1
Uniwersytet Warszawski Wydział Chemii
Badanie możliwości wykorzystania produktów
ubocznego użytkowania lasu jako źródła antyutleniaczy
Paulina Dróżdż
Rozprawa doktorska wykonana pod kierunkiem Prof. dr hab. Krystyny Pyrzyńskiej
Warszawa 2019
2 Składam serdeczne podziękowania
Pani prof. Dr hab. Krystynie Pyrzyńskiej
za opiekę naukową, ogromne zaangażowanie, wyrozumiałość, mądrość, życzliwość i cierpliwość, a także cenne uwagi podczas pisania rozprawy
dr inż. Józefowi Wójcikowi
za wszechstronną pomoc, wyrozumiałość, zaufanie, a także za codzienną życzliwość dr Aleksandrze Sentkowskiej
za życzliwość oraz nieocenioną pomoc przy analizie chromatograficznej Instytutowi Badawczemu Leśnictwa
za finansowanie projektu nr 260801 „Badanie możliwości wykorzystania produktów
ubocznego użytkowania lasu jako źródła antyoksydantów w preparatach prozdrowotnych”
oraz za umożliwienie przeprowadzenia badań w Laboratorium Chemii Środowiska Przyrodniczego
3 Streszczenie
Celem przeprowadzonych badań było oznaczenie właściwości antyutleniających wybranych produktów ubocznego użytkowania lasu oraz ich składu chemicznego, zwłaszcza pod kątem zawartości związków polifenolowych. Ponadto opracowano metodę ekstrakcji polifenoli porównując efektywność tego procesu w zależności od rodzaju użytego rozpuszczalnika, temperatury i czasu ekstrakcji.
Produkty ubocznego użytkowania lasu to leśne produkty niedrzewne, które od wieków były wykorzystywane przez społeczeństwo w celach spożywczych, a także leczniczych.
W pracy badaniu poddano próbki roślin leśnych, takich jak: wrzos zwyczajny (Calluna vulgaris L.), borówka czernica (Vaccinium myrtillus L.), borówka brusznica (Vaccinium vitis-idaea L.), kora sosny pospolitej (Pinus silvestris L.) oraz kora dębu (Quercus robur L.), które zostały pobrane z terenu Mazowsza. Do ekstrakcji użyto wody destylowanej, mieszaniny wody i etanolu (40/60, v/v) oraz octanu etylu. Dodatkowo sprawdzono efektywność ekstrakcji z użyciem cieczy jonowych: chlorku 1-butylo-3-metyloimidazoliowego, tetrafluoroboranu 1- butylo-3-metyloimidazoliowego, heksafluorofosforanu 1-butylo-3-metyloimidazoliowego.
W celu wyznaczenia zdolności antyutleniających przygotowanych ekstraktów zastosowano kilka metod spektrofotometrycznych. Właściwości redukujące oznaczono za pomocą metody Folina- Ciocalteu i metody CUPRAC. Zdolność do neutralizacji wolnych rodników została zbadana przy użyciu syntetycznego i dostępnego komercyjnie rodnika DPPH˙. Całkowitą zawartość antocyjanów oznaczono przy użyciu różnicowej metody pH, zaś flawonoidów za pomocą metody z jonami Al(III). Związki polifenolowe oznaczono techniką chromatografii cieczowej połączonej ze spektrometrią mas, natomiast zawartość wybranych makro i mikroelementów techniką ICP-OES.
Ekstrakty z produktów ubocznego użytkowania lasu zawierają szereg związków polifenolowych. Kwiaty wrzosu są bogatym źródłem kwasu chlorogenowego, ferulowego i p-hydroksybenzoesowego, a także flawonoidów, w tym katechiny, epikatechiny, kwercetyny, kwercetryny oraz apigeniny. Najwięcej w ekstraktach wrzosowych jest kwasu chlorogenowego, jego zawartość kształtuje się na poziomie ponad 1 mg/g. Analiza chromatograficzna wykazała obecność w ekstraktach z kwiatów wrzosu tricetinu (5,7,3’,4’,5’- pentahydroksy flawonu), który nie został do tej pory zidentyfikowany we wrzosie. Wrzos,
4 zarówno leśny, jak i ogrodowy może być alternatywnym źródłem antyutleniaczy w odniesieniu do popularnie stosowanych ziół.
Owoce borówki czernicy zawierają najwięcej antocyjanów ze wszystkich analizowanych w pracy produktów natomiast owoce borówki brusznicy charakteryzują się większą ilością flawonoidów oraz silniejszymi zdolnościami antyoksydacyjnymi. Owoce borówek leśnych są bogatym źródłem makroelementów: potasu, wapnia i magnezu oraz mikroelementów, takich jak mangan i cynk.
Ekstrakty z kory sosny i dębu zawierają duże ilości związków polifenolowych, zwłaszcza katechin i charakteryzują się silnymi właściwościami antyutleniającymi. Ekstrakty z kory dębu zawierają ponadto dużą ilość kwasu p-HBA, protokatechowego i galusowego, a także niewielkie ilości kwasu chlorogenowego, ferulowego i kawowego. Porównując zawartość flawonoidów we wszystkich ekstraktach wyraźnie widać, że kory sosny i dębu są najbogatszym źródłem flawonoidów, niezależnie od tego z jakiego miejsca została pobrana próbka.
Ze względu na obecność związków polifenolowych o różnych właściwościach chemicznych i polarności, zdolności antyutleniające zbadanych produktów leśnych silnie zależały od użytego ekstrahenta i temperatury prowadzenia ekstrakcji. Największe efektywności ekstrakcji uzyskano przy zastosowaniu mieszaniny alkoholu etylowego i wody w temperaturze 55°C. Ponadto ciecze jonowe, które są mniej toksyczne niż klasyczne rozpuszczalniki organiczne, są także bardzo dobrymi rozpuszczalnikami do ekstrakcji polifenoli z badanych próbek.
Przeprowadzone badania pokazały, że do pełnej charakterystyki ubocznych użytków leśnych pod kątem ich właściwości antyutleniających należy zastosować szereg różnych metod. Ze względu na obecność znacznej ilości związków polifenolowych o właściwościach prozdrowotnych rośliny leśne mogą być składnikiem zdrowej diety, a także mogą być wykorzystywane jako składniki farmaceutyków i nutraceutyków.
5 Abstract
The objective of the study was to determine the antioxidant activity as well as the content of some polyphenols of selected non-wood forests products. The parameters for extraction of these compounds such as kind of solvent, temperature and time were also evaluated.
Non-wood forests products are the group of goods of biological origin other than wood derived from forests. Traditionally, they are used in folk medicine to treat some disorders and also as food additives. Heather flowers (Calluna vulgaris L.), bilberry (Vaccinium myrtillus L.), lingonberry (Vaccinium vitis-idaea L.), pine bark (Pinus silvestris L.) and oak bark (Quercus robur L.) were collected in central Poland (the Mazovia region).
Ethyl acetate, water, ethanol and its mixture with water were used for the extraction.
Furthermore the extraction efficiency of polyphenols from forest samples using ionic liquids based on imidazolium cation (1-butyl-3-methylimidazolium chloride, 1-butyl-3- methylimidazolium tetrafluoroborate and 1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate) were evaluated and compared with organic solvents and water.
Antioxidant capacity of the prepared extracts was screened by several spectrophotometric methods. The total reducing capacity was evaluated by Folin- Ciocalteu (FC) method (so-called total phenolic content) and cupric ion reducing antioxidant capacity (CUPRAC). The DPPH assay was applied to estimate the radical- scavenging ability of the extracts. The total content of anthocyanins was estimated according to pH differential method and the content of flavonoids was determined by method based on the complex formation with Al(III). The content of some polyphenols was determined by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS) and the concentrations of some elements were determined by inductively coupled plasma optical emission spectrometry.
The extracts of non-wood forests products contain plenty of compounds with high antioxidant properties. Heather flowers are good source of chlorogenic, ferulic and p- hydroxybenzoic acid as well as catechin, epicatechin, quercetin, quercetrin and apigenin.
The extracts of Calluna vulgaris may be considered as a rich source of chlorogenic acid (1 mg/g dried flowers). The presence of tricetin (5,7,3’,4’,5’-pentahydroxy flavone) was not
6 reported yet. Bilberry extracts contain the highest amount of anthocyanins while lingonberries extracts contain plentiful of flavonoids and have the highest antioxidant capacity from all analyzed berries. Forest berries are good sources of K, Ca, Mg as well as Mn and Zn. Moreover, only low contents of toxic elements such as Pb and Cd were detected, ensuring the absence of risk for human health. Pine and oak bark accumulate a large amounts of polyphenolic compounds which exhibit a wide range of biological effects, including antioxidant activity. Bark extracts of Quercus robur L. contain a high amount of p-hydroxybenzoic, protocatechuic and gallic acid.
Antioxidant activity of prepared extracts strongly depends on the nature of extracting solvent and extraction temperature due to the presence of different antioxidant compounds of varied chemical characteristics and polarities. Ethanol-water mixture was proved to be the best solvent. Room temperature ionic liquids which are novel and less toxic solvents than organic solvents can be used for extraction for a wide range of polyphenolic compounds.
Several spectrophotometric methods should be applied for evaluation of antioxidant activity of non-wood forests products because there is no single, widely-acceptable assay method applicable to a reasonable variety of compounds in different matrices. Forest plants should be promoted as a dietary source of essential nutrients and health-beneficial compounds and may be applied as pharmaceutical and nutraceutical ingredients.
7 Spis treści
Streszczenie ... 3
Abstract ... 5
Wprowadzenie... 9
1. Wrzos zwyczajny (Calluna vulgaris L.) ... 11
2. Borówki ... 15
2.1. Borówka czernica (Vaccinium myrtillus L.) ... 15
2.2. Borówka wysoka (Vaccinium corymbosum L.) ... 22
2.3. Borówka brusznica (Vaccinium vitis-idaea L.) ... 26
3. Kory drzew leśnych ... 32
3.1. Kora dębu (Quercus robur L.) ... 32
3.2. Kora sosny (Pinus sylvestris L.) ... 35
4. Związki polifenolowe ... 40
4.1. Budowa, podział i właściwości ... 40
4.2. Metody ekstrakcji polifenoli ... 45
4.3. Analiza chromatograficzna związków polifenolowych ... 54
4.4. Właściwości antyutleniające i ich pomiar... 58
Badania własne ... 63
Cel badań ... 64
5. Odczynniki, aparatura, badane próbki i procedury pomiarowe ... 65
5.1. Odczynniki stosowane w badaniach ... 65
5.2. Aparatura wykorzystana w badaniach ... 67
5.3. Badane próbki i metody ekstrakcji ... 67
5.4. Analiza chromatograficzna ... 69
5.5. Oznaczenie całkowitej zawartości flawonoidów ... 70
5.6. Oznaczenie całkowitej zawartości antocyjanów ... 72
5.7. Wyznaczenie zdolności antyutleniąjacych ... 73
8
5.8. Oznaczenie zawartości makro i mikroelementów ... 75
6. Wrzos zwyczajny (Calluna vulgaris L.) – wyniki i dyskusja ... 78
6.1. Ekstrakcja ... 78
6.2. Analiza chromatograficzna ... 79
6.3. Całkowita zawartość flawonoidów i antocyjanów ... 86
6.4. Właściwości antyutleniąjace ekstraktów ... 91
6.2. Zastosowanie cieczy jonowych do ekstrakcji ... 97
6.3. Podsumowanie badań ... 100
7. Borówka czernica, borówka wysoka, borówka brusznica-wyniki i dyskusja ... 102
7.1. Oznaczenie zawartości makro i mikroelementów ... 102
7.2. Całkowita zawartość antocyjanów ... 106
7.3. Analiza chromatograficzna i całkowita zawartość flawonoidów ... 110
7.4. Właściwości antyutleniające ... 119
7.5. Podsumowanie badań ... 124
8. Kora dębu (Quercus robur L.) i kora sosny (Pinus sylvestris L.)-wyniki i dyskusja ... 126
8.1. Analiza chromatograficzna i całkowita zawartość flawonoidów ... 126
8.2. Właściwości antyutleniąjace ... 134
8.3. Analiza pierwiastkowa ... 139
8.4. Podsumowanie badań ... 142
Literatura ... 143
Prezentacja dorobku naukowego……….160
9 Wprowadzenie
Jedną ze struktur lasu jest runo leśne, dolna warstwa składająca się z warstwy zielnej, trawiastej i mszystej. W runie leśnym rosną grzyby, mchy, porosty oraz krzewinki, w tym zioła i rośliny dające owoce. Wymienione powyżej płody leśne zaliczane są do tzw.
produktów ubocznego użytkowania lasu. Definicja leśnych pożytków niedrzewnych została zaproponowana podczas Międzynarodowych Konsultacji Ekspertów FAO: „leśne surowce/produkty niedrzewne to dobra i inne korzyści biologicznego pochodzenia inne niż drewno, pochodzące z lasu, innych terenów zadrzewionych oraz z drzew rosnących poza lasami” [1]. W Polsce pod terminem produkty ubocznego użytkowania lasu rozumie się: produkty pochodzenia roślinnego (owoce leśne, rośliny lecznicze, przemysłowe i dekoracyjne, korę, żywicę i inne wydzieliny drzew), produkty pochodzenia zwierzęcego (produkty łowiectwa, ślimaki, miód i wosk), grzyby jadalne oraz kopaliny (minerały, torf, piasek, żwir) [2]. Ponadto warto wspomnieć, że użytkowanie lasu to nie tylko dobra materialne lecz także pozaprodukcyjne funkcje lasu, takie jak funkcja rekreacyjna i ochronna.
Produkty ubocznego użytkowania lasu były od wieków wykorzystywane przez ludzi jako pożywienie oraz środki lecznicze stosowane w medycynie ludowej. W Polsce silnie zakorzeniona jest tradycja zbierania grzybów i owoców leśnych na własny użytek, w celu przygotowania przetworów. Dla części społeczeństwa, zwłaszcza ludności wiejskiej, grzybobranie czy też jagodobranie stanowi dodatkowe źródło dochodów. W związku z tym już w latach 50 ubiegłego wieku rozpoczęto cykl badań dotyczących określenia bazy surowcowej leśnych produktów niedrzewnych. Badania te zapoczątkowano na Wydziałach Leśnych w Krakowie, Poznaniu i Warszawie oraz w Instytucie Badawczym Leśnictwa. Na podstawie przeprowadzonych inwentaryzacji oszacowano bazę surowcową owoców leśnych na 56 tys. ton rocznie, z czego 30 tys. ton stanowiła borówka czernica;
4,7 tys. ton jeżyny; 2,2 tys. ton maliny; 1,3 tys. ton borówka brusznica, a resztę 0,8 tys.
ton żurawina i poziomka [3]. Baza leśnych grzybów jadalnych kształtuje się na poziomie 18 tys. ton rocznie, natomiast ziół i roślin leczniczych na poziomie 2 tys. ton. Rośliny
10 zielarskie są najsłabiej zbadaną grupą użytków leśnych, występującą głównie na terenie Polski północno–wschodniej (to na tym obszarze skupuje się 25% wszystkich roślin zielarskich) [4].
Obecnie największe znaczenie spośród produktów ubocznego użytkowania lasu mają grzyby i owoce leśne, zwłaszcza borówka czernica; stanowi ona ponad 50% wszystkich pozyskiwanych owoców leśnych. Polska jest głównym eksporterem jagód leśnych do krajów Europy zachodniej, zwłaszcza do Wielkiej Brytanii, Niemiec i Holandii. Łączna wartość eksportu tych owoców w latach 2005–2010 wynosiła 350 mln złotych i wartość ta stale rośnie [5]. Wartość skupu płodów runa leśnego w 2007 roku przekroczyła 160 mln złotych. Są to dane szacunkowe, nieobejmujące zbioru na własne potrzeby, a także handlu targowego. Według ekspertów rzeczywista wartość pozyskiwanych produktów może być 3-krotnie wyższa [2].
Biorąc pod uwagę powyższe dane, nie da się nie zauważyć korzyści płynących z pozyskiwania ubocznych użytków leśnych. Są to korzyści nie tylko materialne, mające znaczenie gospodarcze, ale także korzyści wynikające z turystyki i rekreacji na terenach zielonych. Nie da się również pominąć właściwości zdrowotnych, odżywczych i leczniczych owoców leśnych oraz roślin zielarskich.
W dalszej części pracy omówione zostaną wybrane produkty ubocznego użytkowania lasu: wrzos zwyczajny (Calluna vulgaris L.), borówka czernica (Vaccinium myrtillus L.), borówka brusznica (Vaccinium vitis-idaea L.), kora dębu (Quercus robur L.) oraz kora sosny (Pinus sylvestris L.), które zostały poddane badaniom mającym na celu określenie ich właściwości antyutleniających.
11 1. Wrzos zwyczajny (Calluna vulgaris L.)
Wrzos zwyczajny to jedna z szeroko rozprzestrzenionych krzewinek zimozielonych rosnących na terenach leśnych Polski. Jest rośliną wieloletnią, średnio osiągającą wysokość od 20 do 100 cm [6]. Ma zredukowane, łuskowate liście, ustawione nakrzyżlegle i zachodzące na siebie dachówkowato. Kwiaty wrzosu mają długość 3-6 mm, są czterokrotne z siedmioma pręcikami [7,8]. Cały okwiat zabarwiony jest na różowo- fioletowo, z wąskim, kłosowatym kwiatostanem [7]. Owoce wrzosu znajdują się w torebce z małymi jajowatymi nasionami. Wrzos kwitnie od sierpnia do października [9,10]. Jego pędy są cienkie, pokładają się na ziemi, a kora ma barwę ciemnopomarańczową (Rys. 1).
Rys. 1. Wrzos zwyczajny (Calluna vulgaris) w okresie kwitnienia [8,10].
Wrzos porasta dziko niemal cały obszar Europy. W Polsce jest pospolity na terenie całego kraju, rzadziej występuje jedynie na Żuławach Wiślanych i Równinie Pyrzyckiej.
Można spotkać go również w Azji, na obszarze Turcji i Syberii, a także w północnej Afryce na terenie Maroka [6,7]. Ponadto rośnie w Ameryce Północnej, Australii i Nowej Zelandii.
Wrzos jest rośliną wymagającą gleby kwaśnej, ale mało żyznej [7,8]. Jest przystosowany do życia w miejscach suchych i słonecznych, porasta suche lasy i torfowiska. Występuje w borach sosnowych i mieszanych, a także świetlistych dąbrowach [8]. Rośnie zarówno na terenach nizinnych, jak i w górach (w Alpach do 2700 m n.p.m., w Tatrach do 2000 m n.p.m.). Na obszarach leśnych rośnie w dużych skupiskach, zwanych wrzosowiskami, ale znany jest także jako roślina ozdobna. Surowiec zielarski stanowią górne części pędów
12 (Herba Calunae) oraz kwiaty wrzosu (Flos Callunae). Ziele i kwiaty zbiera się pod koniec sierpnia, ścinając gałązki z kwiatami w połowie wysokości. Kwiaty są zbierane ręcznie, a następnie suszone w miejscach przewiewnych i zacienionych lub suszarkach w temperaturze do 60 °C [10].
Kwiaty wrzosu są bogatym źródłem steroli, triterpenów, kwasu askorbinowego i kwasów tłuszczowych oraz związków polifenolowych. Głównym triterpenoidem w kwiatach wrzosu jest kwas ursolowy. Spośród kwasów triterpenowych wyróżnić można jeszcze kwas oleanolowy, ursa-2,12-dien-28-owy, 3-okso-ursolowy, 3-okso-oleanolowy i 3-acetyloksy-2-hydroksyursolowy. Ponadto kwiaty wrzosu zawierają jeszcze monohydroksylowe alkohole triterpenowe, aldehydy, ketony oraz sterole i steroidy:
kampesterol, stigmasterol, sitosterol, sitostenon i stigmasta-3,5-dien-7-on [11].
Wśród polifenoli można wyróżnić flawonoidy, kromony, kwasy fenolowe i procyjanidyny, zarówno w formie aglikonów jak i glikozydów [12]. We wrzosie występuje duża zawartość kwasu chlorogenowego, glikozydów kwercetyny i kemferolu: 3-O- galaktozy, 3-O-glukozy i 3-O-arabinozy, katechiny, procyjanidyny D1, a także mniej popularnych związków jak kallunin (3,5,7,8,4’-pentahydroksyflawanon-8-O-glukozyd) oraz tricetin (5,7,3’,4’,5’-[pentahydroksyflawon). Występowanie razem glikozydów 3-O- galaktozy i 3-O-arabinozy flawonoli jest cechą charakterystyczną roślin należących do rodziny wrzosowatych (EricaceaeJuss) [13]. W metanolowych ekstraktach wrzosu oznaczono znaczne ilości kwasów hydroksycynamonowych oraz glikozydy flawonoli takie jak: izokwercytryna, hiperozyd (3-galaktozyd kwercetyny) i taksyfolina [14]. Polifenole występujące w korzeniach wrzosu to głównie katechiny i procyjanidyny, jednak ich ilość jest na tyle mała w porównaniu do części naziemnych, że zazwyczaj nie stanowią one obiektu badań [15].
Zawartość związków polifenolowych we wrzosie zmienia się w zależności od pory roku. Najmniejsza ich ilość występuje w styczniu i lutym, największa zaś od lipca do września [12]. Ponadto na zawartość polifenoli mają także wpływ warunki środowiskowe jak nasłonecznienie, konkurencja z innymi gatunkami, uszkodzenia spowodowane przez szkodniki oraz wysokość nad poziomem morza. Stwierdzono, iż próbki wrzosu zebrane z terenów górskich z wysokości 1500 m n.p.m. zawierają więcej związków polifenolowych w porównaniu do próbek zebranych z wysokości 600 m n.p.m. [14].
13 Wyciągi z wrzosu od lat są znane i stosowane w tradycyjnej medycynie oraz przemyśle. Ludzie wykorzystywali wrzos do krycia strzech, a także produkcji lin i mioteł [16]. W średniowieczu, zanim popularność zdobył chmiel, ważono piwo z dodatkiem wrzosu [17]. W Danii herbata wrzosowa stosowana była w leczeniu przeziębień i reumatoidalnego zapalenia stawów [18]. Uważano, że posiada ona również właściwości uspokajające. W Turcji napary z wrzosu wykorzystywano w infekcjach dróg moczowych oraz jako środki moczopędne [19]. W Szwecji zaś wodne wyciągi z wrzosu stosowano w stanach zapalnych skóry i pomocniczo w gojeniu ran [20].
Nazwa wrzosu Calluna vulgaris pochodzi z języka greckiego od słowa kallynein oznaczającego wymiatający, oczyszczający [8,21]. Wyciągi z wrzosu stosuje się najczęściej w stanach zapalnych dróg moczowych, a także pomocniczo w kamicy moczowej, nieżycie żołądka i jelit [22]. Wrzos działa przeciwzapalnie i przeciwbólowo. Za działanie przeciwzapalne odpowiedzialne są zawarte we wrzosie glikozydy kemferolu, zwłaszcza kemferol-3-O-β-D-galaktozyd [23]. Alkoholowe oraz wodne ekstrakty z wrzosu inhibitują monoaminooksydazy, enzymy odpowiedzialne za deaminację serotoniny, adrenaliny i noradrenaliny oraz dopaminy i tyraminy [15]. Spośród flawonoidów zdolność do inhibicji tych enzymów wykazuje kemferol, apigenina, luteolina, naringenina, a także kwercetyna [24,25]. Dużą zawartością kwercetyny tłumaczy się działanie uspokajające naparów wrzosowych [15]. Kwercetyna, kemferol i ich glikozydy, główne polifenole występujące we wrzosie, wykazują silne działanie antyutleniające i przeciwzapalne [16]. Wrzos hamuje aktywność wirusa zapalenia wątroby typu C, gdyż zawiera dużą ilość kwasu ursolowego oraz oleanolowego, wykazujących działanie przeciwwirusowe oraz przeciwnowotworowe [26]. Ze względu na właściwości antyutleniające i przeciwzapalnie, wrzos redukuje stres oksydacyjny i uszkodzenia DNA komórek narażonych na promieniowanie UVB. Testy in vivo wykazały, że ekstrakty z wrzosu znacząco zredukowały poziom cytokin oraz stres oksydacyjny powstały w wyniku napromieniowania skóry myszy promieniowaniem UVB [27,28,29]. Ekstrakty z wrzosu są potencjalnymi inhibitorami acetylocholinoesterazy oraz α-glukozydazy. Ponadto wykazują działanie antybakteryjne w kierunku bakterii Agrobacterium tumefaciens, Erwinia sp., Klebsiella pneumonia i Pseudomonas aeruginosa [16]. Potwierdzono działanie naparów wrzosowych w zwalczaniu prątka gruźlicy
14 (Mycobacterium tuberculosis), co tłumaczy wykorzystanie ich w tradycyjnej medycynie w leczeniu gruźlicy [30].
Ekstrakty z wrzosu, ze względu na właściwości prozdrowotne, znalazły zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym. Najczęściej są one składnikiem preparatów przeciwbakteryjnych i moczopędnych oraz wspomagających pracę żołądka i jelit [10].
Poza farmacją, kwiaty wrzosu wykorzystywane są w kosmetyce, wchodzą w skład gotowych preparatów ziołowych przeznaczonych do pielęgnacji ciemnych włosów, a także mieszanek stosowanych do kąpieli kosmetycznych i leczniczych. Odwar z wrzosu zaleca się dodawać do kąpieli uspokajających dla osób cierpiących na nadpobudliwość nerwową [19]. Wrzos ma także działanie ściągające i odkażające, stąd też ekstrakty wrzosowe są dodawane do mydeł i żeli do pilingów [16].
Bardzo popularnym produktem powstałym z wrzosu jest miód. Jest on rzadko spotykany ze względu na trudność w jego pozyskiwaniu [31]. Charakteryzuje się bursztynową barwą i silnym, przyjemnym zapachem kwiatów wrzosu. Zawiera flawonoidy, witaminy A, B2, B3, B6 i C oraz żelazo [32]. Miód wrzosowy jest źródłem tricetinu, mirycetyny i jej pochodnych, zawiera również znacznie więcej kwasu DL-β- fenylomlekowego, benzoesowego i fenylooctowego w porównaniu do innych miodów [33,34]. Duża zawartość tych związków służy jako parametr w identyfikacji miodów wrzosowych pochodzących z Europy [35].
15 2. Borówki
2.1. Borówka czernica (Vaccinium myrtillus L.)
Borówka czernica to jedna z nazw bardzo popularnej w Polsce i Europie krzewinki leśnej, znanej ze swoich owoców. Jej zwyczajowa nazwa to czarna jagoda, ale znana jest także jako borówka, jagoda, czernica, borowina i jagodzina [36]. Nazwa gatunkowa borówki czarnej (myrtillus) wywodzi się z języka łacińskiego od słowa „ myrtus”
oznaczającego mirt, roślinę przypominającą czernicę. Pierwsze wzmianki o jagodzie czarnej pojawiły się w I wieku n.e. w zapisach rzymskiego przyrodnika Pliniusza Starszego.
Borówka czernica jest krzewinką wieloletnią z rodziny Ericaceae (wrzosowate), średnio osiągającą wysokość około 30 cm i wiek około 30 lat [37]. Ma połyskujące, cienkie, podługowato-jajowate, zielone liście, które opadają na zimę [38]. Najintensywniej kwitnie w maju, ale na obszarach o łagodniejszym klimacie okres kwitnienia zaczyna się w drugiej połowie kwietnia [36]. Kwiaty borówki czernicy są owadopylne i charakteryzują się różową lub białoróżową barwą oraz beczułkowatym kształtem (Rys. 2) [39]. Dojrzałe jagody mają ciemny kolor z niebieskawym, woskowym nalotem [37]. Mają średnicę od 5,5 do 10 mm i ważą średnio 0,3 g [37,40].
Rys. 2. Borówka czarna (Vaccinium myrtillus).A – fragment pędu kwitnącego, B –pędu owocującego, C – przekrój podłużny kwiatu, D – pręciki, E – owoc [39].
Borówka czernica jest rośliną kwasolubną, dobrze rośnie na glebach piaszczystych, ubogich, ale wilgotnych [41]. Na ogół nie rośnie na glebach wapiennych. Najczęściej
16 można ją spotkać w borach sosnowych i sosnowo-świerkowych, z rozluźnionym zwarciem koron drzew, pozwalającym na większy dopływ światła. Porasta obszar niemal całej Europy, z wyjątkiem krańców południowych, występuje także w Azji i Ameryce Północnej.
W Polsce rośnie zarówno na terenach nizinnych jak i w górach [42]. Zajmuje obszar około 10 % powierzchni lasów w naszym kraju, tworząc skupiska zwane jagodziskami [43].
W latach 70-80 ubiegłego wieku 60 % wszystkich zbieranych rocznie owoców leśnych stanowiły owoce jagody czarnej [42]. Zakład Ubocznej Produkcji Leśnej Instytutu Badawczego Leśnictwa w latach 60 XX wieku oszacował bazę surowcową borówki czernicy na 30 tysięcy ton rocznie [43]. Bardziej aktualne dane mówią o pozyskiwaniu tego owocu na poziomie od 5 do 10 tysięcy ton rocznie [44]. Jagoda czarna intensywniej owocuje na terenach górskich w porównaniu do terenów nizinnych. W sezonie można zebrać około 250 kg jagód z jednego hektara z terenach nizinnych i 400 kg/ha z terenów górskich [43].
Potwierdzają to inne przeprowadzone badania: średnie pozyskanie jagód z jagodzisk nizinnych w okolicach Krakowa wynosiło 32,9 g/m2, zaś z jagodzisk górskich w okolicy Nowego Sącza 50,5 g/m2 [42]. Liście borówki czernicy zbiera się od czerwca do października. Po zebraniu suszy się je w cieniu, na słońcu lub w suszarkach w temperaturze maksimum 40°C. Owoce jagody czarnej zbiera się ręcznie od lipca do września i spożywa surowe, suszone lub w postaci przetworów [45].
Owoce borówki czernicy zawierają cukry, kwasy organiczne, związki polifenolowe, wśród nich kwasy fenolowe i flawonoidy, związki mineralne oraz duże ilości antocyjanów.
Cukry zawarte w jagodach to przede wszystkim mono i dwucukry: glukoza, fruktoza i sacharoza [46]. Najwięcej jest fruktozy, a najmniej sacharozy. W liściach i owocach jagody czarnej występują triterpenoidy, do których należą triterpeny, sterole i saponiny.
Wśród triterpenoidów oznaczonych w borówce czarnej zebranej z terenów Polski znajdują się: α – amyryna, β – amyryna, kampesterol, lupeol, cytrostadienol, aldehydy i kwasy ursolowy i oleanolowy. Triterpenoidy wykazują aktywność przeciwnowotworową, antyoksydacyjną i cytoochronną [47].
W literaturze najczęściej opisywaną i najlepiej zbadaną grupą związków zawartych w jagodach są antocyjany. To rozpuszczalne w wodzie pigmenty, które można znaleźć w zewnętrznych partiach roślin (skórce) oraz w wakuolach [48]. Antocyjany występują w jagodach w bardzo dużych stężeniach, 200–400 mg/100g świeżych owoców. Podobną,
17 wysoką zawartością antocyjanów charakteryzują się jeszcze owoce aronii (300–460 mg/100g świeżych owoców) oraz czarnej porzeczki (130–400 mg/100g świeżych owoców).
Natomiast truskawki, czerwona porzeczka, żurawina oraz malina zawierają znacznie mniejsze ilości antocyjanów w porównaniu do borówki czernicy [49]. Ponadto zawartość antocyjanów w owocach tak popularnej borówki wysokiej (Vaccinium corymbosum L.) i niskiej (Vaccinium angustifolium Aiton) jest do 70 % mniejsza niż w owocach Vaccinium myrtillus [50].
Antocyjanidyny, bezcukrowe odpowiedniki antocyjanów, występujące w największych ilościach w jagodach to: cyjanidyna, delfinidyna, petunidyna, peonidyna , pelargonidyna i malwidyna [50]. Związki te zostały oznaczone w owocach Vaccinium myrtillus, pochodzących zarówno z północnej i środkowej Europy (kraje nordyckie, Polska, Słowenia) jak i z południa (Turcja) [51]. W owocach jagody czarnej antocyjany występują głównie w formie glikozydów, w których cząsteczka cukru jest przyłączona zazwyczaj do węgla C3, rzadziej C5 oraz C7 w pierścieniu A. Cukry występujące w antocyjanach to głównie glukoza, galaktoza, ramnoza, arabinoza, rutynoza oraz soforoza. Reszta cukrowa może być acylowana przez kwas p–kumarowy, kawowy, ferulowy, a rzadziej p–hydroksybenzoesowy, malonowy czy też octowy [52,53]. Acylowanie powoduje wiązanie się pojedynczych cząsteczek antocyjanów w zespoły cząsteczkowe przez co zwiększa się ich stabilność [54]. Według przeprowadzonych badań jagody czarne zawierają najwięcej delfinidyny (57,6%), cyjanidyny (23,7%), malwidyny (14,1%) oraz niewielką ilość petunidyny (3,3%) i peonidyny (1,3%) [48]. Główne antocyjany to cyjanidyno-3-glukozyd (14,33%), delfinidyno-3-glukozyd (13,45%), malwidyno-3-glukozyd (11,18%), petunidyno-3-glukozyd oraz delfinidyno-3-galaktozyd (8,98%) [55]. Delfinidyno- 3-galaktozyd oraz arabinozyd są związkami charakterystycznymi dla owoców borówki czernicy i najprawdopodobniej odpowiadają za ich intensywny ciemny, niebieski kolor.
Kolejną grupą związków polifenolowych występujących w jagodach są kwasy fenolowe. W owocach borówki czernicy najwięcej jest pochodnych kwasy cynamonowego i benzoesowego, występujących głównie w formie estrów i glikozydów [56]. Wśród kwasów benzoesowych można wyróżnić kwas p-hydroksybenzoesowy, salicylowy, galusowy i elagowy, zaś spośród kwasów cynamonowych – kwas kawowy, p-kumarowy i ferulowy [56,57]. Kwas elagowy, który wykazuje właściwości antymutagenne,
18 przeciwnowotworowe i antyutleniające, występuje w borówce czarnej w formie glikozydu, w formie wolnej, a także jako elagotaniny. Jego zawartość nie jest duża i wynosi około 8 µg/g świeżych owoców [46]. Z kolei udział kwasu chlorogenowego w całkowitej zdolności antyutleniającej ekstraktów z jagód dochodzi do 21% [46]. Kwas chlorogenowy odpowiada za cierpki smak jagód, a w obecności oksydazy polifenolowej może być łatwo utleniony do o-chinonu, który może reagować z innymi związkami fenolowymi (np.
katechinami), tworząc żółte i brązowe barwniki [49]. Zawartość kwasów fenolowych w metanolowych ekstraktach z borówki z Macedonii wynosiła 143 mg/100 g świeżych owoców, z czego 70-80% stanowi kwas galusowy i jego pochodne. Ponadto w tych ekstraktach oznaczono jeszcze kwas 5-kawoilochinowy (6,5% całkowitej zawartości kwasów fenolowych), kwas chinowy (1,3 mg/100 g świeżych owoców) oraz pochodne kwasu protokatechowego (1,5 mg/100 g świeżych owoców) [58]. Owoce borówki czernicy, zebrane w Szwecji, poddane ekstrakcji metanolowej z kwasem solnym były bogate w kwas kawowy, p-kumarowy i ferulowy, a całkowita zawartość kwasów hydroksycynamonowych kształtowała się w nich na poziomie 136,5 mg/100 g świeżych owoców [59].
Trzecią grupą związków polifenolowych zawartych w jagodach są flawonoidy, spośród których najwięcej jest flawonoli i flawanoli. Zawartość flawonoli w owocach borówki czarnej z Macedonii wynosi 12,1 mg/100 g świeżych owoców, co stanowi 1,7% całkowitej zawartości polifenoli w tych owocach [58]. Podobne wyniki prezentuje Kalt i in. [60], zawartość flawonoli w borówkach z gatunku Vaccinium jest dużo niższa niż antocyjanów czy kwasów fenolowych.
Flawonoidy zawarte w owocach borówek występują głównie w formie związanej, najczęściej w postaci glikozydów. Glikozydy mirycetyny, takie jak: mirycetyno–3–O–
glukuronid, mirycetyno–3–O–galaktozyd, mirycetyno–3–O–glukozyd i kwercetyno–3–O- glukozyd zostały oznaczone w ekstraktach jagody czarnej [61]. Inne badania potwierdzają, że owoce borówki czarnej oraz borówek z rodziny Ericaceae są bogate w mirycetynę i kwercetynę, a także niewielkie ilości kemferolu [46]. Ponadto jagoda czarna zawiera niewielkie ilości rutyny, larycytryny, larycytryno–3–O–galaktozydu, kwercetyno-3-O- arabinozydu oraz izoramnetyno-3-O-glukozydu [58]. Borówka czernica zawiera także katechiny, m.in. katechinę, galokatechinę, epikatechinę oraz epigalokatechinę [62].
19 Jednakże w literaturze jest mało informacji dotyczących zawartości flawanoli w owocach jagód z gatunku Vaccinium.
Borówka czernica zawiera również stilbeny, małe związki polifenolowe, które w niewielkich ilościach występują w warzywach i owocach. Najpopularniejszym związkiem z tej grupy jest trans–resweratrol, który korzystnie wpływa na pracę układu krążenia i którego stężenie w świeżych owocach jagody wynosi 6,78 µg/g [49]. Ponadto jagody zawierają taniny, głównie w formie skondensowanej, utworzone w wyniku łączenia się flawonoidów. Średnia zawartość garbników w owocach borówki czernicy wynosi około 8%
[63]. Kwas cytrynowy i jabłkowy występują w małych ilościach w owocach borówki czarnej (odpowiednio 0,23 i 0,12 mg/g świeżych owoców). Stężenie witaminy C w jagodach czarnych wynosi około 26 mg/100 g świeżych owoców i jest zdecydowanie mniejsze niż w owocach czarnej porzeczki czy też truskawki. W związku z tym borówka czernica nie może zostać zaklasyfikowana jako bogate źródło witaminy C [46,49].
Zawartość makro i mikroelementów w owocach jagody czarnej jest niewielka.
Najwięcej jest w nich potasu (około 1 g/kg świeżych owoców), wapnia (160-200 mg/kg świeżych owoców), magnezu (75-95 mg/kg świeżych owoców) oraz sodu (50-62 mg/kg świeżych owoców). Spośród mikroelementów owoce borówki zawierają mangan (5-29 mg/kg świeżych owoców), cynk (3-6 mg/kg świeżych owoców) i żelazo (5-13 mg/kg świeżych owoców). Skesters i in. [64] podają, iż zawartość metali w borówce czernicy zebranej na Łotwie kształtuje się na podobnym poziomie. Spożycie 100 g borówek dostarcza organizmowi 94% dziennego zapotrzebowania na mangan oraz 27,6% na molibden.
Liście borówki czernicy zawierają kwasy fenolowe (77-93% całkowitej ilości polifenoli), flawonoidy (7-23% całkowitej ilości polifenoli) oraz niewielkie ilości procyjanidynów (do 0,5%) [65]. Spośród kwasów polifenolowych dominującym składnikiem są kwasy hydroksycynamonowe, w tym kwas chlorogenowy. Wśród flawonoidów można wyróżnić głównie glikozydy kwercetyny (94% całkowitej zawartości flawonoidów), najwięcej jest glukuronidu kwercetyny [58,65].
Ze względu na zawartość związków polifenolowych, a zwłaszcza dużą ilość antocyjanów, borówka czernica została zaklasyfikowana do grupy naturalnej żywności funkcjonalnej i jest ważnym składnikiem zdrowej, zbilansowanej diety [49]. Związki
20 zawarte w owocach borówek zaliczane są do antyutleniaczy, chroniących organizm przed działaniem szkodliwych rodników, powodujących starzenie się organizmu i wiele chorób z tym związanych. Badania epidemiologiczne sugerują, iż spożywanie diety bogatej w polifenole zawarte m. in. w jagodach zmniejsza ryzyko zachorowania na niektóre typy nowotworów [66]. Jagody zawierają związki bioaktywne, które zwalczają nowotwory według komplementarnych mechanizmów, tj. poprzez indukowanie enzymów metabolizujących, zmianę ekspresji genów oraz usuwanie uszkodzonych komórek.
Właściwości antymutagenne przejawiają się także zdolnością do zmiatania wolnych rodników i reaktywnych form tlenu oraz inhibicji aktywności metaloproteinazy 2 i 9, odpowiedzialnej za przerzuty nowotworowe [62].
Świeże owoce borówki czernicy są dostępne na rynku jedynie przez kilka miesięcy w roku, w związku z tym w sezonie jesienno-zimowym są one spożywane w formie przetworzonej, w postaci soków, napojów, dżemów, słodyczy a nawet wina. W krajach europejskich herbaty z suszonych owoców bądź liści jagód były od wieków stosowane w tradycyjnej medycynie wspomagająco w leczeniu cukrzycy oraz chorób układu moczowego. Ponadto przypisywano im właściwości antybakteryjne, przeciwzapalne, antyseptyczne i ściągające [65]. Obecnie ziołowe suplementy zawierające ekstrakty z jagody czarnej są zalecane w przypadku problemów z krążeniem, wzrokiem, a także dolegliwościami układu pokarmowego, m. in. biegunką [55].
Wiele badań laboratoryjnych potwierdza właściwości antynowotworowe borówki czernicy. Polifenole, w tym zwłaszcza antocyjany, pomagają w zwalczaniu chorób nowotworowych poprzez szereg mechanizmów obejmujących m. in. modulację ekspresji genów i jej wpływ na namnażanie się komórek rakowych oraz apoptozę. Właściwości antymutagenne borówki czernicy przejawiają się poprzez zatrzymanie metabolizmu komórek nowotworowych, hamowanie procesu tworzenia się wolnych rodników i reaktywnych form tlenu oraz zapobieganie mutagenezie [62].
Związki polifenolowe zawarte w jagodach mają zdolność do neutralizowania reaktywnych form tlenu i hamowania wzrostu niektórych bakterii chorobotwórczych [67].
Udowodniono, że metanolowe ekstrakty z jagód borówki czernicy wykazują właściwości antybakteryjne w kierunku niektórych bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych (Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Proteus lawonowi, Staphylococcus
21 lawo), co może być wykorzystane w przemyśle kosmetycznym, np. przy produkcji kremów do twarzy [68]. Za działanie ściągające i antyseptyczne jagód odpowiadają zawarte w nich glikozydy glikozydy mirycetyny (mirycetyno–3–O-arabinozyd, mirycetyno–3–O–
galaktozyd, mirycetyno–3–O–glukozyd) oraz kwas kawoilochinowy [69].
Ekstrakty z owoców borówki czernicy są składnikiem leków i suplementów poprawiających wzrok ze względu na wysoką zawartość antocyjanów, które zwiększają elastyczność i przepuszczalność naczyń krwionośnych gałki ocznej, przez co następuje poprawa widzenia o zmierzchu i w nocy [49]. Ponadto badanie przeprowadzone na myszach, u których wywołano zapalenie oczu, wykazało korzystny wpływ ekstraktów z borówki w leczeniu zapalenia błony naczyniowej oka wywołanego endotoksyną [70].
Ekstrakty z jagody czarnej chronią wątrobę przed uszkodzeniami wywołanymi czynnikami stresowymi, które przyczyniają się do znacznego podniesienia poziomu aminotransferazy alaninowej (ALT) i malonodialdehydu (MDA) – markera stresu oksydacyjnego. Podawanie przez pięć dni wyciągów z owoców borówki czernicy (zawierających około 42%
antocyjanów), myszom narażonym na stres przyczyniło się do obniżenia poziomu ALT, MDA, tlenku azotu oraz do podniesienia poziomu glutationu i witaminy C w tkankach wątroby [71]. Podobne działanie ochronne ekstraktów bogatych w antocyjany zaobserwowano w przypadku uszkodzeń nerek, spowodowanych podawaniem bromianu potasu, ulepszacza stosowanego w żywności do wybielania mąki. Bromian potasu ma właściwości kancerogenne, powoduje wzrost stężenia azotu mocznika i kreatyniny w surowicy krwi. Ekstrakty z jagody czarnej, mające silne właściwości antyutleniające przyczyniają się do obniżenia poziomu tych szkodliwych substancji, a co za tym idzie do zmniejszenia poziomu stresu oksydacyjnego wywołanego bromianem potasu [72].
Wyciągi z liści i owoców Vaccinium myrtillus L. są stosowane w leczeniu przewlekłej niewydolności żylnej, gdyż mają pozytywny wpływ na poprawę krążenia krwi w naczyniach. Wodno-alkoholowe ekstrakty z liści borówki czarnej przyczyniają się do poprawy gospodarki lipidowej poprzez obniżenie poziomu lipidów. U szczurów z dyslipidemią podanie takiego ekstraktu obniżyło poziom trójglicerydów we krwi o 39%
[65]. Ponadto owoce i liście jagody czarnej mogą być wykorzystywane w leczeniu drobnych schorzeń jamy ustnej takich jak: zapalenie jamy ustnej, afty oraz ból gardła [62].
22 2.2. Borówka wysoka (Vaccinium corymbosum L.)
Borówka wysoka została wyhodowana na początku XX wieku w Stanach Zjednoczonych, stąd znana jest także pod nazwą borówka amerykańska. Jest popularna nie tylko w Ameryce Północnej, ale również w Europie, Nowej Zelandii i Azji (Japonia, Chiny, Korea Południowa). Do Polski została sprowadzona w latach dwudziestych ubiegłego wieku, ale jej intensywna uprawa zaczęła się od roku 1975 [73]. Pomimo, iż borówka amerykańska nie należy do produktów ubocznego użytkowania lasu zostanie omówiona w tym rozdziale, gdyż zostanie ona zbadana w pracy i porównana z borówką czernicą oraz brusznicą.
Borówka wysoka jest wieloletnim krzewem z rodziny Ericaceae (wrzosowate), znanym za sprawą bardzo słodkich i większych niż w przypadku borówki czernicy, owoców. Owoce borówki amerykańskiej osiągają średnicę 15-30 mm, a ich miąższ jest zielonkawo-biały (Rys. 3). Krzew borówki dorasta do 3 m wysokości, kwitnie od kwietnia do maja i owocuje od końca lipca do połowy września [74].
Borówka amerykańska dobrze rośnie na glebach kwaśnych, wilgotnych oraz lekkich o dużej zawartości próchnicy. Optymalne pH gleby powinno miesić się w zakresie 4,8-5,5 [75,76]. Wymaga nawożenia przy użyciu nawozów kwaśnych oraz pielęgnacji w postaci przycinania, odchwaszczania i ściółkowania trocinami lub korą [77]. Najwięcej plantacji borówki wysokiej znajduje się w USA, około 75%. Stany Zjednoczone produkują ponad 250 tys. ton rocznie tego owocu, na drugim miejscu znajduje się Kanada z produkcją na poziomie 170 tys. ton. Polska jest liderem pod względem produkcji borówki wysokiej w Europie. W roku 2016 w naszym kraju zebrano 15 tys. ton owoców, z czego do 80%
zostało przeznaczonych na eksport [78].
23 Rys. 3. Borówka wysoka (Vaccinium corymbosum L.) w okresie kwitnienia i owocowania
[73].
Podobnie jak jagody czarne, borówka wysoka jest owocem sezonowym, stąd też przez większą część roku spożywana jest w formie przetworzonej. Z owoców borówki robi się przetwory: dżemy, syropy, soki, galaretki, jogurty oraz koktajle [79]. Popularność borówki amerykańskiej na całym świecie związana jest nie tylko z walorami smakowymi jej owoców, lecz także z ich wartością odżywczą. Owoce borówki wysokiej są źródłem witamin, pektyn, cukrów oraz związków polifenolowych: procyjanidyn, antocyjanów, flawonoidów, zwłaszcza flawonoli, kwasów fenolowych i stilbenów.
Borówka amerykańska zawiera znacznie mniej antocyjanów w porównaniu do borówki czernicy [50]. Zawartość antocyjanów w owocach borówki wysokiej kształtuje się na poziomie 63-235 mg/100 świeżych owoców [49]. Inni autorzy podają, że średnia zawartość tych związków wynosi od 89 do 330 mg/100 świeżych owoców [80]. Tak duże różnice w zawartości antocyjanów mogą być spowodowane wielkością i dojrzałością owoców, odmianą, warunkami klimatycznymi, zwłaszcza nasłonecznieniem oraz różnymi warunkami agrotechnicznymi. Borówka amerykańska, podobnie jak jagoda czarna, zawiera 5 antocyjanidynów: delfinidynę, malwidynę, cyjanidynę, petunidynę oraz peonidynę połączonych najczęściej z 3 resztami cukrowymi: glukozą, galaktozą i arabinozą [81]. Jest bogatym źródłem glikozydów malwidyny, najwięcej jest w niej malwidyno-3- galaktozydu (251,2 ± 21,7 mg/kg), malwidyno-3-glukozydu (225,1 ± 12,4 mg/kg) oraz
24 malwidyno-3-arabinozydu (227,0 ± 21,2 mg/kg). Glikozydy delfinidyny obecne w borówce to delfinidyno-3-galaktozyd (553,7 ± 26,2 mg/kg), delfinidyno-3-arabinozyd (424,8 ± 27,2 mg/kg) i delfinidyno-3-glukozyd (342,9 ± 19,9 mg/kg). Pozostałe antocyjany, takie jak glikozydy petunidyny i peonidyny występują w mniejszych stężeniach (odpowiednio około 60 mg/kg i 4 mg/kg) [48]. Podobne wyniki zawartości antocyjanów oznaczono w koncentracie z owoców borówki amerykańskiej. Całkowita zawartość antocyjanów wynosiła 374 µg/100 mL, z czego najwięcej było glikozydów malwidyny (165 µg/100 mL), delfinidyny (57 µg/100 mL), petunidyny (65 µg/100 mL) oraz cyjanidyny (47 µg/100 mL) [82]. Według badań przeprowadzonych przez Li i in. [83] ponad 45% antocyjanów zawartych w borówce wysokiej stanowią malwidyno-3-galaktozyd (17,1 ± 2,7%), malwidyno-3-glukozyd (17,1 ± 2,7%) oraz delfinidyno-3-galaktozyd (13,4 ± 2,9%). Na podstawie przedstawionych wyników widać wyraźnie, że głównymi antocyjanami w borówce wysokiej są glikozydy malwidyny (42,9 ± 7,2%), podczas gdy owoce borówki czarnej zawierają około 13% tych związków. Natomiast zawartość glikozydów cyjanidyny w borówce amerykańskiej (7.0 ± 2.1%) jest mniejsza niż w czernicy (33,0 ± 6,0%). Stężenie glikozydów petunidyny i delfinidyny w owocach obu borówek kształtuje się na podobnym poziomie (odpowiednio 15% i 30%) [83].
Całkowita zawartość związków polifenolowych zawartych w borówce amerykańskiej, oznaczonych metodą Folina-Ciocalteu, wynosi od 180 do 585 mg/100 g świeżych owoców [84,85]. Rios de Souza i in. [86] oznaczyli zawartość polifenoli na poziomie 305 mg/100 g świeżych owoców, natomiast Zheng i in. [87] na poziomie 4,12 mg/g świeżych owoców.
Według klasyfikacji zaproponowanej przez Vasco podukty zawierające od 100 do 500 mg związków polifenolowych w 100 g świeżych owoców zostały zaliczone do grupy średnio bogatych w te związki [88]. W związku z tym owoce borówki wysokiej można uznać jako dobre źródło polifenoli. W owocach borówki wysokiej stwierdzono wysoką zawartość procyjanidyn, flawonoli (kempferol, kwercetyna, mirycetyna) oraz kwasów fenolowych, głównie kwasów hydroksycynamonowych, spośród których najwięcej jest kwasu chlorogenowego. Według Zheng i wsp. [87] stężenie kwasu chlorogenowego w owocach borówki wysokiej wynosi 646 µg/g świeżych owoców, co stanowi około 30%
wszystkich oznaczonych przez nich polifenoli. Te wyniki są nieco niższe od tych otrzymanych przez Taruscio i in. [89], którzy podają, iż zawartość kwasu chlorogenowego
25 w borówce amerykańskiej wynosi 1261-1414 µg/g świeżych owoców. Kwas chlorogenowy jest odpowiedzialny w głównej mierze za właściwości antyutleniające owoców borówki wysokiej. Jego udział w zdolności antyoksydacyjnej, oznaczony metodą ORAC, wynosi blisko 21% [87]. Pozostałe kwasy fenolowe: kwas elagowy, galusowy, kawowy, ferulowy oraz p-kumarowy występują w borówce amerykańskiej w niewielkich ilościach [46].
Mirycetyna jest głównym flawonolem występującym w owocach borówki czernicy, podczas gdy borówka amerykańska zawiera najwięcej pochodnych kemferolu i kwercetyny [46]. Zawartość kemferolu i jego pochodnych wynosi około 7 µg/g świeżych owoców, zaś kwercetyny i jej pochodnych 240 µg/g świeżych owoców. Glikozydy kwercetyny stanowią 75% wszystkich flawonoli zawartych w borówce wysokiej [46,87].
Owoce borówki wysokiej są często składnikiem zdrowej diety ze względu na niską kaloryczność (100 g świeżych owoców dostarcza 50 kcal) oraz niską zawartość tłuszczu (0.19%) [86]. Zawierają ponad 80% wody oraz 156,4 mg cukrów w 1 g świeżych owoców.
Spośród cukrów najwięcej jest fruktozy (84,4 ± 2,8 mg/g świeżych owoców), glukozy (64,4
± 1,9 mg/g świeżych owoców), najmniej zaś sukrozy (7,6 ± 0,7 mg/g świeżych owoców) [46]. Zawartość witaminy C w owocach borówki amerykańskiej waha się w granicach 8–73 mg w 100 g świeżych owoców [46,49,86]. Ponadto borówka wysoka zawiera aminokwasy:
cysteinę (78,2 mg/g świeżych owoców), metioninę (35,7 mg/g świeżych owoców), kwas glutaminowy (14,4 mg/g świeżych owoców), treoninę (9,3 mg/g świeżych owoców) oraz argininę (9,2 mg/g świeżych owoców) [90].
Borówka wysoka nie jest bogatym źródłem makro i mikroelementów. 100 g świeżych owoców dostarcza 56-80 mg potasu, 15-35 mg wapnia, 6-10 mg magnezu, 10-15 mg fosforu oraz 0,11-0,22 mg sodu. Ponadto w owocach borówki można znaleźć niewielkie ilości żelaza (0,15-0,60 mg), cynku (0,06-0,12 mg) i manganu (1,20-3,90 mg) [62].
Owoce borówki czernicy przewyższają owoce borówki amerykańskiej zarówno pod względem zawartości związków polifenolowych, jak i wartości odżywczych. Mimo to, borówka amerykańska z roku na rok zyskuje na popularności, a liczba plantacji tego owocu stale rośnie w naszym kraju. Borówka wysoka ma szereg właściwości prozdrowotnych. W literaturze można znaleźć informacje o jej właściwościach przeciwnowotworowych, przeciwzapalnych i wspomagających obniżenie poziomu cukru.
26 Ponadto ekstrakty z borówki amerykańskiej poprawiają krążenie, wspomagają leczenie choroby Alzheimera i innych chorób związanych ze starzeniem się organizmu [62].
Za właściwości przeciwzapalne ekstraktów z owoców borówek wysokich odpowiadają antocyjany, głównie malwidyno-3-glukozyd i malwidyno-3-galaktozyd. Ich działanie przejawia się między inymi hamowaniem działania czynnika martwicy nowotworu TNF-α, związanego z procesem zapalnym, którego nadmierna produkcja wiąże się ze zwiększoną podatnością na nowotwory, choroby autoimmunologiczne oraz alergie [91]. Ponadto wodno-alkoholowe ekstrakty mają zdolność do zmniejszania obrzęków. Podanie roztworu zawierającego 300 mg ekstraktu z borówki wysokiej zmniejszyło obrzęk łapy szczurów o 66%. Dodatkowo ekstrakty te inhibitują działanie enzymu mieloperoksydazy (MPO), który odpowiada za powstawanie niektórych chorób układu krążenia, w tym wystąpienie ostrego zespołu wieńcowego [92]. Analiza LC-MS stężenia antocyjanów w różnych częściach mózgu szczurów poddanych suplementacji borówką amerykańską wykazała obecność szeregu tych związków w móżdżku i korze mózgowej (związki te nie zostały wykryte u osobników, którym nie podawano borówki). Szczury zostały poddane także eksperymentowi poznawczemu (Labirynt Wodny Morrisa), który udowodnił poprawę zdolności uczenia się i zapamiętywania po 10 tygodniach spożywania owoców borówki amerykańskiej [93].
2.3. Borówka brusznica (Vaccinium vitis-idaea L.)
Borówka brusznica, zwana także borówką czerwoną, to trwała krzewinka zimozielona osiągająca wysokość do 30 cm. Podobnie jak borówka czernica i wrzos zwyczajny należy do rodziny wrzosowatych (Ericaceae) i porasta obszar niemal całej Polski. Jest krzewem krzaczastym o wzniesionych lub płożących się pędach oraz skrętoległych, skórzastych, z wierzchu ciemnozielonych, a od spodu jasnozielonych liściach [9]. Kwiaty borówki brusznicy są białe lub różowe, mają dzwonkowaty kształt i są zebrane w krótkie, gęste kwiatostany (Rys. 4). Owocem jest jagoda kulista o średnicy do 10 mm, na początku biała, potem czerwona o gorzko – kwaśnym smaku [94]. Borówka czerwona kwitnie w czerwcu i lipcu, owocuje od lipca do września, a jej liście zbiera się od czerwca do sierpnia [10].
27 Rys. 4. Borówka brusznica (Vaccinium vitis-idaea L.) w okresie kwitnienia i owocowania
[6,10].
Borówka brusznica rośnie na glebach suchych, ubogich i kwaśnych. Tak jak wrzos zwyczajny jest rośliną typowo acydofilną, związaną głównie z kwaśnymi torfowiskami, ale może występować też w borach bagiennych, sosnowych i wrzosowiskach [8,39].
Spotykana jest na obszarze całej Polski, zarówno na terenach nizinnych jak i górskich.
W górach występuje nawet powyżej 2000 m n.p.m. Gatunek ten porasta chłodne i umiarkowanie chłodne strefy klimatyczne Europy, Azji i Ameryki Północnej [9].
Zarówno owoce jak i liście borówki od lat stosowane są w celach leczniczych, gdyż zawierają dużo korzystnych dla zdrowia związków. Dojrzałe owoce są bogate w związki fenolowe, w tym glikozydy fenolowe – arbutynę i metyloarbutynę, garbniki katechinowe, kwasy organiczne i witaminy [10]. Borówka brusznica w przeciwieństwie do borówki czernicy i borówki amerykańskiej zawiera zdecydowanie mniej antocyjanów (stanowią one około 20% związków polifenolowych). Najwięcej w owocach borówki jest flawanoli i proantocyjanidynów (około 65% wszystkich polifenoli). Zawartość flawonoli, kwasów benzoesowych i cynamonowych kształtuje się na poziomie 15% [95].
Proantocyjanidyny są głównymi związkami polifenolowymi zawartymi w owocach borówki brusznicy (według badań Kylli i in. [96] stanowią 63-71% wszystkich polifenoli).
Proantocyjanidyny to bezbarwne związki zawarte w roślinach, które są polimerami związków polifenolowych i składają się z katechiny, epikatechiny, galokatechiny i epigalokatechiny połączonych głównie przez wiązania węgiel–węgiel między C4 i C8 oraz C4 i C6 (proantocyjanidyny typu B). Jeśli w strukturze proantocyjanidyn pojawia się też wiązanie eterowe pomiędzy O7 i C2, wówczas takie związki nazywane są proantocyjanidynami typu A. Proantocyjanidyny dzielą się też ze względu na ilość
28 cząsteczek tworzących związek na: dimery (2 cząsteczki), trimery (3 cząsteczki), oligomery (od 4 do 10 cząsteczek) oraz polimery (liczba cząsteczek przekracza 10).
Proantocyjanidyny, które zostały zidentyfikowane w owocach borówki czerwonej to dimery i trimery typu A oraz B [61,96,97].
W przeciwieństwie do borówki czernicy, która zawiera szereg różnych antocyjanów, borówka brusznica zawiera antocyjany z grupy cyjanidyn. Cyjanidyno-3–galaktozyd stanowi główny składnik owoców borówki; wielu autorów podaje stężenie tego związku na poziomie ponad 70% zawartości wszystkich antocyjanów [98, 99, 100]. Według badań przeprowadzonych przez Lee i wsp. [98] średnia zawartość cyjanidyno–3–galaktozydu wynosiła 79% (30,2 mg/100 g), cyjanidyno-3-glukozydu–10% (3,8 mg/100 g), zaś cyjanidyno-3-arabinozydu–11% (4,2 mg/100 g) wszystkich antocyjanów oznaczonych w owocach borówki czerwonej. Borówka brusznica zebrana w Finlandii zawierała 74,2%
cyjanidyno-3-galaktozydu, 23,9% cyjanidyno-3-arabinozydu, 15,6% cyjanidyno-3- glukozylorutynozydu oraz 1,90% cyjanidyno-3-glukozydu [95]. Podobne wyniki uzyskali Veberic i in. [48], którzy podają, że owoce borówki czerwonej składają się z cyjanidyno-3–
galaktozydu (348,6 mg/kg), cyjanidyno-3-glukozydu (53,5 mg/kg), cyjanidyno-3- arabinozydu (69,2 mg/kg) oraz cyjanidyno-3-ksylozydu (10,5 mg/kg). Zawartość antocyjanów, oznaczonych metodą HPLC–DAD–MS, w skandynawskiej borówce brusznicy wynosi od 68 do 174 mg/100 g [101, 102]. W literaturze można spotkać także informacje o całkowitej zawartości antocyjanów oznaczonych spektrofotometryczną metodą różnicową pH. Stężenie antocyjanów, oznaczone tą metodą, w owocach borówki czerwonej zebranej z terenów Ameryki Północnej kształtuje się na poziomie 17-33 mg cyjanidyno-3-glukozydu/100 g świeżych owoców) [98].
Zawartość flawonoli, kwasów hydroksybenzoesowych oraz hydroksycynamonowych w owocach borówki brusznicy wynosi 220 mg/100 g suszonych owoców, z czego stężenie flawonoli wynosi 117 mg/100 g, kwasów hydroksycynamonowych 93 mg/100 g, najmniej zaś jest kwasów hydroksybenzoesowych (10 mg/100 g) [59]. Spośród flawonoidów najwięcej jest kwercetyny i jej glikozydów. Do tej pory zidentyfikowano około 18 glikozydów kwercetyny takich jak kwercetyno-3-galaktozyd (86,1 ± 3,2 µg/g świeżych owoców), kwercetyno-3-ramnozyd (82,3 ± 6,2 µg/g świeżych owoców) i kwercetyno-3- arabinozyd (29,9 ± 2,1 µg/g świeżych owoców) [87]. W mniejszych stężeniach występują
29 kwercetyno-3-glukozyd, kwercetyno-3-rutynozyd oraz kwercetyno-3-pentozyd [103].
Kemferol i jego glikozydy występują w owocach borówki brusznicy w znacznie mniejszych ilościach w porównaniu do glikozydów kwercetyny. Zawartość kemferolu wynosi 5,3 ± 0,4 µg/g świeżych owoców, natomiast 3-glukozydu kemferolu 7,9 ± 0,8 µg/g świeżych owoców [87]. Ponadto zarówno owoce jak i sok z borówki czerwonej zawierają katechinę i epikatechinę [61,97]. Zheng i in. [87] oznaczyli stężenie kwasu kawowego i p-kumarowego na poziomie odpowiednio 63,4 oraz 61,6 µg/g świeżych owoców.
Hajazimi i in. [59] podają, że owoce borówki brusznicy zawierają także niewielkie ilości kwasu waniliowego (7,4 - 12,6 mg/100 g suszonych owoców). W literaturze bardzo mało jest informacji dotyczących zawartości flawonoidów i kwasów fenolowych w borówce czerwonej.
Owoce borówki brusznicy mają kwaśny odczyn, ich pH mieści się w zakresie 2,7 – 2,9 [98]. 100 mL soku z borówki zawiera 3,89 g fruktozy oraz 4,54 g glukozy [97]. Są niskokaloryczne (47 kcal w 100 g owoców) i zawierają bardzo mało tłuszczu. Średnia zawartość aminokwasów w borówce czerwonej wynosi 43,74 ± 5,34 mg/100 g, w tym 3,68 ± 0,42 mg/100 g niezbędnych aminokwasów. Aminokwasy, które występują w największych stężeniach to: asparagina (12,52 ± 2,06 mg/100 g świeżych owoców), arginina (6,26 ± 0,70 mg/100 g świeżych owoców), kwas γ-aminomasłowy (4,69 ± 0,59 mg/100 g świeżych owoców), glutamina (3,67 ± 0,54 mg/100 g świeżych owoców) oraz hydroksyprolina (3,08 ± 0,91 mg/100 g świeżych owoców) [98].
Zawartość makro- i mikroelementów w owocach jagód Vaccinium, w tym borówki brusznicy, jest rzadko opisywana. Składniki mineralne odgrywają znacząco rolę w funkcjonowaniu ludzkiego organizmu, wpływają na regulację czynności narządowych i ogólnoustrojowych, wchodzą w skład płynów ustrojowych i enzymów, a ich niedobór lub nadmiar prowadzi do zaburzeń fizjologicznych. Borówka czerwona, podobnie jak jagoda czarna i borówka amerykańska, zawiera niewiele makro i mikroelementów. Skesters i in.
[64] oznaczyli w owocach łotewskiej borówki czerwonej wapń na poziomie 240,7 mg/kg, potas-1005 mg/kg, magnez–103,2 mg/kg, sód–9,76 mg/kg, miedź–0,91 mg/kg, żelazo- 3,25 mg/kg, mangan–20,29 mg/kg, cynk–2,19 mg/kg. Owoce borówki zebranej z terenów Słowacji charakteryzują się podobnymi zawartościami tych pierwiastków (cynk 1,31–1,61
30 mg/kg, miedź 0,49–0,90 mg/kg) [104]. 100 g borówki brusznicy pokrywa w 100% dzienne zapotrzebowanie na mangan oraz w 60% na molibden [64].
Liście borówki brusznicy (Folium Vitisidaeae) są znanym od lat surowcem zielarskim, którego głównym składnikiem jest arbutyna. Arbutyna i jej pochodne stanowią od 30 do 50% sumy wszystkich związków polifenolowych obecnych w liściach [61,103]. Ponadto liście zawierają kwasy hydroksycynamonowe (pochodne kwasu kawowego, w tym kwas chlorogenowy), flawonole (głównie kwercetynoramnozyd, stanowiący 5–6% wszystkich polifenoli) oraz niewielką ilość proantocyjanidynów [65,103]. Młode liście zawierają więcej związków polifenolowych w porównaniu do kilkuletnich liści. Zawartość kwasów hydroksycynamonowych spada, natomiast proantocyjanidynów i flawonoli rośnie wraz z wiekiem liści [65].
Zarówno owoce jak i liście borówki brusznicy mają właściwości lecznicze i są wykorzystywane w tradycyjnej medycynie, gdyż przypisuje im się działanie przeciwzapalne, antyutleniające i antybakteryjne. Borówka czerwona ma najsilniejsze, potwierdzone w testach in vitro i in vivo, właściwości antyproliferacyjne w stosunku do komórek nowotworowych spośród wszystkich jagód [105]. Ponadto wykazuje także właściwości antykrwotoczne, antyseptyczne oraz podobnie jak żurawina wspomaga leczenie układu moczowego, między innymi zapalenie pęcherza moczowego, nerek czy kamicy moczowej. Owoce i liście zawierają związki (przede wszystkim arbutynę), które działają moczopędnie i odkażająco na drogi moczowe, ograniczając przy tym rozwój stanu zapalnego [97,100]. Poza arbutyną, borówka brusznica jest bogata w proantocyjanidyny A, którym przypisuje się również właściwości antyadhezyjne w kierunku bakterii Escherichia coli, a co za tym idzie mają działanie chroniące układ moczowy [103].
Wielu autorów publikacji naukowych podaje, że jagody Vaccinium ze względu na zawarte w nich polifenole chronią organizm przed starzeniem oraz chorobami neurologicznymi. Badania przeprowadzone na gryzoniach potwierdzają zredukowanie objawów choroby Alzheimera oraz starzenia się mózgu po suplementacji borówkami [106]. Kwas glutaminowy jest neuroprzekaźnikiem umożliwiającym przewodzenie impulsów nerwowych, pobudzającym w korze mózgowej ssaków i uważanym za ważny związek w procesie uczenia się i zapamiętywania. Jednakże zbyt duże stężenie tego kwasu może spowodować degenerację komórek nerwowych, a nawet ich śmierć. Związki
31 polifenolowe zawarte w jagodach, zwłaszcza w liściach borówki brusznicy, wykazują działanie ochronne w kierunku komórek nerwowych narażonych na dużą dawkę kwasu glutaminowego [107]. U szczurów cierpiących na nadciśnienie, ekstrakty z borówki brusznicy poprawiły funkcjonowanie śródnabłonka naczyniowego, wysoce wyspecjalizowanej wyściółki naczyń krwionośnych i limfatycznych biorącej udział w aktywnym transporcie substancji chemicznych i wydzielającej substancje aktywne biologicznie. Ponadto soki z owoców borówki czerwonej i żurawiny mają zdolność do hamowania aktywności cyklooksygenazy (COX 2), enzymu aktywowanego pod wpływem czynników związanych ze stanem zapalnym [108,109].
Antocyjany, flawon-3-ole oraz flawonole zawarte w borówce brusznicy wykazują najsilniejsze działanie antyoksydacyjne i cytoprotekcyjne w stosunku do rodników nadtlenkowych, a także hamują działanie dehydrogenazy mleczanowej (LDH), biomarkera stresu oksydacyjnego [110]. Ponadto polifenole inhibitują utlenianie frakcji LDL, obniżając tym samym zbyt wysoki poziom cholesterolu [95,104].
Proantocyjanidyny są odpowiedzialne także za właściwości antybakteryjne borówki brusznicy. Ekstrakty z jej owoców wykazują silne działanie antybakteryjne w kierunku bakterii Staphylococcus aureus, ale bardzo słabe działanie w kierunku Gram–negatywnych Salmonella enterica i Campylobacter jejuni [96]. Borówka brusznica pomaga także w zwalczaniu patogenów jamy ustnej, zwłaszcza Streptococcus mutans i Fusobacterium nucleatum, stanowiących główny czynnik etiologiczny powstawania próchnicy zębów i parodontozy [111]. Dodatkowo sok z jej owoców obniża adhezję bakterii z rodzaju Asaia o 67%. Bakterie Asaia to bakterie kwasu octowego, występujące w tropikalnych kwiatach i owocach, ale ostatnio spotykane także w wodach i napojach smakowych. Mają one silne właściwości adhezyjne, a ich rozwój powoduje powstawanie osadów, kłaczków oraz zmiany zapachu i barwy produktów spożywczych [97].
32 3. Kory drzew leśnych
3.1. Kora dębu (Quercus robur L.)
Dąb szypułkowy Quercus robur L. to gatunek potężnego i długowiecznego drzewa liściastego z rodziny bukowatych (Fagaceae). Osiąga on wysokość 30-40 m, pierśnicę 1,5-3 m i żyje ponad 700 lat [8]. Dąb ma kopułowatą koronę z grubymi i rozłożystymi konarami, krótki pień oraz ciemnozielone, skórzaste liście, które jesienią usychają i często pozostają na drzewie [6]. Kwitnie na przełomie kwietnia i maja, jego kwiaty są rozdzielnopłciowe, wiatropylne, żółtawozielone, męskie zebrane w kotki. Owocuje po 40-80 latach, a jego owoce to popularne żołędzie, dojrzewające we wrześniu i październiku. Żołędzie zebrane po 2-3 na szypułkach, osadzone są w szarych półokrągłych miseczkach i stanowią pokarm dla wielu gatunków zwierząt [6,94]. Dąb jest jednym z najbardziej charakterystycznych drzew w europejskim krajobrazie, znanym już od czasów starożytnych. Quercus to starorzymska nazwa dębu, a robur oznacza długowieczny, dostojny i silny. Inna nazwa dębu Quercus robur to Quercus pedunculata Ehrh. Wywodzi się ona z języka łacińskiego i tłumaczy się ją jako dąb szypułkowy (z łac. pedunculus to szypułka kwiatowa) [8].
Rys. 5. Jeden z najstarszych dębów rosnących w Polsce – dąb Bartek z okolic Zagdańska oraz kora dębu szypułkowatego [8].
Dąb szypułkowy jest spotykany niemal w całej Europie (poza Islandią, północną Szkocją, Szwecją i Norwegią), na Kaukazie i Azji Zachodniej (Gruzja, Armenia, Azerbejdżan, Turcja). W Polsce jest popularny na całym obszarze kraju, zarówno na niżu, jak i w górach, do 600 m n.p.m. [8,94]. Wraz z dębem bezszypułkowym (Quercus petraea) zajmuje 7,7%
