Pod wpływem działania stresu organizm ludzki produkuje więcej wolnych rodników i reaktywnych form tlenu (ROS, reactive oxygen species), powodujących zachwianie równowagi między ich działaniem, a zdolnością do szybkiej detoksykacji reaktywnych produktów pośrednich i peroksydację lipidów. Taki proces prowadzi do uszkodzenia komórek i problemów zdrowotnych. Antyutleniacze są to związki, które mają zdolność do wstrzymania lub spowalniania procesu utleniania danej substancji. Związki polifenolowe, wraz z karotenoidami, tokoferolami i witaminą C, zaliczane są do naturalnych składników żywności o charakterze przeciwutleniaczy. Ich aktywność przeciwutleniająca wiąże się z pierścieniową budową cząsteczki mającej sprzężone wiązania podwójne, jak i z obecnością grup hydroksylowych w tych pierścieniach. Im lepszym donorem wodoru (lub elektronu) jest polifenol, tym efektywniej działa on jako antyoksydant (co ma związek z jego potencjałem redukcyjnym). Drugim czynnikiem wpływającym na aktywność flawonoidów jest delokalizacja niesparowanego elektronu w rodniku flawonoidowym. Na efektywność antyoksydacyjną polifenoli roślinnych mają również wpływ ich zdolności do synergistycznego współdziałania z innymi antyoksydantami, np. kwercytyna i rutyna pełnią funkcję antyutleniacza w stosunku do witaminy C opóźniając przekształcanie akorbinianu do dehydroaskorbinianu. Z kolei kwas askorbinowy hamuje utlenianie flawonoidów i przedłuża ich ochronne działanie. Działanie przeciwutleniające związków polifenolowych polega na eliminowaniu reaktywnych form tlenu, neutralizacji wolnych rodników (najczęściej nadtlenkowych, hydroksylowych i hydroksynadtlenkowych), inhibicji enzymów z grupy oksydaz oraz chelatowaniu jonów metali.
59 Metody badania zdolności antyutleniających mogą być oparte na różnych mechanizmach. Reakcja przeniesienia atomu wodoru (HAT, hydrogen atom transfer), która jest szybka i nie zależy od rozpuszczalnika i pH środowiska jest podstawą jednej z grup metod określenia właściwości antyoksydacyjnych [183]. Druga grupa metod oparta jest na reakcji przeniesienia elektronu (ET, electron transfer), która przebiega wolniej i zależy od rozpuszczalnika [184]. W niektórych metodach mechanizm ten jest mieszany [185].
Mechanizm przeniesienia atomu wodoru można przedstawić następującymi reakcjami [186,187]:
RH R• inicjacja R• + O2 RO2• addycja O2
Wymiana atomu wodoru:
ArOH + R• RH + ArO• ArOH + RO• ROH + ArO• ArOH + ROO• ROOH + ArO•
Mechanizm przeniesienia elektronu odbywa się według poniższych reakcji:
RO2• + ArOH RO2- + ArOH+ przeniesienie elektronu ArOH+ + H2O > ArO• + H3O+ deprotonacja
RO2- + H3O+ > ROOH + H2O utworzenie cząsteczki ROOH gdzie ArOH – związek polifenolowy
Istnieje szereg metod służących do wyznaczenia zdolności do neutralizacji wolnych rodników, właściwości redukujących, chelatowania metali i innych parametrów charakterystycznych dla przeciwutleniaczy [188]. Metody te różnią się między sobą po kątem mechanizmu reakcji antyoksydacyjnej, potencjału redoks, rodzaju substratów, warunków prowadzenia reakcji i sposobu wyrażania wyników [189].
W metodach z zastosowaniem mechanizmu typu ET (np. CUPRAC, FRAP czy Folin-Ciocalteau) mieszaninę reakcyjną stanowią przeciwutleniacz i oksydant zmieniający barwę wskutek redukcji, czyli przeniesienia elektronu z antyoksydantu na utleniacz. Zmiana wartości absorbancji w funkcji stężenia przeciwutleniacza w próbce jest zależnością liniową, a nachylenie prostej odzwierciedla zdolność redukcji przeciwutleniacza znajdującego się w próbce. Uzyskane wyniki przelicza się często na równoważniki troloksu, rozpuszczalnej
60 w roztworach wodnych syntetycznej pochodnej witaminy E, który pełni funkcję materiału odniesienia.
Metoda FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Parameter) opiera się na reakcji redukcji kompleksu Fe(III) z (2,4,6-tris(2-pirydylo)-1,3,5-triazyną (TPTZ), a jej produktem jest intensywnie niebieski kompleks Fe(II) ( λmax = 593 nm) [190]. Trwałość kompleksu zależy od pH; optymalne warunki występują przy pH 3,6 (bufor octanowy). Jednak każdy związek (nawet nie posiadający właściwości antyutleniających ) o potencjale redoks niższym niż 0,70 V może zredukować stosowany odczynnik, zawyżając uzyskany wynik.
W metodzie CUPRAC (Cupric Reducing Antioxidant Capacity) wykorzystuje się redukcję jonów Cu(II) do Cu(I) związanych w kompleks z batokuproiną (2,9-dimetylo-4,7-difenylo-1,10-fenantroliną) lub neokuproiną (2,9-dimetylo-(2,9-dimetylo-4,7-difenylo-1,10-fenantroliną) w środowisku obojętnym. Potencjał formalny tego układu wynosi ok. 0,60 V, a więc utlenianie przez Cu(II) jest bardziej selektywne niż w metodzie FRAP. Maksimum absorpcji dla pomarańczowego kompleksu Cu(I)-batokuproina występuje przy długości fali 490 nm, zaś pomarańczowo-żółtego kompleksu Cu(I)-neokuproina obserwuje się przy 450 nm [191]. Pomiar absorbancji prowadzi się najczęściej po inkubacji roztworu w temperaturze 50 °C, gdyż niektóre polifenole , np. naringenina i naringina reagują bardzo powoli.
Metoda Folina-Ciocalteu (FC) opiera się na pomiarze absorbancji barwnego kompleksu, który powstaje w wyniku redukcji przez antyutleniacze soli heteropolikwasów fosforowolframomolibdenowych w środowisku alkalicznym. Odczynnik FC jest mieszaniną wolframianu sodu, molibdenianu sodu, siarczanu litu, wody bromowej i stężonych kwasów solnego i fosforowego. Dokładny wzór odczynnika nie jest znany, ale w wyniku jego działania dochodzi do redukcji jonów Mo(VI) do Mo(V) oraz utworzenia niebieskiego kompleksu [PmoW11O40]4- z maksimum absorpcji przy długości fali 765 nm [183,192]. W literaturze bardzo często tę metodę określa się jako oznaczanie całkowitej zawartości polifenoli.
Należałoby ją jednak traktować jako metodę oznaczania zdolności redukującej próbki, gdyż na wynik oznaczenia wpływa obecność w próbce innych związków niebędących polifenolami (np. cukry redukujące, aminy, tiole, jony metali) [193]. Wyniki w metodzie FC wyraża się najczęściej w przeliczeniu na kwas galusowy [194].
Najczęściej stosowaną metodą wyznaczania właściwości antyutleniających wg.
mechanizmu HAT jest metoda ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity), która mierzy zdolności absorpcji rodników nadtlenkowych i hydroksylowych [195]. Wykorzystuje się
61 reakcję utleniania cząsteczek substancji fluorescencyjnej, najczęściej fluoresceiny czy dichlorofluorosceiny, po zmieszaniu jej ze związkiem dostarczającym wolnych rodników nadtlenkowych, np. związkiem azowym AAPH (dichlorowodorek 2,2`-azobis(2-amidinopropanu. Do generowania rodników hydroksylowych stosowany jest układ Cu2+ -H2O2. Sonda fluorescencyjna w wyniku reakcji z termicznie generowanymi rodnikami nadtlenkowymi ulega przekształceniu w produkt pozbawiony właściwości fluorescencyjnych.
W obecności przeciwutleniacza rozkład znacznika fluorescencyjnego staje się powolniejszy.
Rejestruje się krzywe zaniku przedstawiające zależność intensywności fluorescencji względem czasu. Ilościową ocenę zdolności przeciwutleniającej przeprowadza się integrując pole powierzchni pod krzywą zaniku fluorescencji w obecności przeciwutleniacza i bez niego, a przebieg reakcji jest porównywany z reakcją zachodzącą w obecności wzorcowego antyoksydantu, najczęściej troloksu.
Jedną z właściwości antyutleniaczy jest zdolność do neutralizacji wolnych rodników, stąd też najczęściej stosowaną metodą pomiaru aktywności antyutleniającej jest metoda wykorzystująca rodnik DPPH• (2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl) [196,197]. Jego roztwór wykazuje pasmo absorpcji w zakresie widzialnym z maksimum przy 515-540 nm. Podczas pomiaru mierzony jest spadek intensywności zabarwienia roztworu rodnika, proporcjonalny do zawartości antyutleniaczy. Reakcja rodnika z antyutleniaczem przebiega w dwóch etapach: w pierwszym etapie reakcji zachodzi proces przeniesienia elektronu z pierścienia B cząsteczki flawonoidu (3’-OH oraz 4’-OH), natomiast w drugim etapie następuje reakcja produktów częściowego utlenienia polifenoli według mechanizmu HAT [198]. Do porównania aktywności antyoksydacyjnej różnych związków czy próbek naturalnych służy parametr EC50
(efficient concentration) określający stężenie antyutleniacza powodujące spadek początkowego stężenia DPPH• o 50%; im niższa wartość EC50 tym silniejszy przeciwutleniacz.
W celu standaryzacji wyników właściwości antyutleniające danej próbki są wyrażane także jako wartość równoważnika trolox.
Kolejną, równie chętnie wykorzystywaną metodą jest test, w którym wykorzystuje się 2,2-azynobis-(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonian amonowy (ABTS). Kationorodniki ABTS•+
tworzone są podczas reakcji chemicznych (np. z MnO2 lub K2S2O8),elektrochemicznych lub enzymatycznych (np. z peroksydazą chrzanową) i wykazują maksimum absorbancji przy kilku długościach fal: 417, 645, 734 i 815 nm [199]. Antyutleniacze powodują redukcję kationorodnika i spadek intensywności zabarwienia roztworu w stopniu zależnym od czasu
62 trwania reakcji, stężenia przeciwutleniacza oraz jego aktywności. Przy wykonywaniu pomiarów przy λ = 417 nm otrzymuje się znacznie mniejsze wartości, szczególnie dla próbek zawierających znaczne ilości antocyjanin. Stąd polecany jest pomiar przy 728 nm lub rozcieńczanie próbek.
Oprócz wyżej wymienionych i najczęściej wykorzystywanych metod wyznaczania aktywności antyutleniającej różnych związków czy próbek naturalnych, istnieje jeszcze wiele innych. Zostały one opisane i przedyskutowane w publikacjach przeglądowych [183,186-189].
63