Analiza chromatograficzna

Ekstrakcję związków polifenolowych z kwiatów różnych wrzosów prowadzono przy użyciu wody, etanolu, mieszaniny woda-etanol (40/60, v/v) oraz octanu etylu. Zawartość kwasów fenolowych w tych ekstraktach przedstawiono w tabeli 9, zaś flawonoidów w tabeli 10. Przykładowy chromatogram wybranych związków fenolowych w ekstrakcie wodno-etanolowym (40/60, v/v) kwiatów wrzosu z Chojnowa przedstawiony został na rysunku 21.

0 5 10 15 20 25 30

80 Tabela 9. Zawartość kwasów fenolowych w ekstraktach kwiatów różnych wrzosów [µg/g].

Kwas p-HBA galusowy kawowy chlorogenowy p-kumarowy ferulowy woda

Wyszków z* 3,64 ± 0,27^a 3,36 ± 0,51^a 8,11 ± 0,38^a 1039 ± 30^a 4,64 ± 0,21^a < Gw

c* 7,58 ± 0,54^b 9,31 ± 2,78^b 12,3 ± 0,82^b 1300 ± 67^b 13,3 ± 1,96^b 47,5 ± 0,75^a Chojnów z 3,86 ± 0,50^ac 4,29 ± 0,97^ac 8,82 ± 1,56^ac 407 ± 32,8^c 8,79 ± 0,05^c < Gw

c 5,21 ± 0,40^acd 4,64 ± 1,19^acd 21,4 ± 1,29^d 511 ± 42,1^cd 11,3 ± 0,47^bd 45,7 ± 0,55^ab Ostrów z 4,14 ± 0,09^acde 3,32 ± 0,^57acde < Gw 948 ± 60,4^ae 9,36 ± 0,29^cde 46,0 ± 0,64^abc c 5,54 ± 0,19^def 4,39 ± 0,86^acdef 5,00 ± 0,82^be 1143 ± 43^aef 13,6 ± 0,20^bf 47,1 ± 0,23^abcd Of z 8,57 ± 1,33^bg 7,82 ± 0,48^bdfg 5,39 ± 0,75^e 958 ± 73,9^a 9,46 ± 0,25^cde 48,2 ± 0,35^abcde c 10,3 ± 0,37^h 9,93 ± 0,63^bg 12,8 ± 0,91^ac 1214 ± 49^bf 12,3 ± 0,72^bdf 49,3 ± 0,94^ade Ob z 5,43 ± 0,45^cdef < Gw 8,50 ± 0,33^abcf 604 ± 32,8^d 3,14 ± 0,10^ag 6,25 ± 0,47^f c 7,32 ± 0,31^bg < Gw 9,82 ± 0,42^f 754 ± 21,3^g 4,18 ± 0,37^ag 6,68 ± 0,54^f 60% etanol

Wyszków z 15,4 + 0,74^a 8,39 + 1,50^a 7,24 + 0,79^a 1584 + 29^a 4,36 + 0,75^a 20,6 + 0,43^a c 15,1 + 0,92^a 8,12 + 0,93^a 7,57 + 0,11^a 1623 + 16^a 6,28 + 0,29^b 20,4 + 0,99^a Chojnów z < Gw < Gw 9,61 + 0,64^b 871 + 30,7^b 7,68 + 0,58^c 28,9 + 0,45^b c < Gw < Gw 15,9 + 1,14^c 1089 + 10^c 7,50 + 0,16^cd 28,5 + 0,19^bc Ostrów z < Gw < Gw < Gw 1425 + 98^d 9,04 + 0,38^e 30,9 + 0,46^d

c 4,21 ± 0,39^b < Gw < Gw 1415 + 54^de 9,04 + 0.11^ef 31,9 + 1,18^d Of z 7,82 ± 0,64^c < Gw < Gw 1296 + 28^def 7,86 + 0,07^cdg 29,3 + 0,49^bcd

c 7,75 + 0,50^cd < Gw 3,56 + 0,18^d 1289 + 44^def 8,18 + 0,19^cdefg 29,8 + 0,14^bcd Ob z 3,64 + 0,27^b < Gw 4,50 + 0,18^de 996 + 20,1^cg < Gw 6,69 + 0,55^e

c 4,64 + 0,36^bd < Gw 5,18 + 0,11^de 971 + 16,3^bcg 3,11 + 0,10^h 11,30 + 0,74^f

80

81

Kwas p-HBA galusowy kawowy chlorogenowy p-kumarowy ferulowy 100% etanol

Wyszków z 5,89 + 0,50^a < Gw < Gw 1003 + 62^a 9,21 + 0,05^a 29.0 + 0,06^a c 10,6 + 0,64^b < Gw 9,13 + 1,14^a 1510 + 159^b 13,9 + 0,46^b 30,9 + 0,64^ab Chojnów z < Gw < Gw < Gw 290 + 7,5^c 7,14 + 0,04^c 28,7 + 0,55^abc c 3,50 ± 0,22^c < Gw 3,68 + 0,25^b 411 + 18,9^cd 8,32 + 0,11^ad 29,4 + 0,41^abcd Ostrów z < Gw < Gw < Gw 406 + 7,1^cde 8,43 + 0.04^ade 28,6 + 0,29^abcde

c 3,10 + 0,25^c < Gw < Gw 614 + 25,6^ef 9,79 + 0,34^ade 28,6 + 0,51^abdef Of z 4,94 + 0,23^d < Gw < Gw 313 + 30,1^cdeg 7,53 + 0,19^acdef 28,6 + 0,84^abcdefg c 6,25 + 0,46^ae < Gw < Gw 364 + 47,6^cdgh 7,82 + 0,28^acdef 29,0 + 0,80^abcdefg Ob z 5,11 + 0,21^adf < Gw < Gw 125 + 6,6^c < Gw < Gw

c 5,46 + 0,14^adef < Gw 4,96 + 0,23^b 450 + 19,5^cdefgh < Gw 7,50 + 0,95^h octan etylu

Wyszków z < Gw < Gw 7,49 + 0,14^a 1289 + 15^a 7,42 + 0,36^a 28,9 + 0,35^a Chojnów z 4,50 + 0,54^a < Gw 8,68 + 0,73^b 2253 + 126^b 9,28 + 0,33^ab 29,7 + 0,44^ab Ostrów z 3,03 + 0,33^a < Gw 3,04 + 0,4^c 2282 + 149^b 9,89 + 0,49^abc 28,9 + 0,31^abc Of z 8,75 + 0,69^b 5,18 + 0,73^a 11,5 ± 2,52^b 2000 + 55^bc 10,1 + 0,13^bc 30,0 + 0,61^abc Ob z 5,25 + 0,27^a < Gw 4,87 + 0,13^ac 1021 + 32^a 3,39 + 0,31^d 4,82 + 0,48^d

Wartość średnia+ odchylenie standardowe (n=3). *z – ekstrakcja w temp. 20 ^oC; c – ekstrakcja w temp. 55 ^oC.

Of – fioletowy wrzos ogrodowy, Ob – biały wrzos ogrodowy.

Różne litery w kolumnach pionowych dla danego związku i warunków ekstrakcji oznaczają, ze wartości różnią się miedzy sobą w sposób statystycznie istotny na 95% poziomie istotności (p<0,05). < Gw – poniżej granicy wykrywalności

81

82 Tabela 10. Zawartość wybranych flawonoidów w kwiatach różnych wrzosów [µg/g].

rutyna apigenina luteolina naringina kwercetryna kwercetyna tricetin kemferol katechina epikatechina

woda

Wyszków z* < Gw 5,54 + 0,31^a < Gw < Gw 5,32 + 0,80^a 10,8 + 4,26^a 5,24 + 0,88^a < Gw 126 + 5,91^a < Gw

c* 6,46 + 0,01^a 12,6 + 1,26^b 4,92 + 0,50^a 8,60 + 4,42^a 23,6 + 1,04^b 9,94 + 0,61^ab 8,76 + 1,14^b < Gw 152 + 6,30^ab 182 + 8,21^a Chojnów z 5,33 + 0,50^ab 9,36 + 0,95^c < Gw < Gw 7,36 + 0,22^ac 7,06 + 2,33^abc < Gw < Gw 75,8 + 0,79^ac 108 + 4,01^b c 5,91 + 0,43^ab 10,4 + 0,55^bcd < Gw < Gw 14,4 + 0,19^d 7,84 + 0,42^abcd 6,79 + 1,24^abc < Gw 149 + 9,41^abd 116 + 3,70^c Ostrów z < Gw 9,29 + 0,80^cde 6,74 + 0,37^b < Gw 8,14 + 0,37^ace 5,80 + 0,28^abcde < Gw < Gw 66,8 + 7,50^ce 124 + 11,1^bd

c < Gw 9,56 + 0,98^cdef 6,49 + 0,55^b 4,42 + 0,88^ab 17,1 + 1,81^def 8,50 + 0,89^abcdef 5,34 + 0,24^abc < Gw 105 + 1,81^abdf 158 + 7.49^e Of z 9,24 + 0,33^c 10,3 + 0,61^bcdfg 6,58 + 0,38^b 9,13 + 2,04^abc 16,6 + 3,20^df 5,20 + 1,54^abcdef < Gw < Gw 84,1 + 9,60^acefg 135 + 8,70^cdf

c 12,2 + 1,20^d 10,5 + 0,80^bcdfg 6,80 + 0,51^b 13,8 + 2,04^c 26,7 + 1,60^b 20,5 + 2,21^g < Gw < Gw 93,9 + 10,6^acefgh 143 + 8,32^def Ob z < Gw 4,40 + 0,21^ah < Gw < Gw 11,5 + 1,07^deg 30,9 + 1,20^h < Gw < Gw 81,5 + 17,7^acghi < Gw

c < Gw 5,24 + 0,98^ah < Gw < Gw 12,4 + 0,25^dg 39,8 + 6,31ⁱ < Gw < Gw 95,1 + 5,86^acefhi < Gw

60% etanol

Wyszków z 25,7 + 3,78^a 96,4 + 17.0^a 7,03 + 2,44^a 20,5 + 2,50^a 134 + 10,5^a 35,3 + 5,82 63,9 + 0,86 < Gw 1075 + 35,7 354 + 6,28^a c 33,9 + 1,36^b 129 + 6,57^b 9,78 + 2,53^a 43,2 + 1,79^b 194 + 4,25^b 33,2 + 1,30 85,7 + 4,53 9,88 + 1,28 1139 + 84,6 371 + 18,6^a Chojnów z 3,38 + 0,21^c 53,9 + 8,69^c 9,14 + 1,25^a < Gw 13,8 + 0,81^c 7,19 + 1,63 17,6 + 1,47 6,92 + 0,79 117 + 11,0 70,3 + 6,9^b c 3,36 + 0,25^c 67,1 + 3,21^c 9,22 + 0,94^a < Gw 9,14 + 0,77^c 13,0 + 0,79 15,4+ 0,36 8,60 + 0.69 175 + 9,4 74,3+ 2,5^bc Ostrów z < Gw 11,1 + 2,46^d < Gw < Gw 25,2 + 1,34^d 29,6 + 2,61 16,4 + 2,15 5,05 + 0,25 180 + 13,6 86,8 + 3,2^bcd

c < Gw 17,4 + 1,21^d < Gw < Gw 26,8 + 1,29^de 40,4 + 5,57 15,0 + 1,45 3,11 + 0,36 226 + 11,5 88,8 + 5,5^bcdef Of z 8,85 + 0,55^d 27,6 + 7,03^d < Gw 3,91 + 0,42 27,6 + 1,87^de 68,8 + 3,80 < Gw 9,99 + 2,11 95.5 + 7,6 82,1 + 6,7^bcdefg

c 10,8 + 1,33^d 31,4 + 6,24^d < Gw 6,46 + 1,20 29,2 + 1,84^de 96,3 + 3,58 3,24 + 0,34 3,87 + 0,27 195 + 4,2 89,0 + 11,7^bcdefg

Ob z < Gw 38,1 + 1,65 3,57 + 0,62 < Gw 23,7 + 1,21^de 86,3 + 6,90 < Gw < Gw 133 + 8,8 < Gw

c < Gw 44,3 + 3,17 6,96 + 1,17 < Gw 30,5 + 1,00^de 102 + 4,3 < Gw < Gw 195 + 16,4 < Gw

82

83

rutyna apigenina luteolina naringina kwercetryna kwercetyna tricetin kemferol katechina epikatechina

100% etanol

Wyszków z 8,32 + 1,57^a 77,8 + 8,25^a < Gw 19,8 +16,1^a 50,0 + 3,78^a 9,92 + 1,46^a 7,75 + 1,54^a 7,07 ± 0,64^a 40,7 ± 2,46^a 331 ± 10,5^a c 16,9 + 1,68^b 8,78 + 1,86^b 8,76 + 0,02^a 22,6 +3,49^a 89,9 + 5,71^b 23,8 + 1,89^b 34,8 + 2,28^b 48,2 ± 2,10^b 24,4 + 1,71^b 896 ± 53,2^b Chojnów z 3,29 + 0,31^c 55,9 + 7,91^c 4,37 + 0,85^b < Gw 5,34 + 0,57^c 2,36 + 0,46^ac 6,11 + 0,77^c 3,65 ± 0,57^c 28,6 + 2,0^abc 51,9 ± 5,3^c

c 4,23 + 0,40^cd 67,8 + 0,76^ac 5,68+0,40^bc < Gw 15,4 + 1,27^d 4,81 + 1,11^ac 12,8 ± 1,04^d 13,1 ± 0,25^d 77,3 ± 6,0^d 87,8 ± 2,7^cd Ostrów z < Gw 18,5 + 1.90^bd < Gw < Gw 19,4 + 1,47^e 15,0 +1,03^ab 6,84 ± 0,87^ac 5,74± 0,65^ace 53,2±4,3^ae 92,6 ± 6,4^cde c 3,35 + 0,27^cd 27,1 + 3,95^e 3,75+0,76^bd < Gw 39,2 + 2,88^f 29,1 ± 2,57^b 20,4 ± 1,48^e 8,02± 0,33^aef 114 ± 9,5^f 167 ± 0,9^f Of z 9,48 + 0,98^ae 14,1 + 2,36^bf < Gw < Gw 20,1 + 1,58^deg 40,4 ± 3,04^d < Gw 5,59±1,45^acef 38,2 ± 2,8^abce 50,1 ± 5,6^cdeg

c 8,20 + 0,69^ae 20,3 + 1,82^bdfg < Gw 3,06 +1,10^b 21,3 + 0,86^degh 38,8 ± 2,40^de < Gw < Gw 58,1 ± 4,3^e 56,7 ± 3,5^cdeg Ob z < Gw 28,1 + 2,09^dgh 3,45 + 0,74^d < Gw 8,39 + 0,59^cd 42,6 ± 3,43^de < Gw < Gw < Gw < Gw

c < Gw 39,3 + 3,41^h 5,00+0,94^bcd < Gw 27,6 ± 1,49^h 71,6 ± 5,30^f < Gw < Gw 117,3 ± 8,78^f < Gw

octan etylu

Wyszków z 5,67 + 0,64^a 29,4 + 3,92^a 4,50 + 1,04^a 4,61 + 0,53 18,2 + 3,11^a 8,00 + 1,50^a 19,7 + 0,79^a 6,14 + 0,93^a 78,9 + 3,10^a 55,0 + 2,14^a Chojnów z 8,98 + 0,50^b 92,7 + 5,77^b 3,09 + 0,67^ab 13,1 + 2,57 30,6 + 1,19^b 14,6 + 0,98^b 42,6 + 0,23^b 3,11 + 0,60^b 167 + 4,5^b 122 + 9,0^b Ostrów z 5,20 + 0,95^a 28,9 + 1,64^a < Gw < Gw 41,5+ 3,21^c 63,3 + 3,55^c 38,5 + 2,94^b 10,2 + 1,66^c 233 + 8,5^c 128 + 7,3^bc Of z 19,5 + 0,65^c 45,3 + 2,57^c 7,03 + 0,57^c 23,5 + 1,26 61,3 + 1,33^d 93,7 + 7,10^d 9,97 + 0,54^c 17,8 + 3,25^d 190 + 10,9^b 128 + 9,6^bc Ob z < Gw 43,0 + 2,03^c 4,76 + 0,98^ab < Gw 33,9 + 2,09^b 102 + 6,4^d < Gw < Gw 133 + 12,6^d < Gw

Wartość średnia+ odchylenie standardowe (n=3). *z – ekstrakcja w temp. 20 ^oC; c – ekstrakcja w temp. 55 ^oC.

Of – fioletowy wrzos ogrodowy; Ob – biały wrzos ogrodowy.

Różne litery w kolumnach pionowych dla danego związku i ekstrahenta oznaczają, ze wartości różnią się miedzy sobą w sposób statystycznie istotny na 95% poziomie istotności (p<0,05); < Gw – poniżej granicy wykrywalności.

83

84 Rys. 21. Chromatogram wybranych związków fenolowych w ekstrakcie wodno-etanolowym (40/60, v/v) kwiatów wrzosu z Chojnowa. RP-HPLC, kolumna Kinetex C-18, eluent: 2 mmol/L kwas mrówkowy/ acetonitryl.

Kwas chlorogenowy jest głównym związkiem polifenolowym obecnym we wszystkich ekstraktach wrzosowych, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami [12,17]. Jest on znany ze swoich właściwości antyoksydacyjnych, a także zdolności do regulacji poziomu glukozy oraz pozytywnego wpływu na ciśnienie krwi [210]. Efektywność ekstrakcji kwasu chlorogenowego z kwiatów wrzosu maleje w szeregu: octan etylu < 60% etanol < woda <

etanol. Największą jego zawartość oznaczono w kwiatach wrzosu z Nadleśnictwa Wyszków, a najmniejszą w próbkach z Chojnowa oraz w kwiatach ogrodowego wrzosu białego.

Zawartości kwasu chlorogenowego ekstrahowane 60% roztworem etanolu w obu badanych temperaturach różnią się miedzy sobą w sposób statystycznie istotny (test Anova, p<0,05), natomiast jego zawartość po ekstrakcji octanem etylu próbek wrzosu leśnego z Chojnowa i Ostrowi Mazowieckiej oraz białego wrzosu ogrodowego nie wykazują statystycznych różnic.

Kwas chlorogenowy występuje w roślinach w postaci różnych izomerów, najczęściej spotykanym z nich jest kwas 5-O-kawoilochinowy. Marques i in. [211] podają, że zawartość tego izomeru w metanolowych ekstraktach z roślin leczniczych wynosi od 40 µg/g dla miłorzębu japońskiego (Ginko biloba) do 16000 µg/g dla yerba mate (Ilex paraguariensi L.).

0 5 10 15 20 25

85 Liście karczocha zawierają od 0,29 do 0,92 mg/g kwasu 5-O-kawoilochinowego, zaś sok brzoskwiniowy, jabłkowego i winogronowy odpowiednio 0,92; 4,21 oraz 0,75 mg/L [212,213]. Na podstawie uzyskanych wyników można uznać, że kwiaty wrzosu są bardzo dobrym źródło kwasu chlorogenowego i można wykorzystać jego ekstrakty w przemyśle farmaceutycznym, kosmetycznym oraz jako dodatek do żywności.

Kwas ferulowy został oznaczony na podobnym poziomie zawartości we wszystkich próbkach kwiatów wrzosu. Natomiast na zawartość kwasów hydroksycynamonowych znaczący wpływ miało miejsce pobrania próbki. Kwas galusowy występuje głównie w ekstraktach wodnych, ale brak go w próbkach ogrodowego wrzosu białego. Kwas p-HBA słabo ekstrahował się etanolem, szczególnie w niższej temperaturze. Wzrost temperatury procesu ekstrakcji w niektórych układach nie powodował znaczącego wzrostu zawartości ekstrahowanego kwasu polifenolowego. Różnice w wynikach otrzymanych dla różnych wrzosów są najprawdopodobniej spowodowane różnymi warunkami środowiskowymi, np.

składem gleby, dostępnością składników odżywczych czy też dostępnością światła.

W badanych ekstraktach kwiatów wrzosu oznaczono także zawartości popularnych flawonoli (kwercetyna, kemferol, rutyna, kwercetyna), flawonów (apigenina, luteolina), flawononu naringiny oraz katechin. Ponadto analiza chromatograficzna wykazała obecność tricetinu (5,7,3’,4’,5’-pentahydroksy flawonu), silnego antyutleniacza o właściwościach przeciwnowotworowych [214], który nie został do tej pory zidentyfikowany we wrzosie. Co ciekawe tricetin w największym stężeniu występuje w kwiatach wrzosu leśnego po ekstrakcji 60% roztworem etanolu, natomiast w kwiatach wrzosu ogrodowego występuje tylko w śladowych ilościach bądź nie występuje wcale. W ekstraktach wodnych wszystkich próbek wrzosu, a także we wszystkich ekstraktach ogrodowego wrzosu białego nie oznaczono kemferolu w postaci aglikonu, jednakże na podstawie znajomości ścieżek fragmentacji i obecności sygnałów m/z 447/285 i 447/255 udało zidentyfikować się glikozydy kemferolu:

kemferol-3-O-galaktozyd oraz kemferol-3-O-glukozyd. Zarówno ekstrakty z wrzosu leśnego jak i ogrodowego zawierają bardzo dużo katechin (Tabela 10). Flawonoidy rozpuszczają się lepiej w alkoholach niż w wodzie, jednak najlepsze efektywności procesu ekstrakcji uzyskuje się przy użyciu mieszanin wodno-alkoholowych, np. zawartość katechiny w wodnym ekstrakcie z kwiatów wrzosu z Wyszkowa wynosi (152,1 ± 6,3) µg/g, zaś w ekstrakcie wodno-etanolowym (1139 ± 84,6) µg/g. Najwyższe efektywności procesu ekstrakcji flawonoidów uzyskano stosując 60% roztwór etanolu, a następnie octan etylu. Generalnie, wrzosy leśne

86 charakteryzują się większą różnorodnością związków flawonoidowych, zwłaszcza w porównaniu do białej odmiany ogrodowej. Jednak ekstrakty wrzosu ogrodowego zawierają znacznie większe zawartości kwercetyny w porównaniu do wrzosu zbieranego w lesie. Obecność glikozydu naringiny stwierdzono tylko w ekstraktach wrzosów leśnych z Wyszkowa i Chojnowa (jedynie w przypadku ekstrakcji octanem etylu) oraz białego wrzosu ogrodowego.