Całkowita zawartość flawonoidów i antocyjanów

Całkowita zawartość flawonoidów w ekstraktach z kwiatów wrzosu została oznaczona według dwóch procedur opisanych w rozdziale 5.5. Widma UV-Vis badanych ekstraktów wrzosów leśnych wraz z widmami odpowiednich związków wzorcowych przedstawiono na rysunku 22. Na widmie zarejestrowanym dla procedury 1 brak jest maksimum absorpcji charakterystycznego dla kwercetyny przy λ = 435 nm, zarówno dla ekstraktów z kwiatów wrzosu leśnego jak i ogrodowego. Przeprowadzenie badań przy zastosowaniu procedury 2 pozwoliło na uzyskanie podobnych widm absorpcji dla badanych ekstraktów i katechiny. Jest to związane z dużą zawartością katechin we wszystkich ekstraktach z kwiatów wrzosu.

Jednakże oznaczenie całkowitej zawartości flawonoidów według tej procedury może prowadzić do uzyskania zawyżonych wyników, gdyż inne związki, które nie należą do flawonoidów mogą tworzyć kompleksy z Al(III) z maksimum absorpcji przy około 510 nm; np.

kwas chlorogenowy zawierający ugrupowanie katecholowe [215].

350 400 450 500 550 600 650 700

0,0

Rys. 22. Widma UV-Vis ekstraktów wodno-etanolowych z fioletowych kwiatów wrzosu i substancji wzorcowych zarejestrowane dla procedur 1 i 2.

87 Zawartość flawonoidów w ekstraktach z kwiatów wrzosu została oznaczona zatem według procedury 2 i wyrażona w µmol katechiny/g kwiatów wrzosu (Tabela 11). Największą zawartością flawonoidów charakteryzują się ekstrakty z kwiatów wrzosu przygotowane w mieszaninie wody i etanolu (40/60, v/v) i octanie etylu (Rysunek 23 i 24). Różnica pomiędzy zawartością flawonoidów we frakcji wodnej i wodno-alkoholowej jest znacząca i wynosi około 20% dla wszystkich próbek. Całkowita zawartość flawonoidów w kwiatach wrzosu wynosi 111,6-181,7 µmol katechiny/g dla ekstraktów w 60 % etanolu; 74,6-126,0 µmol katechiny/g dla ekstraktów wodnych oraz 141,8-188,4 µmol katechiny/g dla ekstraktów w octanie etylu (temperatura ekstrakcji 20^oC). Najniższe wyniki uzyskano przy zastosowaniu czystego alkoholu etylowego. Wzrost temperatury w procesie ekstrakcji nie wpływa znacząco na jej efektywność w przypadku zastosowania 60% etanolu jako ekstrahenta.

88

Rys. 23. Całkowita zawartość flawonoidów w wodnych i wodno-etanolowych ekstraktach z kwiatów różnych wrzosów.

ekstrakcja wodą 60 % EtOH 100 % EtOH octan etylu

89 Rys. 24. Wpływ rozpuszczalnika na zawartość flawonoidów w kwiatach wrzosu z Wyszkowa

i ogrodowego fioletowego.

Całkowita zawartość monomerycznych antocyjanów została oznaczona za pomocą metody różnicowej pH. Ekstrakty z białych kwiatów nie wykazują maksimum absorpcji przy λ = 520 nm, nie zawierają więc antocyjanów. Tabela 12 przedstawia zawartość antocyjanów, wyrażoną w mg chlorku cyjanidyno-3-glukozydu/g, w ekstraktach z kwiatów różnych wrzosów.

Spośród leśnych roślin, ekstrakty z wrzosu zebranego z terenów Nadleśnictwa Wyszków charakteryzują się najwyższą zawartością monomerycznych antocyjanów (Rys. 25).

Najuboższe w antocyjany są kwiaty wrzosu leśnego z Chojnowa. Kwiaty wrzosu ogrodowego mają największą zawartość antocyjanów, co potwierdza, że warunki środowiskowe mają decydujący wpływ na zawartość związków polifenolowych. Zawartość antocyjanów w ekstraktach wodno-etanolowych z kwiatów wrzosu pobranych z trzech różnych obszarów leśnych na terenie Mazowsza kształtuje się na podobnym poziomie, tj. 0,47-0,89 mg chlorku cyjanidyno-3-glukozydu/g próbki, gdy ekstrakcja była prowadzona w temperaturze pokojowej oraz 0,49-0,92 mg chlorku cyjanidyno-3-glukozydu/g, gdy ekstrakcja była prowadzona w podwyższonej temperaturze (55°C). Najwyższe efektywności procesu ekstrakcji antocyjanów uzyskano z zastosowaniem mieszaniny wody i alkoholu etylowego (40/60, v/v), a także octanu etylu (Rys. 25).

woda

90 Tabela 12. Zawartość antocyjanów w kwiatach różnych wrzosów [mg chlorku cyjanidyno-3-glukozydu/g].

Rys. 25. Wpływ rozpuszczalnika na zawartość antocyjanów w kwiatach wrzosu (Nadleśnictwo Ostrów Maz.) oraz zawartość antocyjanów w wodnych i wodno-etanolowych (40/60, v/v) ekstraktach z kwiatów wrzosu.

ekstrakcja wodą 60 % EtOH 100 % EtOH octan etylu

20°C 55°C 20°C 55 °C 20°C 55°C 20°C

Wyszków 0,24 ± 0,01 0,52 ± 0,05 0,89 ± 0,04 0,92 ± 0,08 0,67 ± 0,08 1,11 ± 0,04 0,86 ± 0,03 Ostrów 0,35 + 0,00 0,51 + 0,01 0,74 + 0,01 0,80 + 0,02 0,46 + 0,03 0,62 + 0,05 0,57 + 0,01 Chojnów 0,19 + 0,01 0,26 + 0,01 0,47 + 0,02 0,49 + 0,02 0,24 + 0,01 0,41 + 0,07 0,43 + 0,02 Of 0,56 + 0,02 0,76 + 0,02 1,18 + 0,04 1,18 + 0,06 0,62 + 0,04 1,03 + 0,03 0,99 + 0,05

woda 60% etanol 100% etanol octan etylu

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

Wrzos leśny Ostrów Maz.

mg chlorku cyjanidyno-3-glukozydu/g 20^oC 55^oC

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

Wyszków Ostrów Chojnów

60% etanol woda

mg chlorku cyjanidybo-3-glukozydu/g

20^oC 55^oC 20^oC 55^oC

Of

90

91 6.4. Właściwości antyutleniąjace ekstraktów

Metoda Folina-Ciocalteu (FC) i metoda CUPRAC

Jeden z kierunków działania związków polifenolowych jako antyutleniaczy wykorzystuje ich właściwości redukujące, np. przy zapobieganiu peroksydacji lipidowej. Do wyznaczania całkowitej zdolności redukującej otrzymanych ekstraktów z kwiatów różnych wrzosów zastosowano metodę Folina-Ciocalteu (FC) oraz metodę CUPRAC. Otrzymane wyniki zestawiono w tabelach 13-14 oraz na rysunkach 26-27.

Największe zdolności redukujące wykazują ekstrakty z kwiatów wrzosu zebranych z terenu Nadleśnictwa Wyszków i Ostrów Mazowiecka, a także fioletowych kwiatów wrzosu ogrodowego. Właściwości redukujące są silnie skorelowane z zawartością związków polifenolowych, zwłaszcza flawonoidów. Wyżej wymienione ekstrakty zawierały najwięcej flawonoidów, oznaczonych zarówno chromatograficznie, jak i spektrofotometrycznie.

Frakcje w octanie etylu oraz mieszaninie wody i etanolu (40/60, v/v) zawierają dużo kwasu chlorogenowego (od 0,8 mg/g do 2,3 mg/g) i posiadają bardzo silne właściwości redukujące oznaczone metodą FC. Najniższe wyniki uzyskano przy zastosowaniu czystego etanolu jako ekstrahenta. Ekstrakty w octanie etylu (29,7 mg/g) z części naziemnych wrzosów zebranych z terenów północnej Turcji charakteryzowały się najwyższymi wynikami zdolności redukujących (metoda FC) w porównaniu do wyników uzyskanych dla ekstraktów w n-butanolu (15,9 mg/g), chloroformie (6,7 mg/g) i wodzie (5,8 mg/g) [17].

0

92 Tabela 13. Zdolności redukujące ekstraktów z kwiatów różnych wrzosów wyznaczone metodą Folina-Ciocalteu (mg kwasu galusowego/g).

Tabela 14. Zdolności redukujące ekstraktów z kwiatów różnych wrzosów wyznaczone metodą CUPRAC (mmol troloksu/g).

ekstrakcja wodą 60 % EtOH 100 % EtOH octan etylu

Nadleśnictwo 20° C 55°C 20°C 55°C 20°C 55°C 20°C

Wyszków 36,8 + 1,08 63,9 + 3,60 79,8 + 5,76 81,0 + 6,87 35,4 + 4,30 51,3 + 3,10 81,2 + 3,70 Ostrów 45,6 + 0,33 59,1 + 1,45 81,0 + 3,31 92,1 + 3,83 36,8 + 0,63 53,3 + 2,44 86,5 + 0,89 Chojnów 38,9 + 0,20 50,4 + 3,15 75,7 + 2,77 80,0 + 2,00 30,2 + 1,43 47,4 + 1,01 75,0 + 0,81 Of 59,4 + 1,65 74,3 + 2,72 89,1 + 1,45 113,9 + 2,25 48,1 + 1,01 66,1 + 3,19 98,8 + 6,05 Ob 41,2 + 0,28 57,6 + 1,07 74,5 + 1,40 81,0 + 1,90 32,5 + 2,19 52,5 + 1,94 71,6 + 1,01

ekstrakcja wodą 60 % EtOH 100 % EtOH octan etylu

Nadleśnictwo 20°C 55°C 20°C 55°C 20°C 55°C 20°C

Wyszków 6,60 + 0,07 7,00 + 0,09 16,50 + 1,98 17,10 + 0,45 6,70 + 0,12 8,30 + 0,09 10,00 + 0,31 Ostrów 7,60 + 0,31 10,50 + 0,36 10,60 + 0,51 11,30 + 0,44 6,10 + 0,16 8,60 + 0,56 10,50 + 0,11 Chojnów 6,30 + 0,24 8,20 + 0,48 8,80 + 0,16 10,00 + 0,48 4,90 + 0,14 7,90 + 0,48 10,00 + 0,33 Of 9,10 + 0,36 11,70 + 0,70 10,90 + 0,84 13,30 + 0,23 6,70 + 0,14 9,90 + 0,45 12,20 + 0,52 Ob 6,50 + 0,17 8,40 + 0,35 11,90 + 0,22 12,80 + 0,41 6,00 + 0,28 8,70 + 0,22 11,90 + 0,05

92

93 Rys. 27. Wpływ rozpuszczalnika na zdolności redukujące ekstraktów z kwiatów wrzosu (Nadleśnictwo Wyszków i ogrodowy fioletowy)

wyznaczone metodą Folina-Ciocalteau (A) oraz metodą CUPRAC (B).

woda

94 Obie metody badania właściwości redukujących próbek kwiatów wrzosu dają podobne rezultaty.

Metoda z rodnikiem DPPH^•

Właściwości antyoksydacyjne ekstraktów z kwiatów wrzosu zostały wyznaczone także w oparciu o zdolność do neutralizacji wolnych rodników DPPH^•. Przebieg kinetyki tej reakcji na przykładzie ekstraktu wodno-etanolowego z kwiatów różnych wrzosów przedstawiono na rysunku 28. Przez pierwsze kilka minut reakcji obserwuje się znaczący spadek absorbancji roztworu DPPH^•, potem reakcja przebiega już wolniej aż do osiągnięcia plateau. Ten pierwszy, szybki etap związany jest z przeniesieniem elektronu z pierścienia B (C3’-OH oraz C4’-OH) cząsteczki do rodnika DPPH^•, następnie zaś z rodnikiem reagują produkty powstałe w wyniku częściowego utlenienia związków polifenolowych [198].

0 5 10 15 20 25 30

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Leśny Chojnów Leśny Wyszków

Ogrodowy fioletowy Ogrodowy biały

Leśny Ostrów Maz.

Absorbancja

Czas, min

Rys. 28. Kinetyka wychwytu rodnika DPPH^• przez wodno-etanolowe ekstrakty z kwiatów różnych wrzosu.

Uzyskane wyniki w tej metodzie są przedstawiane w różny sposób. W tabeli 15 zamieszczono wyniki zdolności antyutleniających ekstraktów z kwiatów różnych wrzosów wyrażone w % neutralizacji rodnika DPPH^• wyznaczone po 30 minutach, a na rysunkach 29-30 w formie graficznej wyniki wyrażone w mmol troloksu/L. Ekstrakty w etanolu i octanie etylu wykazywały najsilniejsze zdolności do neutralizacji rodników, a najwyższe wyniki uzyskano dla kwiatów wrzosu z Nadleśnictwa Wyszków i Ostrów Mazowiecka oraz ogrodowego fioletowego. Badania pokazują, że rośliny ogrodowe, które mają zapewnione

95 bardzo dobre warunki do rozwoju, mają wyższe właściwości antyoksydacyjne w porównaniu do roślin rosnących w środowisku naturalnym [216,217].

Wysoka zawartość kwasu chlorogenowego sprawia, że ekstrakty z kwiatów wrzosu charakteryzują się tak dobrymi właściwości antyoksydacyjnymi. Deliorman-Orhan i in. [17]

zbadali różne ekstrakty z wrzosu i stwierdzili, iż frakcje w octanie etylu i n-butanolu są najaktywniejsze w reakcji z rodnikami DPPH^•, ze zdolnością do ich neutralizacji odpowiednio 85,7% dla octanu etylu i 78,9% dla n-butanolu. Etanolowe ekstrakty z wrzosu wykazywały największą zdolność do neutralizacji rodników DPPH^• w porównaniu do ekstraktów z Ferula hermonis i Tribulus terrestris, które znane są ze swoich właściwości zdrowotnych i przeciwutleniających [16].

Rys. 29. Właściwości antyutleniające wodnych i wodno-etanolowych ekstraktów z różnych kwiatów wrzosu (Of – fioletowy wrzos ogrodowy, Ob – biały wrzos ogrodowy).

0

96 Tabela 15. Właściwości antyutleniające ekstraktów z kwiatów różnych wrzosów (% neutralizacji rodnika po 30 min).

ekstrakcja wodą 60 % EtOH 100 % EtOH octan etylu

Nadleśnictwo 20 ° C 55 ° C 20 ° C 55 ° C 20 ° C 55 ° C 20 ° C

Wyszków 55,6 + 4,9 55,9 + 4,3 62,0 + 11,4 67,3 + 5,3 74,9 + 0,8 85,8 + 3,3 66,8 + 3,7 Ostrów 47,1 + 2,5 56,9 + 6,4 72,8 + 6,3 76,3 + 5,9 67,2 + 6,2 86,6 + 1,8 87,5 + 0,5 Chojnów 36,3 + 1,8 49,9 + 3,3 57,8 + 12,3 75,9 + 4,3 57,9 + 1,2 82,7 + 0,8 77,4 + 6,8 Of 55,1 + 2,4 74,8 + 4,1 77,0 + 10,0 77,6 + 8,8 80,1 + 1,8 90,0 + 1,1 84,1 + 2,9 Ob 30,7 + 2,8 43,9 + 3,2 41,8 + 5,8 65,7 + 3,2 62,6 + 4,7 86,8 + 4,0 43,8 + 4,0

Rys. 30. Wpływ rodzaju rozpuszczalnika na właściwości antyutleniąjace ekstraktów z kwiatów wrzosu (Nadleśnictwo Wyszków i ogrodowy fioletowy) w metodzie DPPH.

woda 60% etanol 100% etanol octan etylu

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Wrzos leśny Wyszków

mmol troloksu/g 20^oC % ( 55^oC)

woda 60% etanol 100% etanol octan etylu

0 2 4 6 8 10

Wrzos ogrodowy fioletowy

mmol troloksu/g 20^oC 55^oC

96

97 6.2. Zastosowanie cieczy jonowych do ekstrakcji

Ciecze jonowe zaliczane są do nowej klasy rozpuszczalników o niespotykanych dotychczas właściwościach. Charakteryzują się dużą stabilnością termiczną, małą prężnością par, a tym samym małą lotnością. W ostatnich zyskują popularność do ekstrakcji związków bioaktywnych z próbek roślinnych [213,218,219]. Właściwości fizyczne i chemiczne cieczy jonowej, takie jak polarność, hydrofobowość, temperatura topnienia, lepkość, czy gęstość można modelować poprzez dobór odpowiedniego kationu lub anionu. W pracy zbadano efektywność ekstrakcji związków polifenolowych na przykładzie kwiatów wrzosu z Nadleśnictwa Wyszków przy użyciu cieczy jonowych składających się z tego samego kationu 1-butylo-3-metyloimidazoliowego oraz trzech różnych anionów (Cl-, BF4-, PF6-). Stwierdzono, że zarówno rodzaj użytej cieczy jonowej jak i jej stężenie ma znaczący wpływ na zawartość flawonoidów w ekstraktach (Rys. 31). Efektywność ekstrakcji przy użyciu chlorku 1-butylo-3-metyloimidazoliowego ([Bmim]Cl) i tetrafluoroboranu 1-butylo-3-1-butylo-3-metyloimidazoliowego ([Bmim]BF4) wzrasta wraz ze stężeniem, podczas gdy wyniki uzyskane dla różnych stężeń heksafluorofosforanu 1-butylo-3-metyloimidazoliowego ([Bmim]PF6) nie są statystycznie różne (p<0,05), co może być związane z hydrofobowością tej cieczy jonowej. Zastosowanie cieczy jonowych o wyższym stężeniu (2 i 3 mol/dm³) nie spowodowało statystycznie istotnego wzrostu polifenoli w ekstraktach, stąd też dalsze badania prowadzone były przy użyciu cieczy o stężeniu 1 mol/dm³. Największą efektywność ekstrakcji całkowitej zawartości flawonoidów uzyskano dla ekstraktów przygotowanych w [Bmim]Cl, co może być spowodowane silnymi oddziaływaniami elektrostatycznymi bądź też tworzeniem wiązań wodorowych z cząsteczkami polifenoli. Zawartość wybranych związków polifenolowych w ekstraktach przygotowanych przy użyciu cieczy jonowych, oznaczonych techniką HPLC sprzężoną z detektorem masowym przedstawiono w tabeli 16.

98 zawartości flawonoidów z kwiatów wrzosu z Nadleśnictwa Wyszków.

Zawartość oznaczonych związków polifenolowych jest zdecydowanie większa w ekstraktach przygotowanych w cieczach jonowych w porównaniu do klasycznych rozpuszczalników. Uzyskane wyniki pokazują, iż nie tylko rodzaj anionu, ale także kation 1-butylo-3-metyloimidazoliowy ma znaczący wpływ na efektywność ekstrakcji ze względu na obecność w strukturze pierścienia aromatycznego, który oddziałuje silnie z polarnymi i aromatycznymi polifenolami [218]. Porównanie zawartości związków polifenolowych, a także ich właściwości antyutleniających przy użyciu różnych rozpuszczalników zostało przedstawione na rysunkach 32 i 33. Ekstrakt w chlorku 1-butylo-3-metyloimidazoliowym charakteryzuje się najsilniejszymi właściwościami antyutleniającymi spośród ekstraktów przygotowanych w cieczach jonowych. Duża zawartość związków polifenolowych w tym ekstrakcie może tłumaczyć jego znaczne zdolności antyoksydacyjne. Właściwości antyutleniające ekstraktów z kwiatów wrzosu wzrastają w kolejności: [Bmim]PF6 <

[Bmim]BF4 < [Bmim]Cl. Podobną zależność uzyskano dla całkowitej zawartości flawonoidów i antocyjanów oznaczonych metodami spektrofotometrycznymi. Na podstawie zaprezentowanych wyników można uznać ciecze jonowe jako dobrą alternatywę do ekstrakcji polifenoli w stosunku do klasycznych rozpuszczalników.

99 Tabela 16. Wybrane związki polifenolowe w ekstraktach z cieczy jonowych z kwiatów wrzosu z Nadleśnictwa Wyszków [µg/g]. ekstraktach z kwiatów wrzosu z Nadleśnictwa Wyszków.

100 Rys. 33. Wpływ ekstrahenta na całkowitą zawartość flawonoidów oraz właściwości redukujące w metodzie CUPRAC ekstraktów z kwiatów wrzosu z Nadleśnictwa Wyszków.