Teeresa Cybularz-Urban 1, Anna Bach 2
1 Katedra Botaniki, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie
2 Katedra Roślin Ozdobnych, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie
Wstęp
W literaturze moŜna spotkać liczne doniesienia o kwitnieniu odmian i gatunków storczyków. Pojawiało się ono zarówno na siewkach, jak równieŜ u roślin rozmnaŜanych na drodze organogenezy za pomocą kultur tkankowych w warunkach in vitro. Kwiaty były formowane spontanicznie, bądź indukowane specyficznymi czynnikami środowiskowymi. Wśród nich są wymieniane: pH i zasobność poŜywki, obecność oligocukrów, fenoli, poliamin, sterydów, chelatów i innych suplementów.
Współdziała z nimi rodzaj, poziom egzo- i endogennych substancji wzrostowych, czas i kolejność aplikacji, temperatura i fotoperiod [CHIA i in. 1999; CAMPOS, KERBAUY 2004; VAZ
i in. 2004]. Kluczowy dla przebiegu kolejnych etapów morfogenezy i wejścia rośliny w stadium rozwoju generatywnego jest takŜe: genotyp, rodzaj, wiek oraz kondycja zdrowotna pobieranych eksplantatów [TRAN THAN VAN 1999; YU, GOH 2000a, 2000b; YU i in. 2000; HSU, YANG 2002; MUDALIGE,KUEHNLE 2004;VAZ i in.2004;TSAI i in.2005;WILSON i in.2005].
Celem pracy była analiza przyczyn spontanicznego kwitnienia mieszańca storczyka z rodzaju Cattleya namnaŜanego techniką in vitro.
Materiał i metody
Materiał donorowy stanowił okazały, blado-fioletowo kwitnący, mieszaniec Cattleya waltersiana × C. marone pochodzący z Ogrodu Botanicznego UJ, poraŜony wirusem pierścieniowej plamistości Odontoglossum (ORSV), (fot. 1). Inicjacja kultur in vitro nastąpiła przez izolację merystemów z wierzchołków wzrostu pędów. Merystemy wielkości 2-4 mm3 umieszczano w płynnej poŜywce inicjalnej (fot. 2). Była to poŜywka MS w modyfikacji KOZAK [1991] z dodatkiem 2,0 mg⋅dm-3 siarczanu adeniny, 9,7 mg⋅dm-3 kwasu askorbinowego, 0,5 mg⋅dm-3 zeatyny, 4,95 mg⋅dm-3 BA i 1,0 mg⋅dm-3 NAA; pH wynosiło 5,5; źródło węgla stanowiła 3% sacharoza. Pędy otrzymane z eksplantatów pierwotnych mnoŜono na poŜywce zestalonej 0,8% agarem Difco (fot. 3).
Zawartość zeatyny w poŜywce namnoŜeniowej obniŜono do 0,2 mg⋅dm-3, pozostawiając inne parametry niezmienione. Kulturę pędową prowadzono w naczyniach szklanych o pojemności 350 cm3, zawierających 50 cm3 poŜywki, w stałej temperaturze 25°C±2°C, przy wilgotności względnej wynoszącej ok. 70%, w warunkach fotoperiodu 16/8 godz.
(dzień/noc), pasaŜując ją w cyklach 8-tygodniowych. Źródłem światła były lampy fluorescencyjne o białej barwie światła i natęŜeniu promieniowania 80 µmol⋅m-2⋅sek-1.
T. Cybularz-Urban, A. Bach 52
Do oznaczenia obecności wirusa w roślinach donorowych i namnaŜanych w kulturach in vitro posłuŜono się testem biologicznym [WISLER 1989] i serologicznym DAS-ELISA [CLARK, ADAMS 1977].
Fot. 1. Roślina donorowa mieszańca Cattleya waltersiana × C. marone poraŜona wirusem ORSV z wyraźnym rozbiciem barwy kwiatów (pomniejszenie 2,5 ×)
KWITNIENIE MIESZAŃCA Cattleya (Orchidaceae) ... 53 Photo 1. Donor plant of the ORSV-infected hybrid Cattleya waltersiana × C. marone showing
notable color break of flowers (diminished 2.5 ×)
Fot. 2. Wielopędowa roślina storczyka - końcowy etap w płynnej poŜywce inicjalnej Photo 2. Multistem orchid plant - final stage of culture on the initial liquid medium
Fot. 3. Meryklony mieszańca na poŜywce zastalonej (powiększenie 3 ×) Photo 3. Mericlones of the hybrid on a solidified medium (magnification 3 ×)
Wyniki i dyskusja
T. Cybularz-Urban, A. Bach 54
W 14 miesiącu prowadzenia kultury pędowej badanego mieszańca (w trakcie piątego cyklu), trzy spośród trzydziestu roślin rosnących w jednym ze szklanych naczyń wykształciły spontanicznie kwiaty. Ich trwałość wynosiła około 3 tygodnie. Kwitnące pędy wysokości około 17 mm, charakteryzowały się brakiem wyraźnych zmian u liści, jednakŜe kwiaty nie były w pełni wykształcone morfologicznie. W obrębie okwiatu zaobserwowano słabo wykształcone działki z wyjątkiem warŜki, o wymiarach 13 × 6 mm (po jej rozwinięciu). Osłaniała ona zdeformowany, niewielki prętosłup (fot. 4).
Barwa szczątkowego okwiatu była zbliŜona do barwy kwiatów roślin donorowych.
Obecność wirusa w kwitnących pędach potwierdzono testem serologicznym DAS-ELISA i biologicznym z uŜyciem Nicotiana tabacum odm. Xsanthi nc.
Fot. 4. Pęd z miniaturowym, zniekształconym, kwiatem wytworzonym w kulturze in vitro (powiększenie 3 ×)
Photo 4. Shoot with a tiny deformed flower developed in in vitro culture (magnification 3 ×) Zastosowana przez autorki poŜywka była dobierana wyłącznie pod kątem przydatności do regeneracji eksplantatów i namnaŜania kultur tkankowych w celu ich odwirusowania [CYBULARZ-URBAN, HANUS-FAJERSKA 2006]. Charakteryzowała się stosunkowo wysokim stęŜeniem cytokinin, które mogły wywołać zakwitanie 10%
pędów badanego mieszańca Cattleya.
Stymulujący wpływ cytokinin, (zwłaszcza BA) na zakwitanie w kulturach in vitro był opisywany dla wielu gatunków storczyków z rodzajów: Aranda, Cymbidium, Dendrobium, Oncidium, Phalaenopsis, Vanda, mieszańców Doriella i Doriteanopsis i licznych roślin spoza rodziny Orchidaceae [SCORSA 1982; DUAN, YAZAWA 1994, 1995;
CHIA 1999; KOSTENYUK 1999; YU, GOH 2000a, 2000b; YU i in. 2000; CHANG, CHANG 2003;
TAYLOR i in. 2005].
Istotnym zdaje się być obecność wirusa w eksplantatach i zregenerowanych pędach. Mogła ona, wywołując zaburzenia w poziomie endogennych substancji wzrostowych [NOWAK 1999; TSAO i in. 1999], w wyniku akumulacji metabolitów stresu
KWITNIENIE MIESZAŃCA Cattleya (Orchidaceae) ... 55 [GRANT, MANSFIELD 1999] i wytwarzania substancji związanych z odpornością przeciw patogenom (m.in. kwasu salicylowego - MARTINEZ i in. [2004]), wpłynąć modyfikująco na rozwój wywołując kwitnienie mnoŜonego storczyka.
Analizując budowę morfologiczną kwiatów badanego mieszańca Cattleya stwierdzono niedorozwój okwiatu i organów generatywnych. Podobne zjawisko nawet u zdrowych storczyków obserwowali liczni autorzy [KERBAUY 1984; DUAN, YAZAWA 1995;
YON i in. 2003]. Zdecydowanie jednak przewaŜają doniesienia o wytwarzaniu w kulturach in vitro typowych morfologicznie, płodnych kwiatów, czasem owoców.
Dotyczą one zwłaszcza kwitnienia sterowanego u storczyków.
Wnioski
1. Spontaniczne zakwitanie mieszańca Cattleya w kulturach in vitro mogło być wynikiem stosowania wysokich dawek cytokinin lub/obecności ORSV w kul-tywowanej tkance.
2. Interesującym i godnym kontynuacji wydaje się zagadnienie sterowanego, wczesnego, zakwitania w kulturach in vitro tego i innych mieszańców (zwłaszcza uwolnionych od wirusów).
Literatura
CAMPOS K.O., KERBAUY G.B. 2004. Thermoperiodic effect of flowering endogenous hormonal status in Dendrobium (Orchideaceae). Journal of Plant Physiol. 161:
1385-1387.
CHANG C., CHANG W.C. 2003. Cytokinins promotion of flowering in Cymbidium ensi-folium var. misericors in vitro. Plant Growth Regul. 39: 217-221.
CHIA T.F., ARDITTI J., SEGREN M.J., HEW Ch.S. 1999. Review: in vitro flowering in orchids. Lindleyana 14 (2): 60-76.
CLARK M.F., ADAMS S.M. 1977. Characteristics of the microplate method of enzyme - linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34:
457-483.
CYBULARZ-URBAN T.,HANUS-FAJERSKA E.2006. Therapeutic effect of cytokinin sequence application on virus-infected Cattleya tissue cultures. Acta Biol. Crac. Series Bot.48/2:
27-32.
DUAN J.X., YAZAWA S. 1994. In vitro floral development in x Doriella Tiny (Doritis pulcherrima × Kingiella phillipinensis). Scientia Hort. 59: 253-264.
DUAN J.X., YAZAWA S. 1995. Floral induction and development in Phalaenopsis in vitro.
Plant Cell, Tissue and Organ Culture 43: 71-74.
GRANT M., MANSFIELD J. 1999. Early events in host - pathogen interactions. Curr. Opin.
Plant Biol. 2/4: 312-319.
HSU H.F., YANG CH.H. 2002. An orchid (Oncidium Grower Ramsey) A P3-like MADS gen regulates floral formation and invitation. Plant Cell Physiol. 43(10): 1198-1209.
KERBAUY G.B. 1984. In vitro flowering of Oncidium varicosum mericlones (Orchida-ceae). Plant Sci. Lett. 35: 73-75.
KOSTENYUK J., OH B.J., SO I.S. 1999. Induction of early flowering in Cymbidium niveo-marginatum Mak in vitro. Plant Cell Rep. 19: 1-5.
KOZAK D. 1991. Shoot regeneration from various parts of Narcissus cv. Carlton through tissue culture. Prace ISiK, Ser. B 16: 41-47.
T. Cybularz-Urban, A. Bach 56
MARTINEZ C., PONS E., PRATS G., LEON J. 2004. Salicylic acid regulates flowering time and links defence responses and reproductive development. Plant J. 37: 209-217.
MUDALIGE G.R., KEUHNLE R.K. 2004. Orchid biotechnology in production and improvement. Hort Science 39(1): 11-17.
NOWAK B. 1999. Regeneracja śliwy (Prunus domestica L.) odmiany Węgierka Zwykła z eksplantatów poraŜonych wirusem ospowatości śliw. Zesz. Probl. Post. Nauk Roln. 469:
581-586.
SCORSA R. 1982. In vitro flowering. Hort. Rev. 4: 106-127.
TAYLOR N.J., LIGHT M.E., VAN STADEN J. 2005. In vitro flowering of Kniphofia leuco-cephala: influence of cytokinins. Plant Cell. Tissue and Organ Culture 83: 327-333.
TRAN THANH VAN K. 1999. Floral and vegetative defferentiation in vitro and in vivo, w:
Morfogenesis in Plant Tissue Cultures. Soh W.Y, Bhojwani Sat S. (Eds), Kluwer, Dordrecht, The Netherlandes: 215-233.
TSAI W.C., LEE P.F., CHEN H.I., HSIAO Y.Y., WEI W.J., PAN Z.N., CHUANG M.H., KUOH
C.S., CHEN H.H. 2005. PeMADS6, a GLOBOSA/PISTILLATA-like gen in Phalaenopsis questris involved in petaloid formation and correlated with flower longevity and ovary development. Plant Cell Physiol. 46(7): 1125-1139.
TSAO C.V., POSTMAN I.D., REED B.M. 1999. Single and multiple virus infections reduce in vitro multiplication of ‘Malling Landmark’ raspberry. In vitro Cell. Dev. Biol. Plant.
35/3, 41A: 1013.
VAZ A.P.A., FIGUEIREDO-RIBEIRO R.C.L., KERBAUY G.B. 2004. Photoperiod and tempera-ture effect on growth and flowering of P. pussilla,an epiphyc orchid. Plant Physiology and Biochemistry 42: 411-415.
WILSON W.J., KENNEDY G.C., PEACOCK W., DENNIS S.E. 2005. Microarray analysis reveals vegetative molecular phenotypes of Arabidopsis flowering-time mutants. Plant Cell Physiol. 46(8): 1190-1201.
WISLER G.C. 1989. How to control orchid viruses: The complete guidebook. Published by Maupin Hause Publishers.
YON H.E., SUN Y.J., HWAN I.K., TAE Y., HEE CH.L., SU T.K., YOEOP P.K. 2003. Growth flowering and variation of somaclones as affected by subcultures and natural materials supplemented to media in Phalenopsis. Korean Journal of Horticultural Science and Technology 21(4): 362-368.
YU H., GOH C.J. 2000a. Differential gene expression during floral transition in an orchid hybrid Dendrobium Madame Thong-In. Plant Cell Rep. 19: 926-93.
YU H.,GOH C.J. 2000b. Identification and characterization of three orchid MADS box genes of the AP1/AGL9 subfamily during floral transition. Plant Physiol. 123:
1325-1336.
YU H., YANG S.H, GOH C.J. 2000. DOH 1, a class I knox gene, is required for mainte-nance of the basic plant architecture and floral transition in orchid. Plant Cell 12:
2143-2159.
Słowa kluczowe: storczyki, Cattleya, kultury in vitro, kwitnienie, fitohormony, meriklony, wirus pierścieniowej plamistości Odontoglossum (ORSV)
Streszczenie
KWITNIENIE MIESZAŃCA Cattleya (Orchidaceae) ... 57 Materiałem doświadczalnym był blado-fioletowo kwitnący mieszaniec Cattleya waltersiana × C. marone pochodzący z Ogrodu Botanicznego UJ, poraŜony wirusem pierścieniowej plamistości Odontoglossum (ORSV). Materiał ten został wprowadzony w warunki kultury in vitro przez izolację merystemów z wierzchołków wzrostu pędów (wielkości około 2-4 mm), a następnie namnaŜany w formie kultury pędowej na poŜywce MS w modyfikacji KOZAK [1991]. Kulturę prowadzono w stałej temperaturze 25°C±2°C, przy wilgotności względnej wynoszącej około 70%, w warunkach fotoperiodu 16/8 godz. (dzień/noc) i natęŜeniu promieniowania światła białego wynoszącego 80 µmol⋅m-2⋅s-1, pasaŜując w 8-tygodniowych cyklach. Po 14 miesiącach kultury na niektórych eksplantatach pędowych wykształciły się spontanicznie drobne zniekształcone kwiaty. Kwitnące w kulturach in vitro pędy charakteryzowały się brakiem wyraźnych zmian u liści, jednakŜe kwiaty nie były w pełni wykształcone morfologicznie. Najokazalsza część okwiatu odpowiadała warŜce osłaniającej niedokształcony prętosłup. Wybarwienie kwiatów było zbliŜone do wybarwienia okazałych kwiatów roślin donorowych prezentujących typowe dla obecności tego wirusa rozbicie barwy. Ich zakwitanie mogło być wywołane wysokim poziomem cytokinin lub/i obecnością ORSV.
FLOWERING OF Cattleya HYBRID (Orchidaceae) in vitro CULTURES
Teresa Cybularz-Urban 1, Anna Bach 2
1 Department of Botany, Agricultural University, Kraków
2 Department of Ornamental Plants, Agricultural University, Kraków
Key words: orchid, Cattleya, in vitro cultures, flowering, phytohormones, meri-clons, Odontoglossum ringspot virus (ORSV)
Summary
The study was conducted on a hybrid Cattleya waltersiana x C. marone having light-violet flowers, derived from the Botanical Garden of Jagiellonian University. The plant was infected with Odontoglossum ringspot tobamovirus (ORSV). Shoot apical meristem (2-4 mm long) was isolated from this material, transferred into in vitro culture and then, propagated as a shoot culture on the MS medium with KOZAK’s modification [1991]. The culture was maintained at 25°C±2°C, relative humidity 70%, under 16 h photoperiod from white light of 80 µmol⋅m-2⋅s-1intensity, and with 8-week subcultures.
Some shoot explants spontaneously developed tiny deformed flowers after 14 months of culture. The shoots flowering in in vitro cultures were characterized by unchanged leaves but flowers were not fully developed morphologically. The most manifest part of the perianth corresponded to the lip covering underdeveloped column. The color of flo-wers was similar to large floflo-wers of the donor plants, showing color break typical for the presence of the virus. The flowering might have been caused by a high level of cytokines and/or ORSV infection.
Dr Teresa Cybularz-Urban Katedra Botaniki
Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja Al. 29 Listopada 54
31-425 KRAKÓW
e-mail: tcybularz@ogr.ar.krakow.pl
ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 59-67