Wpływ długotrwałego promieniowania UV-B na reakcje świetlne fotosyntezy i zawartość barwników w liściach roślin rzepaku.

Elżbieta Skórska

Akademia Rolnicza w Szczecinie, Zakład Fizyki

Wpływ długotrwałego promieniowania UV-B

na reakcje świetlne fotosyntezy i zawartość

barwników w liściach roślin rzepaku

Effect of long-term UV-B irradiation on light reactions

of photosynthesis and pigments content of rape plant leaves

Wykorzystując zjawisko indukcji fluorescencji chlorofilu a (parametry Fv/Fm, Fv/Fo, Sc) badano sprawność pierwotnych reakcji fotosyntezy liści rzepaku odmiany Marita rosnących 8 tygodni, przy naturalnym oświetleniu w wa-runkach szklarniowych i dodatkowym promie-niowaniu UV-B (lampy TL100/01). Po dwóch tygodniach napromieniowania ultrafioletem dwukrotnie wzrosła zawartość flawonoidów, skutecznie chroniąc wnętrze liści przed szkod-liwym oddziaływaniem UV-B. Po kolejnych tygodniach napromieniowania zawartość tych związków ulegała obniżeniu, co spowodowało niewielkie obniżenie aktywności pierwotnych reakcji fotosyntezy. Stężenie karotenoidów w liściach nie zmieniało się podczas całego doś-wiadczenia, a zawartość chlorofilu ulegała niewielkim zmianom.

Activity of primary photosynthesis reactions in winter oilseed rape leaves grown for 8 weeks under natural light in greenhouse and under ultraviolet B radiation (two lamps TL100/01) were studied by registration of chlorophyll fluorescence induction kinetics (parameters Fv/Fm, Fv/Fo, Sc). After two weeks of ultraviolet irradiation content of flawonoids increased twice in comparison with the control plants, effectively protecting inside of leaf against UV-B radiation. After next weeks of irradiation the content of these compounds decreased, which was associated with little reduction of capacity of primary photosynthesis reaction. Concentration of carotenoids in leaves was not changed during all experiment, and content of chlorophyll showed little changes.

Wstęp

Zmniejszające się od kilku dziesięcioleci stężenie ozonu stratosferycznego powoduje wzrost ilości promieniowania UV-B (280÷320 nm) docierającego do powierzchni ziemi. Zwiększone natężenie UV-B może powodować niekorzystne zmiany cech anatomicznych u roślin, zahamowanie procesu fotosyntezy, spowol-nienie wzrostu, zmniejszenie biomasy, a w efekcie obniżenie plonów roślin upraw-nych (Stapleton 1992; Starck i in. 1995). Rośliny mogą wykształcać różne mecha-nizmy obronne, z których najważniejszy polega na wytwarzaniu w epidermie liści zwiększonej zawartości barwników ekranujących ultrafiolet, głównie flawonoidów

(Robberecht i Calwell 1978; Tevini i in. 1991; Teramura i Sullivan 1994). Związki te pochłaniają promieniowanie w tym zakresie, chroniąc w ten sposób wnętrze mezofilu liścia.

W poprzednich pracach przedstawiono wpływ krótkotrwałego, kilkugodzin-nego napromieniowaniu UV-B na sprawność pierwotnych reakcji fotosyntezy liści młodych roślin rzepaku (Skórska 1996a, 1996b). Celem niniejszej pracy było zbadanie reakcji roślin rzepaku rosnących przy naturalnym oświetleniu i przy towarzyszącym promieniowaniu ultrafioletowym.

Materiał i metody

Materiał roślinny i napromieniowanie UV-B

Nasiona roślin rzepaku (Brassica napus L. var. oleifera) odmiany Marita wysiano do ziemi w doniczkach o pojemności 500 cm3 na początku września 1997 r. Po wykiełkowaniu roślin doniczki umieszczono w szklarni (temperatura około

22oC, max 500 µE m-2 s-1 PAR w godzinach południowych) na stanowisku

doświadczalnym opisanym wcześniej (Skórska i in. 1997). Rośliny podlewano co

drugi dzień 50% pożywką Hoaglanda (KNO3 — 304 mg·dm-3, MgSO4 ⋅ 7 H2O —

124 mg·dm-3, NH4H2PO4 — 12 mg·dm-3, Ca(NO3)2 ⋅ 4 H2O — 471 mg·dm-3,

0,001% cytrynian żelaza, mikroelementy). Część dwutygodniowych roślin, będących w fazie drugiego liścia, poddano napromieniowaniu UV-B przy użyciu dwóch lamp TL100W/01 (Philips, Holandia) z maksimum emisji przy długości fali

312 nm. Natężenie napromieniowania wynosiło 1,0 W·m-2, a po 4 tygodniach

zwiększono je do 1,7 W·m-2, mierzono je radiometrem IL1403 z czujnikiem

SEL240-UVB1 (International Light Co., USA). Dla zachowania jednorodności warunków wzrostu rośliny poddane działaniu UV-B (oznaczane dalej jako UV-B) i kontrolne — nie napromieniowane (oznaczane jako K) umieszczono na tym samym stanowisku doświadczalnym, oddzielając rośliny kontrolne od promieniowania ultrafioletowego filtrem szklanym pochłaniającym promieniowanie UV o długości fali < 320 nm, lecz nie pochłaniającym niewielkich ilości promieniowania niebieskiego, które było emitowane przez lampę TL100W/01.

Pomiary fluorescencji chlorofilu

Dzięki wykorzystaniu fluorymetru Plant Efficiency Analyser PEA (Hansatech Ltd., Anglia) metodą nieniszczącą, bez naruszania roślin, wykonano pomiary indukcji fluorescencji chlorofilu a w liściach po 2, 4, 6, 7 i 8 tygodniach napromieniowania roślin UV-B. Zarejestrowano krzywe indukcji fluorescencji, stosując wzbudzenie światłem czerwonym o gęstości strumienia fotonów 1200 µE ·

m-2 s-1. Wyznaczono wartości parametrów Fv/Fm, Fv/Fo i Sc, gdzie Fo, Fm, Fv

oznaczają odpowiednio natężenie fluorescencji zerowej, maksymalnej i zmiennej (Fv = Fm - Fo), a wartość Sc jest proporcjonalna do pola powierzchni nad krzywą indukcji fluorescencji (Murkowski i Skórska 1997). Wyniki przedstawiono w tabelach jako średnie arytmetyczne z 6–8 powtórzeń. Na podstawie analizy wariancji obliczono najmniejsze różnice istotne na poziomie istotności 0,05 i wartości różniące się istotnie oznaczono gwiazdką.

Analiza barwników roślinnych

W celu oznaczenia zawartości barwników fotosyntetycznych wycięto z liści trzy krążki o średnicy 13 mm, które po zważeniu roztarto przy użyciu homogeni-zatora w 80% wodnym roztworze acetonu. Ekstrakty umieszczono w probówkach o pojemności 10 cm3 i odwirowano w ciągu 15 minut przy szybkości 9000 obr/min. Stężenie barwników obliczono według wzorów podanych przez Lichtenthalera (1987) w przeliczeniu na jednostkę świeżej masy tkanki liściowej roślin.

Aby określić zawartość barwników (głównie flawonoidów), pochłaniających promieniowanie ultrafioletowe, przygotowano ekstrakty w następujący sposób:

2,5 cm2 tkanki liści umieszczono w roztworze etanol : woda : kwas octowy

(79 : 20 : 1) i ogrzewano w temperaturze 60oC w ciągu 30 minut. Jako wskaźnik zawartości flawonoidów przyjęto wartość absorbancji przy długości fali 305 nm w przeliczeniu na g świeżej masy [A305 · g-1] oraz na jednostkę powierzchni liścia [A305 · dm-2] według Caldwella i in. (1994).

Wyznaczono specyficzną masę liści (SLW), która określa względną grubość liścia, jako iloraz suchej masy liścia i jego powierzchni [g · m-2].

Omówienie wyników

Zastosowane napromieniowanie UV-B spowodowało bardzo nieznaczne obniżenie wartości wyznaczonych parametrów indukcji fluorescencji liści roślin rzepaku w miarę zwiększenia czasu napromieniowania (tabela 1). Zmniejszenie wartości parametrów indukcji fluorescencji chlorofilu: Fv/Fm, Fv/Fo i Sc świadczy

o obniżeniu sprawności reakcji pierwotnych fotosyntezy w fotosystemie II. Stosunkowo najmniejszym zmianom uległa wartość parametru Fv/Fm, co świadczy o niewielkiej fotoinhibicji wywołanej oddziaływaniem zastosowanego napromie-niowania (Krause i in. 1990). Ujawniła się ona dopiero po 7 tygodniach napro-mieniowania roślin. Wcześniej, bo po 4 tygodniach napromieniowania ultrafiole-tem nastąpiło obniżenie parametru Sc, co wskazuje na naruszenie puli

plastochino-nów na stronie redukcyjnej fotosystemu II (Veselovsky i Veselova 1990); tendencja ta utrzymała się do zakończenia badań. Spadek ten nie był znaczny, wynosił od 10 do 20% w stosunku do roślin kontrolnych. Mniejszej, około 10%

redukcji uległa wartość parametru Fv/Fo, co wskazuje na zakłócenia w funkcjono-waniu kompleksu rozkładu wody zlokalizowanego w donorowej części fotosystemu (Veselovskij i Veselova 1990). Stosunkowo małe obniżenie spraw-ności pierwotnych reakcji fotosyntezy można przypisać względnie małej szkodli-wości promieniowania UV-B emitowanego przez zastosowane lampy, w porówna-niu z lampami używanymi przez innych badaczy. Lampy TL100/01 emitują UV-B w wąskim paśmie około 312 nm, a dodatkowo około 15% UV-A, które może w tych przypadku odgrywać rolę ochronną (Ghorr i Norval 1997: Skórska i in. 1997).

Tabela 1 Parametry indukcji fluorescencji liści roślin rzepaku poddanych napromieniowaniu UV-B — Fluorescence induction parameters of rapeseed plants leaves treated

with UV-B irradiation

Fv/Fm Fv/Fo Sc

Czas napromieniowania

Irradiation time [weeks] _{K UV-B K UV-B K UV-B}

2 tygodniea 0,830 0,825 4,88 4,73 24,5 25,2

4 tygodniea 0,840 0,838 5,30 5,17 38,4 34,3*

6 tygodni 0,842 0,832 5,33 4,96* 43,7 35,2* 7 tygodni 0,842 0,835* 5,33 5,06* 39,5 35,0* 8 tygodni 0,830 0,815* 4,84 4,42* 33,6 27,2* a _{— przy mniejszym natężeniu napromieniowania 1,0 W·m}-2 _{— by lower intensity of irradiation 1,0 W · m}2

Czterotygodniowe napromieniowanie roślin ultrafioletem spowodowało 14% wzrost stężenia chlorofilu b, natomiast w końcowej fazie doświadczenia całkowita ilość chlorofilu, głównie chlorofilu a, uległa redukcji o 10% (tabela 2). Nie zmieniła się zawartość karotenoidów, natomiast minimalnie, ale statystycznie istotnie, zmniejszył się iloraz stężenia chlorofilu i karotenoidów.

Pewnej odpowiedzi na pytanie, dlaczego zastosowane promieniowanie UV-B tylko w niewielkim stopniu naruszyło aktywność pierwotnych reakcji fotosyntezy, dostarcza informacja o zawartości związków, które pochłaniając ultrafiolet „ekranują” to promieniowanie, nie pozwalając przeniknąć mu do wnętrza mezofilu liścia (tabela 3). Wzmożona synteza flawonoidów, związków fenolowych efektyw-nie pochłaniających promieniowaefektyw-nie ultrafioletowe, jest bowiem typową reakcją obronną przed zwiększonym napromieniowaniem UV-B (Teramura i Sullivan 1994). Już po 2 tygodniach napromieniowania roślin rzepaku ultrafioletem zawartość związków pochłaniających ultrafiolet (głównie flawonoli) zwiększyła się znacznie w porównaniu z roślinami nie poddanymi działaniu UV-B, skutecznie chroniąc rośliny przed uszkodzeniem komórek. W miarę kontynuacji napromienio-wania UV-B poziom flawonoidów ulegał stopniowemu obniżeniu, a po 8 tygod-niach napromieniowania był nawet nieco niższy niż w roślinach kontrolnych. Fakt

ten może tłumaczyć obniżenie sprawności pierwotnych reakcji fotosyntezy w tym czasie. Dodatkowych informacji dostarcza specyficzna masa liścia, która jest proporcjonalna do jego grubości. W pierwszej fazie oddziaływania UV-B istotnie obniżyło wartość SLW, tzn. spowodowało, że liście stały się cieńsze, bardziej delikatne, chociaż po dłuższym napromieniowaniu przystosowały się do działa-jącego czynnika stresowego. Przy oddziaływaniu bardziej szkodliwego, szerokopasmowego UV-B, z dużą ilością promieni o długości fali < 300 nm obserwowano efekt zwiększenia grubości liści rzepaku, przy wykorzystaniu skaningowego mikroskopu elektronowego (Cen i Bornman 1993).

Tabela 2 Zawartość barwników fotosyntetycznych (w mg na 1g świeżej masy) w liściach roślin rzepaku poddanych napromieniowaniu UV-B — Concentration of

photo-synthetic pigments (in mg g-1 fresh weight) in leaves of rapeseed plants treated with UV-B irradiation

Czas napromieniowania UV-B — Irradiation time of UV-B [weeks]

4 tygodnie 8 tygodni Barwniki Pigments K UV-B K UV-B Chl a 1,40 1,58 1,85 1,69* Chl b 0,52 0,59* 0,69 0,66 Chl a+b 1,92 2,17 2,54 2,35* Chl a/b 2,71 2,70 2,66 2,54 Karotenoidy 0,38 0,42 0,46 0,44 Chl a+b/Karot. 5,09 5,21 5,57 5,36* Tabela 3 Zawartość flawonoidów i specyficzna masa liści roślin rzepaku poddanych napromieniowaniu UV-B — Content of flavonoids and specific leaf weight (SLW)

of rape seed plants treated with UV-B irradiation A305 · g -1 A305 · dm -2 SLW [g · dm-2] Czas napromieniowania

Irradiation time [weeks] _{K UV-B K UV-B K UV-B}

2 tygodnie 12,5 21,0* 22,0 35,3* 0,15 0,11* 4 tygodnie 14,4 19,8* 27,7 32,6* 0,11 0,11 8 tygodni 15,3 12,2 21,7 19,4 0,14 0,15

Reasumując można stwierdzić, że:

• Rośliny rzepaku napromieniowane UV-B przy pomocy lampy TL100/01

wykazały tylko niewielkie obniżenie sprawności przebiegu pierwotnych reakcji fotosyntezy, dopiero po 4 tygodniach napromieniowania.

• Stwierdzono niewielki wzrost stężenia chlorofilu b w liściach po 4 tygodniach oraz zmniejszenie zawartości chlorofilu a po 8 tygodniach napromieniowania UV-B.

• Stężenie karotenoidów podczas całego doświadczenia nie uległo zmianie.

• Po 2 tygodniach napromieniowania UV-B poziom flawonoidów wrósł

dwu-krotnie, skutecznie chroniąc rośliny przed szkodliwym oddziaływaniem UV-B w początkowym okresie, jednak w miarę zwiększania czasu i natężenia napromieniowania zawartość tych barwników uległa znacznej redukcji.

Podziękowanie

Autorka serdecznie dziękuje za pomoc w oznaczaniu barwników pani Dorocie Rejewskiej. Badania wykonano w ramach grantu wewnątrzuczelnianego. Pomiary natężenia UV-B wykonano radiometrem, zakupionym w ramach grantu KBN nr 6 PO4F 079 14.

Literatura

a field experiment. Plant, Cell and Environment, 17: 267-276.

Cen Y. P., Bornman J. 1993. The effect of exposure to enhanced UV-B radiation on the penetration of monochromatic and polychromatic UV-B radiation in leaves of Brassica napus. Physiol. Plant., 87: 249-255.

Ghorr El A. A., Norval M. 1997. Biological effects of narrow-band (311 nm TL01) UVB irradiance: a review. J. Photochem. Photobiol. B: Biology, 38 (2-3): 99-106.

Krause G. H., Somersalo S., Zumbusch E., Weyers B., Laasch H. 1990. On the mechanism of photoinhibition in chloroplasts. Relationship between changes in fluorescence and activity of Photosystem II. J. Plant Physiol. 136: 472-479.

Lichtenthaler H. K. 1987. Chlorophylls and carotenoids: pigments of photosynthetic biomembranes. Methods in Enzymology, 148: 350-382.

Murkowski A., Skórska E. 1997. Chlorophyll a luminescence – an index of photoinhibition damages. Currents Topics in Biophysics, 21(1): 72-77.

Robberecht R., Caldwell M. M. 1978. Leaf epidermal transmittance of ultrafiolet radiation and its implications for plant sensitivity to ultraviolet-radiation induced injury. Oecologia (Berl.). 32: 277-287.

Skórska E. 1996a. Reakcja liści rzepaku na promieniowanie ultrafioletowe UV-B. Rośliny Oleiste. XVI (1): 287-292.

Skórska E. 1996b. Changes induced by short-term ultraviolet (UV-B) radiation in photosynthetic activities in pea and rape leaves. Folia Histochemica et Cytobiologica. 34 (suppl. 2): 44.

Skórska E., Murkowski A., Mila A. 1997. Stanowiska do uprawy roślin przy zwiększonym napromieniowaniu ultrafioletem B. Mater. IX Międzynar. Sesji Nauk. Instytutu Techniki Rolniczej AR w Szczecinie, 130-135.

Stapleton A. E. 1992. Ultraviolet radiation and plants: Burning questions. Plant Cell, 4 (11): 1353-1358.

Starck Z., Chołuj D., Niemyska B. 1995. Fizjologiczne reakcje roślin na niekorzystne czynniki środowiska. Wyd. SGGW, Warszawa.

Teramura A. H., Sullivan J. H. 1994. Effect of UV-B radiation on photosynthesis and growth of terrestrial plants. Photosynthesis Research, 39 (3): 463-473.

Tevini M., Braun J., Fieser G. 1991. The protective function of the epidermal layer of rye seedlings against ultraviolet-B radiation. Photochem. Photobiol. 53 (3): 329-333.

Veselovsky V. A., Veselova T. V. 1990. Wlijanie ultrafioletovoj radiacii na rastenija. W: Lumines-cencija rastenij. Nauka Moskwa: 146-150.