutantów cj0903- i cj1019-(livJ). Produkty tych genów, których funkcja nie by³a jak na razie badana eksperymentalnie, wykazuj¹ wysoki stopieñ homologii do bia³ek systemu transportu typu ABC, uczestnicz¹cych w wi¹zaniu i przenoszeniu ami-nokwasów do wnêtrza komórki bakterii. Aminokwasy dla komórek Campylobacter nieposiadaj¹cych genu ko-duj¹cego fosfofruktokinazê stanowi¹ wa¿ne ród³o nie tylko azotu, ale tak¿e wêgla i energii (19). W obrêbie analizowanej grupy genów na szczególn¹ uwagê zas³u-guj¹ cj0019c i cj0020c, dwa zachodz¹ce, prawdopodob-nie ko-transkrybowane geny, których inaktywacja obja-wia siê obni¿eniem potencja³u kolonizacyjnego nawet 1 milion razy. Nazwano je odpowiednio docA i docB (determinant of chick colonization). Pierwszy koduje bia³ko homologiczne do protein grupy MCP (metyl-ac-cepting chemotaxis protein), a drugi potencjaln¹ pery-plazmatyczn¹ peroksydazê cytochromu c.
Inn¹ technik¹ wykorzystywan¹ do analizy porównaw-czej genomów jest ró¿nicuj¹ca hybrydyzacja. Jeden z jej wariantów polega na porównaniu metod¹ hybrydyzacji genomów ró¿nych szczepów o ró¿nych w³aciwociach
fenotypowych. Ahmed i wsp. porównywali chromoso-malny DNA dwóch szczepów: C. jejuni 81116 (18) i C. jejuni NCTC 11168 (2, 19). Przeprowadzone testy kolonizacji wykaza³y, ¿e izolat z 1983 r. (C. jejuni 81116) roku zasiedla jelita jednodniowych kurcz¹t na du¿o wy¿-szym poziomie ni¿ szczep NCTC 11168. Analiza hybry-dyzacyjna pozwoli³a zidentyfikowaæ fragmenty DNA charakterystyczne dla szczepu 81116 i nieobecne w ge-nomie szczepu zsekwencjonowanego, tym samym umo¿-liwi³a podjêcie prób wyjanienia ró¿nic w ich potencja-le kolonizacyjnym. Zidentyfikowano 23 klony zawiera-j¹ce sekwencje nukleotydowe unikatowe dla szczepu C. jejuni 81116 (2). Poznanie indywidualnej funkcji ge-nów tych fragmentu DNA wymaga bardziej szczegó³o-wych badañ.
Globalna analiza procesów transkrypcji szczepów Campylobacter. Badania transkryptomów przeprowadzo-no dla szczepów C. jejuni, korzystaj¹c z faktu zsekwen-cjonowania w 2000 r. genomu szczepu C. jejuni NCTC 11168 (19). Szczep ten zosta³ zamro¿ony i jest przecho-wywany w kolekcji ATCC pod numerem 700819. Klon, którego genom zsekwencjonowano, by³ wielokrotnie pa-sa¿owany w laboratorium na sztucznych pod³o¿ach. Po-równywano profile transkrypcyjne dwu szczepów, NCTC 11168-V1 i NCTC 11168-V26 (6). NCTC 11168-V1 sta-nowi³ pobrany w 2000 r. z kolekcji ATCC pierwotny izo-lat kliniczny, a NCTC 11168-V26 poddawany wielo-krotnym pasa¿om laboratoryjnym od momentu pierwot-nej izolacji w 1977 r. Warianty te wykazywa³y istotne ró¿nice fenotypowe. Jedna z nich dotyczy³a poziomu kolonizacji przewodu pokarmowego kurcz¹t. Wariant V1 okaza³ siê du¿o bardziej agresywnym kolonizatorem.
W odró¿nieniu od genomów obu szczepów NCTC 11168, które nie wykazywa³y znacz¹cych ró¿nic, porów-nanie ich transkryptomów ujawni³o znaczne zró¿nico-wanie ich profilów transkrypcyjnych. Dotyczy³o ono g³ównie poziomu ekspresji genów zwi¹zanych z synte-z¹ wici, toksyny, katalazy, bia³ek wi¹¿¹cych ¿elazo oraz genu pse, którego produkt wp³ywa na proces glikozyla-cji flagelliny. Wszystkie te geny, niew¹tpliwie odgrywa-j¹ce rolê w procesie kolonizacji, ulega³y ekspresji na wy¿szym poziomie w szczepie V1. Podobne obserwa-cje poczyniono analizuj¹c metod¹ dwukierunkowej elek-troforezy i spektrometrii mas proteomy badanych dwu wariantów szczepu C. jejuni NCTC 11168 (6).
Analogiczne eksperymenty przeprowadzili Gaynor i wsp., stosuj¹c do badañ dwa szczepy C. jejuni NCTC 11168: 11168-O (zamro¿ony, oryginalny szczep) i jego pochodn¹ nazwan¹ 11168-GS (szczep wielokrotnie pa-sa¿owany w warunkach laboratoryjnych). Podobnie jak w wy¿ej omówionych eksperymentach, te dwa warian-ty, choæ nierozró¿nialne przy zastosowaniu molekular-nych metod genotypowania, takich jak AFLP, PFGE, czy ró¿nicuj¹ca hybrydyzacja, wykazywa³y wiele ró¿nic fe-notypowych (ruchliwoæ, poziom kolonizacji kurcz¹t, morfologia, inwazyjnoæ). Przebadanie profili transkryp-cyjnych wariantu 11168-GS i 11168-O metod¹ mikro-paneli ujawni³o, ¿e poziom ekspresji wielu genów i ope-ronów, g³ównie zwi¹zanych z procesami oddechowymi i glukoneogenez¹ oraz ruchliwoci¹, istotnie ró¿ni³ dwa warianty szczepu C. jejuni NCTC 11168.
Regulacja ekspresji genów uczestnicz¹cych w kolonizacji przewodu pokarmowego drobiu
dwusk³adnikowe uk³ady regulacyjne
Dwusk³adnikowe uk³ady regulacyjne, TCSTS (two--component signal transduction system), stanowi¹ istot-ne mechanizmy regulacji ekspresji genów Campylobac-ter, zwiêkszaj¹ce adekwatnoæ odpowiedzi bakterii na nap³ywaj¹ce ze rodowiska specyficzne sygna³y. Syste-my te w najprostszym uk³adzie sk³adaj¹ siê z dwóch bia-³ek: kinaz histydynowych (bia³ek transb³onowych, pe³-ni¹cych rolê sensorów) i regulatorów transkrypcji bia-³ek cytoplazmatycznych, bêd¹cych efektorami uk³adu. Aktywacja elementu sensorowego, polegaj¹ca na jego autofosforylacji, zachodzi poprzez oddzia³ywanie bod-ców rodowiskowych. Komunikacja sensora z efekto-rem odbywa siê na drodze odwracalnej fosforylacji przekazanie reszty fosforowej z histydyny bia³ka senso-rowego na asparaginê wykazuj¹cego powinowactwo do DNA efektora powoduje jego przejcie w stan aktywny, w którym mo¿e regulowaæ wzmacniaæ lub os³abiaæ proces transkrypcji.
W genomie C. jejuni NCTC 11168 zidentyfikowano dziewiêæ genów koduj¹cych potencjalne bia³ka regula-torowe i szeæ koduj¹cych bia³ka sensorowe TCSTS. Po-dobna liczba tego typu bia³ek regulatorowych wystêpu-je w proteomach czterech innych przedstawicieli rodza-ju Campylobacter o zsekwencjonowanych genomach (9, 19). Jak dot¹d trzy z tych uk³adów by³y analizowane eks-perymentalnie: DccR/DccS (diminished capacity to co-lonize) (16), RacR/RacS (reduced ability to coco-lonize) (5) oraz FlgR/FlgS (flagella) (23).
Pierwszy wymieniony system bia³ek, którego aktyw-noæ niezbêdna jest do osi¹gniêcia optymalnego pozio-mu kolonizacji, zosta³ nazwany DccR/DccS. Sk³ada siê z dwu genów, cj1223c cj1222c, tworz¹cych jednostkê transkrypcyjn¹, koduj¹cych odpowiednio bia³ko regula-torowe i bia³ko sensorowe. Aktywnoæ tego systemu dwusk³adnikowego nie wp³ywa na kilka przebadanych cech fenotypowych w warunkach in vitro, w przeciwieñ-stwie do zachowania szczepu in vivo w organizmie go-spodarza (16). Otrzymane na drodze wymiany alleli mu-tanty w genie dccR, niewytwarzaj¹ce bia³ka regulatoro-wego, wykazuj¹ znacz¹co obni¿on¹ zdolnoæ koloniza-cji przewodu pokarmowego dwu gatunków zwierz¹t: kurcz¹t (1-dniowe ptaki) oraz myszy szczep C3H I-LF (immunocompetent limited flora) i SCID-LF (severe combined immunodeficient limited flora). Dok³adne badania transkryptomów szczepu zmutowanego oraz szczepu nadprodukuj¹cego bia³ko regulatorowe umo¿-liwi³y identyfikacjê genów bêd¹cych celem dzia³ania omawianego uk³adu dwusk³adnikowego. Odnaleziono trzy geny, których poziom transkrypcji by³ znacz¹co wy¿szy w szczepie nadprodukuj¹cym bia³ko DccR w po-równaniu z izogenicznym mutantem. Wszystkie trzy nie-zale¿nie transkrybowane geny (cj0200c, cj1626c oraz cj1356c) to geny sieroce, koduj¹ce pozacytoplazmatycz-ne bia³ka o nieznapozacytoplazmatycz-nej funkcji. Sygna³ rozpoznawany przez uk³ad dwusk³adnikowy DccR/DccS pozostaje jak dot¹d nieznany.
Drugi z systemów TCSTS, istotny dla wzrostu, a praw-dopodobnie tak¿e prze¿ywalnoci C. jejuni w jego natu-ralnym rodowisku jelita, to dwuelementowy uk³ad RacR/RacS (5). Komórki mutanta racR, które nie wy-twarzaj¹ funkcjonalnego regulatora, tworz¹ mniejsze kolonie od bakterii szczepu dzikiego, zarówno w tem-peraturze 37°C, jak i 42°C. Ponadto mutant wykazywa³ znacz¹co obni¿on¹ zdolnoæ kolonizacji jelita kurcz¹t. Na podstawie porównania profilu bia³ek mutanta i szcze-pu dzikiego zidentyfikowano co najmniej 11 genów, któ-rych ekspresja podlega regulacji, pozytywnej lub nega-tywnej, przez bia³ko RacR. Uk³ad RacS/RacR odpowia-da za regulacjê transkrypcji w odpowiedzi na zmiany temperatury.
Trzeci, najdok³adniej przeanalizowany eksperymen-talnie dwusk³adnikowy system regulacyjny, to uk³ad FlgS/ FlgR, odpowiedzialny za regulacjê ekspresji regulonu fla, zwi¹zanego z tworzeniem wici komórek Campylo-bacter (23). W komórkach bakterii Gram-ujemnych geny koduj¹ce bia³ka strukturalne buduj¹ce aparat wici ule-gaj¹ ekspresji w hierarchicznym porz¹dku, w kolejnoci zgodnej z sekwencj¹ ich w³¹czania do powstaj¹cego or-ganellum. Wiæ Campylobacter zbudowana jest g³ównie z bia³ka FlaA, choæ w niewielkiej iloci wystêpuje w niej tak¿e bia³ko FlaB. W procesie biogenezy wici uczestni-cz¹ produkty ponad 50 genów zlokalizowanych w 32 loci, co sugeruje z³o¿onoæ mechanizmu kontroli regulonu fla (11). Nadrzêdn¹ rolê w kaskadzie zjawisk regulacyjnych pe³ni¹ bia³ka uk³adu dwusk³adnikowego FlgS/FlgR, w którym FlgS jest sensorow¹ kinaz¹, a FlgR (homolog NtrC) bia³kiem regulatorowym indukuj¹cym transkryp-cjê genów zale¿nych od RpoN. Badania Carrillo i wspó³-pracowników wykaza³y dodatkow¹ regulacyjn¹ funkcjê bia³ka FlhA, które nie tylko tworzy aparat sekrecyjny, ale tak¿e kontroluje poziom transkrypcji genów regulo-nu fla zarówno tych zale¿nych od czynnika sigma-54, jak i od czynnika sigma-28 (6). Testy kolonizacji prze-wodu pokarmowego 1-dniowych kurcz¹t wykaza³y 10--krotnie obni¿on¹ zdolnoæ zasiedlania jelit drobiu przez mutanty defektywnych w systemie FlgR/S (23).
Podsumowanie
Przedstawione dane dotycz¹ jednych z pierwszych eks-perymentów analizuj¹cych zjawisko komensalizmu. Ró¿norodnymi metodami, zarówno na drodze inaktywa-cji poszczególnych genów, jak te¿ analizuj¹c genomy i transkryptomy kilku szczepów C. jejuni/coli starano siê ustaliæ zestaw genów i sekwencjê zdarzeñ prowa-dz¹cych do zasiedlana jelit kurcz¹t przez te mikroorga-nizmy. Niew¹tpliwie jest to proces z³o¿ony wymagaj¹cy aktywnoci wielu bia³ek. Wykazano, ¿e zdolnoæ do ru-chu jest czynnikiem u³atwiaj¹cym, ale niewystarczaj¹-cym do zasiedlenia tej niszy ekologicznej przez pa³ecz-ki Campylobacter. Bezsprzecznie w kolonizacji bierze udzia³ co najmniej kilka bia³ek podlegaj¹cych proceso-wi N-glikozylacji. W procesie kolonizacji odgrywaj¹ rolê zarówno geny metabolizmu podstawowego (transport aminokwasów), jak i typowe geny wirulencji odpo-wiedzialne za oddzia³ywanie patogenu z komórkami eukariotycznymi.
Pimiennictwo
1.Aarestrup F. M., Wegener H. C.: The effects of antibiotic usage in food animals on the development of antimicrobial resistance of importance for humans in Campylobacter and Escherichia coli. Microbes Infect. 1999, 1, 639-644. 2.Ahmed I. H., Manning G., Wassenaar T. M., Cawthraw S., Newell D. G.:
Identi-fication of genetic differences between two Campylobacter jejuni strains with different colonization potentials. Microbiology 2002, 148, 1203-1212. 3.Altekruse S. F., Stern N. J., Fields P. I., Swerdlow D. L.: Campylobacter jejuni
an emerging foodborne pathogen. Emerg. Infect. Dis. 1999, 5, 28-35. 4.Bacon D. J., Szymanski C. M., Burr D. H., Silver R. P., Alm R. A., Guerry P.:
A phase-variable capsule is involved in virulence of Campylobacter jejuni 81-176. Mol. Microbiol. 2001, 40, 769-777.
5.Bras A. M., Chatterjee S., Wren B. W., Newell D. G., Ketley J. M.: A novel Campylobacter jejuni two-component regulatory system important for tempera-ture-dependent growth and colonization. J. Bacteriol. 1999, 181, 3298-3302. 6.Carrillo C. D., Taboada E., Nash J. H., Lanthier P., Kelly J., Lau P. C., Verhulp R.,
Mykytczuk O., Sy J., Findlay W. A., Amoako K.: Genome-wide expression ana-lyses of Campylobacter jejuni NCTC 11168 reveals coordinate regulation of motility and virulence by flhA. J. Biol. Chem. 2004, 279, 20327-20338. 7.Corry J. E., Atabay H. I.: Poultry as a source of Campylobacter and related
organisms. Symp. Ser. Soc. Appl. Microbiol. 2001, 96S-114S.
8.Eppinger M., Baar C., Raddatz G., Huson D. H., Schuster S. C.: Comparative analysis of four Campylobacterales. Nat. Rev. Microbiol. 2004, 2, 872-885. 9.Fouts D. E., Mongodin E. F., Mandrell R. E., Miller W. G., Rasko D. A.,
Ravel J., Brinkac L. M., DeBoy R. T., Parker C. T., Daugherty S. C.: Major structural differences and novel potential virulence mechanisms from the geno-mes of multiple Campylobacter species. PLoS Biol. 2005, 3, e15.
10.Gaynor E. C., Cawthraw S., Manning G., MacKichan J. K., Falkow S., Newell D. G.: The genome-sequenced variant of Campylobacter jejuni NCTC 11168 and the original clonal clinical isolate differ markedly in colonization, gene expression, and virulence-associated phenotypes. J. Bacteriol. 2004, 186, 503-517.
11.Guerry P., Alm R. A., Szymanski C. M., Trust T. J.: Structure, function, and antigenicity of Campylobacter flagella, [w:] Nachamkin I., Blaser M. J. (red.): Campylobacter. 2nd edition, American Society of Microbiology, Washington D.C.
2000, 405-421.
12.Hendrixson D. R., DiRita V. J.: Identification of Campylobacter jejuni genes involved in commensal colonization of the chick gastrointestinal tract. Mol. Microbiol. 2004, 52, 471-484.
13.Jones M. A., Marston K. L., Woodall C. A., Maskell D. J., Linton D., Karly-shev A. V., Dorrell N., Wren B. W., Barrow P. A.: Adaptation of Campylobacter jejuni NCTC 11168 to high-level colonization of the avian gastrointestinal tract. Infect. Immun. 2004, 72, 3769-3776.
14.Karlyshev A. V., Everest P., Linton D., Cawthraw S., Newell D. G., Wren B. W.: The Campylobacter jejuni general glycosylation system is important for attach-ment to human epithelial cells and in the colonization of chicks. Microbiology 2004, 150, 1957-1964.
15.Konkel M. E., Kim B. J., Rivera-Amill V., Garvis S. G.: Bacterial secreted pro-teins are required for the internaliztion of Campylobacter jejuni into cultured mammalian cells. Mol. Microbiol. 1999, 32, 691-701.
16.MacKichan J. K., Gaynor E. C., Chang C., Cawthraw S., Newell D. G., Miller J. F., Falkow S.: The Campylobacter jejuni dccRS two-component sys-tem is required for optimal in vivo colonization but is dispensable for in vitro growth. Mol. Microbiol. 2004, 54, 1269-1286.
17.Nachamkin I., Allos B. M., Ho T.: Campylobacter species and Guillain-Barre syndrome. Clin. Microbiol. Rev. 1998, 11, 555-567.
18.Palmer S. R., Gully P. R., White J. M., Pearson A. D., Suckling W. G., Jones D. M., Rawes J. C., Penner J. L.: Water-borne outbreak of Campylobacter gastroente-ritis. Lancet 1983, 1, 287-290.
19.Parkhill J., Wren B. W., Mungall K., Ketley J. M., Churcher C., Basham D., Chillingworth T., Davies R. M., Feltwell T., Holroyd S.: The genome sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervariable se-quences. Nature 2000, 403, 665-668.
20.Power P. M., Jennings M. P.: The genetics of glycosylation in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 2003, 218, 211-222.
21.Sahin O., Luo N., Huang S., Zhang Q.: Effect of Campylobacter-specific mater-nal antibodies on Campylobacter jejuni colonization in young chickens. Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69, 5372-5379.
22.Skirrow M. B., Blaser M. J.: Clinical aspects of Campylobacter infection, [w:] Nachamkin I., Blaser M. J. (red.): Campylobacter. American Society of Micro-biology, Washington D.C. 2000, 69-89.
23.Wosten M. M., Wagenaar J. A., van Putten J. P.: The FlgS/FlgR two-component signal transduction system regulates the fla regulon in Campylobacter jejuni. J. Biol. Chem. 2004, 279, 16214-16222.
24.Young N. M., Brisson J. R., Kelly J., Watson D. C., Tessier L., Lanthier P. H., Jarrell H. C., Cadotte N., St Michael F., Aberg E., Szymanski C. M.: Structure of the N-linked glycan present on multiple glycoproteins in the Gram-negative bacterium, Campylobacter jejuni. J. Biol. Chem. 2002, 277, 42530-42539. 25.Ziprin R. L., Young C. R., Stanker L. H., Hume M. E., Konkel M. E.: The absence
of cecal colonization of chicks by a mutant of Campylobacter jejuni not expres-sing bacterial fibronectin-binding protein. Avian Dis. 1999, 43, 586-589. Adres autora: prof. dr hab. E. K. Jagusztyn-Krynicka, ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa; e-mail: kjkryn@biol.uw.edu.pl
