W związku z tym, że rośliny są bogatym i różnorodnym źródłem polifenoli powstało wiele opracowań dotyczących ekstrakcji tych związków z próbek naturalnych. Wiele czynników ma wpływ na efektywność tego procesu, a w związku z tym i na skład wyciągów pozyskiwanych z roślin. Rodzaj ekstrahenta, czas i temperatura ekstrakcji, stosunek rozpuszczalnika do próbki oraz ilość powtórzeń procesu to kluczowe parametry wpływające na efektywność ekstrakcji [59].
Przed rozpoczęciem ekstrakcji bardzo ważne jest odpowiednie przygotowanie próbki.
Na tym etapie próbka roślinna musi być wysuszona; wodę usuwa się w celu uniknięcia rozwoju bakterii i grzybów. Następnie próbka jest mielona, żeby zapewnić jak najlepszy jej kontakt z rozpuszczalnikiem [152]. Najwyższą efektywność ekstrakcji polifenoli i najsilniejsze właściwości antyutleniające otrzymano dla próbek rozdrobnionych poniżej 0,5 cm [116].
Ekstrakcja związków polifenolowych musi być dostosowana także do rodzaju związków, które mają znaleźć się w ekstrakcie. W roślinach kwasy fenolowe występują w formie wolnej lub związanej, jako estry i glikozydy. W celu wyekstrahowania z próbki niezwiązanych kwasów najczęściej stosuje się ekstrakcję z użyciem wodnych roztworów etanolu lub metanolu. Ekstrakcja form związanych wymaga użycia dodatkowych rozpuszczalników, np. heksanu bądź też dodatku innych związków, np. roztworu NaOH,
46 NaBH4, a także EDTA lub kwasu askorbinowego w celu zapobiegnięcia rozpadowi kwasów w trakcie hydrolizy [153]. Z kolei flawonoidy ekstrahowane są zazwyczaj alkoholem metylowym lub etylowym, acetonem, wodą bądź mieszaniną tych rozpuszczalników.
Połączenia glikozydowe we flawonoidach są często zrywane podczas hydrolizy z użyciem kwasów, w tym celu najczęściej stosuje się roztwór HCl [154]. Ekstrakcja antocyjanów z próbek naturalnych przebiega przy użyciu zakwaszonych roztworów wody, acetonu, etanolu lub metanolu. Zastosowanie silnych kwasów nieorganicznych może spowodować rozpad antocyjanów, w związku z tym w przypadku ekstrakcji tych związków stosuje się dodatek kwasów organicznych, np. rozcieńczonego kwasu octowego [81,155].
Woda jest często wykorzystywanym rozpuszczalnikiem do ekstrakcji związków polifenolowych z próbek żywności. Wyciągi z roślin leczniczych były od dawna przygotowywane w warunkach domowych i są stosowane do tej pory. Najpopularniejsze metody to przygotowanie naparów, które sporządza się poprzez zalanie rozdrobnionego surowca zielarskiego wrzącą wodą i przetrzymywanie tej mieszaniny w naczyniu pod przykryciem przez określony czas bądź też odwarów, w których surowiec jest gotowany w wodzie. Im dłuższy czas prowadzenia takiej ekstrakcji tym większa zawartość polifenoli w wyciągu [156]. Ponadto wyższa temperatura powoduje wzrost rozpuszczalności i wymiany masy między próbką a rozpuszczalnikiem oraz obniża lepkość i napięcie powierzchniowe rozpuszczalnika przyczyniając się do zwiększenia efektywności ekstrakcji.
Jednakże wiele związków polifenolowych ulega degradacji lub niepożądanemu utlenieniu pod wpływem podwyższonej temperatury co skutkuje zmniejszeniem ich ilości w wyciągu [157]. Stwierdzono, że 32% antocyjanów zawartych w owocach jagody ulega degradacji po 20 minutach ogrzewania w łaźni wodnej w temperaturze 100°C pod ciśnieniem atmosferycznym, a jeśli doda się do tego podwyższone ciśnienie (600 MPa) wówczas obserwuje się rozpad połowy antocyjanów [158].
Ogólnie, im większa polarność ekstrahenta tym większa efektywność procesu ekstrakcji. Jednakże zastosowanie czystych rozpuszczalników organicznych powoduje niecałkowitą ekstrakcję związków silnie polarnych, jak kwasy polifenolowe. Stąd też zalecane jest stosowanie mieszaniny rozpuszczalników organicznych z wodą. Związki niepolarne ekstrahuje się mało polarnymi rozpuszczalnikami, np. dichlorometanem, chloroformem, heksanem i benzenem [159]. Metanol jest lepszy do ekstrakcji związków
47 polifenolowych o małej masie cząsteczkowej, podczas gdy roztwór wodno-acetonowy do ekstrakcji wielkocząsteczkowych polifenoli, np. flawanoli [141]. Efektywność ekstrakcji polifenoli z owoców borówki czerwonej była najniższa w przypadku zastosowania wody, najwyższa zaś w przypadku 70% acetonu lub 80% octanu etylu z dodatkiem 2% kwasu mrówkowego [110]. Aroso i in. [145] otrzymali najwyższe wyniki w metodzie Folina-Ciocalteu, gdy użyli mieszaniny wody i alkoholu etylowego do ekstrakcji związków polifenolowych z kory dębu. Inne badania dowodzą, iż zawartość związków bioaktywnych w ekstraktach spada wraz ze wzrostem stężenia alkoholu ponad 60% [160,161]. Powyższe dane potwierdzają tezę, że nie ma jednego, uniwersalnego rozpuszczalnika do ekstrakcji związków polifenolowych z materiału roślinnego. Wybór odpowiedniego ekstrahenta należy dostosować do rodzaju próbki i związków, które ona zawiera.
Ostatnio pojawiły się nowe techniki ekstrakcji, mające za zadanie zwiększenie jej efektywności przy jednoczesnej redukcji czasu i ilości rozpuszczalnika. Do technik tych należą: ekstrakcja wspomagana użyciem ultradźwięków lub promieniowania mikrofalowego oraz ekstrakcja rozpuszczalnikami w stanie nadkrytycznym [142,162].
Ultradźwięki, czyli fale dźwiękowe, których częstotliwość przekracza 20 kHz, wspomagają ekstrakcję przy użyciu klasycznych rozpuszczalników. W trakcie sonifikacji, produkcji fal dźwiękowych towarzyszy tworzenie pęcherzy kawitacyjnych, które pękając powodują uszkodzenie ścian komórkowych rośliny i uwolnienie zawartości komórki [153]. Mikrofale, czyli promieniowanie elektromagnetyczne o częstotliwości od 300 MHz do 300 GHz, wywołuje ruch dipoli zawartych w próbce i ustawianie się ich zgodnie z kierunkiem i zwrotem pola elektrycznego. Taki ruch dipoli powoduje rozpraszanie energii w materiale w postaci ciepła, a co za tym idzie utratę wody przez komórki rośliny, zniszczenie ściany komórkowej i uwolnienie substancji zawartych w komórce. Ekstrakcja wspomagana promieniowaniem mikrofalowym nie jest jednak polecana w przypadku próbek zawierających związki nieodporne na wysoką temperaturę [163]. Bouras i in. [116]
otrzymali najwyższą zawartość polifenoli w ekstraktach z kory dębu przy zastosowaniu ekstrakcji wspomaganej promieniowaniem mikrofalowym w porównaniu do klasycznej ekstrakcji rozpuszczalnikowej przy użyciu metanolu i etanolu. Do ekstrakcji w fazie nadkrytycznej najczęściej stosuje się wodę i dwutlenek węgla, które znajdują się w warunkach ciśnienia i temperatury wyższych od ich parametrów krytycznych. Takie
48 rozpuszczalniki mają gęstość i zdolność rozpuszczania jak rozpuszczalniki ciekłe, natomiast szybkość dyfuzji, ściśliwość, lepkość i zdolność penetracji takie jak gazy. Główną zaletą ekstrakcji w stanie nadkrytycznym jest połączenie siły rozpuszczania rozpuszczalników ciekłych i zdolności penetracji charakterystycznych dla gazów [141].
W ostatnich latach ciecze jonowe, które są mniej toksyczne niż klasyczne rozpuszczalniki organiczne, zyskały na popularności jako bardzo dobre ekstrahenty do ekstrakcji polifenoli. Potencjał cieczy jonowych jest związany z ich unikalnymi właściwościami, takimi jak: mała prężność par, dobra stabilność termiczna oraz zdolność rozpuszczania szerokiej gamy substancji [164,165]. Wybór odpowiedniego kationu bądź anionu decyduje o właściwościach chemicznych i fizycznych cieczy jonowej, np. jej polarności czy też hydrofobowości. Udowodniono także, iż ciecze jonowe mają zdolność do absorbcji promieniowania mikrofalowego, co pozwala na stosowanie ich w ekstrakcjach wspomaganych mikrofalami lub ultradźwiękami [166]. Yang i in. [165]
zastosowali wodorosiarczan 1-butylo-3-metyloimidazoliowy do ekstrakcji kwasu chlorogenowego z liści szczmielu białego i uzyskali większą efektywność tego procesu w porównaniu do ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi (metanol, etanol, aceton) w podwyższonej temperaturze lub przy użyciu ultradźwięków. Ponadto połączenie ekstrakcji cieczami jonowymi wspomaganej działaniem ultradźwięków i mikrofal spowodowało znaczne skrócenie jej czasu.
W tabelach 2-4 przedstawiono przykładowe warunki ekstrakcji związków polifenolowych z wrzosu, borówek oraz kory sosny i dębu.
49 Tabela. 2. Warunki ekstrakcji związków polifenolowych z kwiatów wrzosu.
Rozpuszczalnik Temperatura Czas Wspomaganie Literatura
Etanol, odparowanie rozpuszczalnika, liofilizacja i rozpuszczenie w etanolu
pokojowa - - pojedyncza
ekstrakcja
[16]
80% metanol 60 ° C 5 min. - 3 – krotna
ekstrakcja
[14]
CO2 w stanie nadkrytycznym 40-70 ° C 3-4 godz. - pojedyncza
ekstrakcja
[26]
96% etanol, odparowanie rozpuszczalnika, rozpuszczenie pozostałości w 10% metanolu
pokojowa tydzień - pojedyncza
ekstrakcja
[23]
Heptan, odparowanie rozpuszczalnika, rozpuszczenie pozostałości w metanolu
pokojowa - ultradźwięki 2 – krotna
ekstrakcja
[18]
Woda, etanol, octan etylu, odparowanie i rozpuszczenie pozostałości w wodzie
pokojowa, następnie 80° C
72 godz. - 2 – krotna
ekstrakcja
[167]
49
50 Tabela. 3. Warunki ekstrakcji związków polifenolowych z owoców i liści borówek.
Rozpuszczalnik Temperatura Czas Wspomaganie Literatura
Metanol z dodatkiem BHT i kwasu mrówkowego
pokojowa 1 godz. ultradźwięki 3-krotna ekstrakcja
[48]
Etanol: woda: kwas octowy, 70:30:1, v/v/v pokojowa 50 min ultradźwięki pojedyncza ekstrakcja
[61]
Aceton i kwas octowy, 99:1, v/v; odparowanie i uzupełnienie roztworem 20 % metanolu w wodzie
pokojowa 15 min ultradźwięki ekstrakcja do odbarwienia się roztworu
[58]
50 % metanol, tert –butylohydrochinon TBHQ, kwas solny (1,2 M)
Acetonitryl i metanol (85:15, v/v) oraz 8,5 % kwas mrówkowy w stosunku 1:9
Metanol, woda i kwas solny (70:30:5, v/v/v) pokojowa 1 min - pojedyncza ekstrakcja
[46]
50
51
Metanol i 0,1 % kwas solny 40 ° C 2 godz. - pojedyncza
ekstrakcja
[83]
Metanol z dodatkiem 0,012 M kwasu solnego pokojowa 5 min - 3-krotna ekstrakcja
[79]
Metanol i 0,1 % kwas solny pokojowa 1 godz. ultradźwięki pojedyncza ekstrakcja
[55]
mieszanina: 40 % aceton, 40 % metanol, 20 % woda, 0,01 % kwas mrówkowy
pokojowa 30 min (każda ekstrakcja)
- podwójna
ekstrakcja
[60]
70 % aceton, następnie octan etylu pokojowa po 30 min) - podwójna
ekstrakcja
[60]
51
52 Tabela. 4. Warunki ekstrakcji związków polifenolowych z kory dębu i sosny.
Rozpuszczalnik Temperatura Czas wspomaganie Literatura
Kora dębu
Cztery ekstrahenty: woda, etanol, aceton, heksan pokojowa 6 godz. - 2-krotna ekstrakcja
[113]
50 % metanol 50 ° C 48 godz. - pojedyncza
ekstrakcja
[123]
Woda, woda z dodatkiem NaOH i Na2SO3 90 ° C 1 godz. - pojedyncza
ekstrakcja
[117]
33%, 50%, 75% etanol i metanol, woda pokojowa 5, 30, 60 i 120 min
mikrofale pojedyncza ekstrakcja
[116]
Woda 100°C, 25°C 5, 30, 60 i
120 min
- pojedyncza
ekstrakcja
[116]
80% metanol pokojowa 1 godz. - pojedyncza
ekstrakcja
[168]
Kora sosny
70% aceton pokojowa brak - 4-krotna
ekstrakcja
[131]
Woda, dichlorometan, metanol, etanol pokojowa 1,5 godz. - pojedyncza
ekstrakcja
[126]
52
53
Woda brak 1 godz. - pojedyncza
ekstrakcja
[140]
95% etanol pokojowa 24 godz. - pojedyncza
ekstrakcja
[140]
80% metanol, odparowanie i rozpuszczenie pozostałości w metanolu
pokojowa 15 min ultradźwięki 2-krotna ekstrakcja
[138]
70% aceton, odparowanie i rozpuszczenie pozostałości w metanolu
pokojowa 16 min - 2-krotna
ekstrakcja i
[138]
Dimetylosulfotlenek (DMSO) pokojowa 11 min ultradźwięki pojedyncza
ekstrakcja
[127]
70% aceton, odparowanie i rozpuszczenie pozostałości w wodzie
pokojowa 12 godz. - pojedyncza
ekstrakcja
[129]
53
54 4.3. Analiza chromatograficzna związków polifenolowych
Do oznaczenia związków polifenolowych w materiale roślinnym potrzebna jest szybka, dokładna, czuła, a przede wszystkim selektywna technika analityczna. Metoda chromatografii cieczowej wraz z różnymi rodzajami detekcji jest najczęściej stosowana do rozdzielenia i oznaczenia polifenoli.
Chromatografia w układzie faz odwróconych (RP-HPLC) przy użyciu kolumny C18 lub C8 jest bardzo często wykorzystywana w analizie kwasów fenolowych, flawonoidów czy antocyjanów w próbkach ubocznych użytków leśnych [14,50,55,60,117,121,129]. Jako fazę ruchomą stosuje się wodne mieszaniny kwasów i rozpuszczalników organicznych, np.
acetonitrylu czy metanolu. W przypadku analizy antocyjanów eluentem jest rozpuszczalnik o charakterze kwasowym, np. 2% kwas trifluorooctowy, gdyż związki te w niskim pH występują w postaci kationu flawyliowego co ma wpływ na lepsze rozdzielenie, a także detekcję przy użyciu detektora UV-Vis [169]. W układzie faz odwróconych częściej stosuje się elucję gradientową niż izokratyczną ze względu na różnorodne właściwości, powinowactwo do fazy stacjonarnej lub polarność związków polifenolowych. Jako pierwsze wymyciu ulegają kwasy hydroksybenzoesowe, następnie hydroksycynamonowe, glikozydy flawonoidów, na końcu zaś ich aglikony. Kolejność elucji flawonoidów przy użyciu kolumny C18 jest następująca:
flawonole < flawanony < flawony [170]. Obecność grup hydroksylowych w cząsteczce związku obniża retencję, podczas gdy grupy metylowe zmniejszają polarność związków i powodują wydłużenie czasu retencji. Problemem w analizie polifenoli przy użyciu techniki RP-HPLC jest często mała selektywność, która prowadzi do powstania zjawiska koelucji, nawet przy zastosowaniu kolumn o wysokiej rozdzielczości lub wydłużeniu czasu analizy.
Dodatkowo jedną z wad jest z pewnością długi czas pojedynczej analizy, który wynosi od kilkudziesięciu minut do kilku godzin [14,129,171].
W związku z tym coraz częściej poszukuje się innych technik chromatograficznych, mogących zastąpić wysokosprawną chromatografię cieczową w układzie faz odwróconych.
Jedną z takich technik jest ultrasprawna chromatografia cieczowa (UHPLC), której głównymi zaletami są: skrócenie czasu analizy, poprawa rozdzielenia i większa czułość [172]. W UHPLC stosuje się krótkie kolumny (59-150 mm) i małe ziarna o średnicy < 2µm co skutkuje
55 wzrostem ciśnienia na wlocie na kolumnę nawet do 1300 barów [173]. Ponadto technika ta pozwala na uzyskanie niższych granic wykrywalności, zredukowanie ilości dozowanej próbki do około 3 µL i ilości rozpuszczalników organicznych potrzebnych do analizy. Porównanie HPLC i UHPLC do oznaczania glikozydów flawonoidów w ekstrakcie zielonej herbaty przedstawiono na Rys. 10. Przy zastosowaniu techniki UHPLC udało się rozdzielić kwercetyno-3-O-rutynozyd od kemferolo-3-O-glukoramno glukozydu, co było niemożliwe w warunkach HPLC [174].
Rys. 10. Porównanie chromatogramów ekstraktu zielonej herbaty uzyskane techniką HPLC i UHPLC. Detekcja przy 354 nm [174].
Nowy typ chromatografii – chromatografia oddziaływań hydrofilowych (HILIC) – jest alternatywną metodą do RP-HPLC w rozdzielaniu polarnych i średniopolarnych związków.
Technikę tę można scharakteryzować jako chromatografię w układzie faz normalnych, wykorzystującą polarne fazy stacjonarne i fazy ruchome o dużej zawartości rozpuszczalników organicznych (najczęściej acetonitrylu) [175,176,177]. Pierwotnie jako mechanizm retencji w HILIC postulowany był tylko podział analitu między cienką warstwę wodną zaadsorbowaną na powierzchni polarnego złoża, a znacznie bardziej niepolarny eluent. Dziś wiadomo już, że mechanizm ten jest o wiele bardziej skomplikowany i zarówno wspomniany podział jak również adsorpcja bezpośrednio na złożu kolumny wpływa na retencję analitu. W zależności od struktury analitu i formy w jakiej występuje również oddziaływania elektrostatyczne oraz tworzenie wiązań wodorowych mogą mieć wpływ na jego retencję. W chromatografii HILIC stosuje się trzy rodzaje faz stacjonarnych: neutralne, obdarzone ładunkiem i dwubiegunowe
56 [178]. Złoża neutralne nie oddziałują elektrostatycznie z analitem, a ich retencja jest niezależna od pH, podczas gdy złoża obdarzone ładunkiem charakteryzują się zdolnością do oddziaływań elektrostatycznych z analitem i retencją zależną od pH fazy ruchomej.
Najbardziej selektywne są złoża dwubiegunowe, które posiadają dwie grupy o przeciwnych ładunkach, np. faza stacjonarna ZIC-HILIC zawiera grupy sulfobetainowe, składające się z dodatnio naładowanych czwartorzędowych grup amonowych, jak również ujemnie naładowanych grup sulfonowych, obydwu w stosunku molowym 1:1. Wysokie stężenie acetonitrylu stosowane jako składnik fazy ruchomej poprawia wydajność jonizacji poprzez elektrorozpylanie, a zatem technika doskonale nadaje się do połączeń typu HILIC-MS.
Uzyskiwane są wyższe sygnały dla próbek analizowanych w eluencie o wyższej zawartości acetonitrylu co jest istotną zaletą w stosunku do RP-HPLC-MS, w której eluenty zawierają duże ilości wodnych komponentów [179]. Zaletą tej techniki jest również poprawa selektywności i symetrii pików w analizie związków polarnych oraz skrócenie czasu analizy (Rys. 11).
Rys. 11. Porównanie czułości detekcji oraz czasów retencji w trybie HILIC i RP na przykładzie apigeniny [179]. Eluent w HILIC: ACN/H2O (95/5% v/v), w RP: ACN/H2O (20/80, v/v).
W analizie związków polifenolowych wykorzystuje się także wysokotemperaturową chromatografię cieczową, która umożliwia prowadzenie analizy w krótszym czasie ze względu na zmniejszenie lepkości stosowanego eluentu. Ponadto w ostatnim czasie na popularności zyskuje wielowymiarowa chromatografia cieczowa. W przypadku jednowymiarowej analizy chromatograficznej często dochodzi do zjawiska koelucji w oznaczaniu związków o podobnych właściwościach i zbliżonych czasach retencji. W takiej sytuacji należy przeprowadzić analizę próbki w wielu wymiarach, tzn. na podstawie kilku jej
57 właściwości [180,181]. Można także połączyć rozdzielenie związków polifenolowych za pomocą technik chromatograficznych z pomiarem właściwości antyutleniających. W tym celu sprzęga się rozdzielenie chromatograficzne on-line z pokolumnową metodą badania właściwości antyoksydacyjnych, np. metodą DPPH, ABTS lub CUPRAC [182].
Szereg różnych detektorów jest wykorzystywanych do oznaczania i identyfikacji związków polifenolowych rozdzielonych chromatograficznie. Do najpopularniejszych należą:
detektor UV-Vis, fluorescencyjny, elektrochemiczny, chemiluminescencyjny i spektrometrii mas. Najczęściej używanym detektorem w chromatografii związków fenolowych jest detektor spektrofotometryczny, gdyż wszystkie związki fenolowe absorbują promieniowanie elektromagnetyczne z zakresu UV, a wiele, jak flawonoidy – również światło widzialne [14,17,48,50,55,79,121]. Kwasy fenolowe i flawonony oznaczane są przy długości fali 280 nm, flawonole i izoflawony w zakresie 330-370 nm, antocyjany zaś przy 530-580 nm [48,50,58]. Jednakże metoda ta nie jest selektywna, gdyż nie pozwala na oznaczenie związków o podobnej budowie lub izomerów, które mają zbliżone widma UV-Vis.
W ostatnich latach coraz częściej do analizy związków polifenolowych jako metodę detekcji wykorzystuje się spektrometrię mas, zwłaszcza układy tandemowe MS/MS lub MSn. Technika ta służy nie tylko do analizy ilościowej, ale dostarcza także informacji o strukturze związku i ścieżkach fragmentacji cząsteczki [12,55,100,131,170]. Bardzo ważnym elementem w detekcji związków przy użyciu spektrometrii mas jest rodzaj jonizacji analitu. Źródło jonów ma za zadanie przeprowadzić analit z fazy ciekłej do gazowej i nadać mu ładunek.
Elektrorozpylanie w polu elektrycznym (ESI) oraz jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI) są najpopularniejsze w analizie polifenoli, przy czym efektywność jonizacji aglikonów i glikozydów jest lepsza w przypadku elektrorozpylania [12,55,58].
Jonizację można prowadzić w trybie jonów ujemnych, która prowadzi do powstania jonów pseudomolekularnych [M-H]- i dodatnich, która prowadzi do powstania jonów pseudomolekularnych [M-H]+. Generalnie do analizy polifenoli stosuje się jonizację w trybie jonów ujemnych [100,110,121], choć jonizacja w trybie jonów dodatnich jest także wykorzystywana, np. w analizie antocyjanów [14,55,81]. Kolejnym etapem po jonizacji analitu jest segregacja jonów według stosunku masy do ładunku m/z w analizatorze mas.
Jako analizator mas wykorzystuje się najczęściej analizator kwadrupolowy [79], czasu przelotu (TOF) [81,100,127] i pułapkę jonową [55,58,83,103]. W celu zwiększenia czułości analizatora kwadrupolowego stosuje się często układ tandemowy, czyli trzy, połączone
58 szeregowo analizatory kwadrupolowe, z których środkowy pełni funkcję komory zderzeń [18]. Najpopularniejszym trybem pracy takiego detektora jest tryb monitorowania wybranych reakcji (Single Reaction Monitoring, SRM), który ze względu na wysoką specyficzność fragmentacji, umożliwia oznaczenie analitów o takich samych czasach retencji [110]. Spektrometria mas jako metoda detekcji jest selektywna i specyficzna, pozwala na identyfikację i oznaczenie ilościowe związków, które są nierozdzielone, co znacznie skraca czas analizy. Ponadto charakteryzuje się ona dużą czułością i niskimi granicami oznaczalności.