Teresa Cybularz-Urban 1, Ewa Hanus-Fajerska 1, Adam Świderski 2
1 Katedra Botaniki, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie
2 Zakład Biochemii, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie
Wstęp
Większość gatunków Cattleya to epifityczne storczyki, rosnące naturalnie w międzyzwrotnikowej strefie Ameryki. śyją one w rozwidleniach konarów drzew do wysokości 30-40 m. W dolnych partiach drzew lokują się storczyki lubiące cień lub półcień, potrzebujące bardzo wilgotnego powietrza. Natomiast rośliny rosnące wysoko na drzewach lub skałach będąc wystawione na silne oddziaływanie promieniowania słonecznego, są równocześnie zraszane obficie przez deszcze i okresowo wysuszane przez wiatr. W tym stale zmieniającym się środowisku bytują storczyki o budowie kseromorficznej lub gruboszowate [OSZKINIS 2004].
Badany mieszaniec Cattleya intermedia × C. aurantiaca pochodził z kolekcji storczyków szklarniowych Ogrodu Botanicznego UJ. W szklarniach i w kulturach in vitro na ogół nie spotykamy nadmiaru ultrafioletu. Co więcej, dla roślin mnoŜonych in vitro światło odgrywa rolę raczej w procesie morfogenezy, a nie fotosyntezy, gdyŜ źródłem energii są dla nich polisacharydy zawarte w poŜywce. Równocześnie promieniowanie ultrafioletowe, podobnie jak daleka czerwień, nie są roślinom niezbędne do celów troficznych [MICHALCZUK 2000].
Celem prezentowanego doświadczenia było opracowanie charakterystyki morfologicznej i anatomicznej roślin uzyskanych w wyniku mikrorozmnaŜania mieszańca Cattleya. Badanie róŜnic pomiędzy mikroroślinkami poddanymi ekspozycji na UV-A i kontrolnymi uzyskanymi w kulturach naświetlanych światłem białym, dotyczyło zmian morfologiczno-anatomicznych, a takŜe zawartości chlorofili i karotenoidów, co jest bezpośrednio związane z wydajnością fotosyntetyczną materiału przeznaczanego do aklimatyzacji do warunków ex vitro.
Materiał i metody
Mieszaniec Cattleya intermedia × C. aurantiaca został przeniesiony do wa-runków kultury in vitro przez izolację merystemów z wierzchołków wzrostu pędów poprzez fazę ciał protokormopodobnych (protocorm-like bodies, PLBs), a następnie namnaŜany w formie kultur pędowych na zmodyfikowanej poŜywce MS KOZAK [1991] o
T. Cybularz-Urban, E. Hanus-Fajerska, A. Świderski 60
pH 5,5,zestalanej 0,8% agarem Difco, z dodatkiem 2,0 mg⋅dm-3 siarczanu adeniny, 9,7 mg⋅dm-3 kwasu askorbinowego, 0,2 mg⋅dm-3 zeatyny, 4,95 mg⋅dm-3 BA i 1,0 mg⋅dm-3 NAA. Jako źródło węgla stosowano 3% sacharozę.
Doświadczenie dotyczące wpływu UV-A na budowę i metabolizm mnoŜonego materiału zakładano z wierzchołkowej części pędów wysokości 5 mm.
PasaŜe przeprowadzano cyklicznie, co osiem tygodni, przenosząc na świeŜą poŜywkę o tym samym składzie, nie rozdzielając proliferujacych pąków przybyszowych od eksplantatów. Kultrę prowadzono w stałej temperaturze 25°C±2°C, przy dniu trwającym 16 godz. Jako źródło światła stosowano monochromatyczne lampy firmy Philips TLD 36W o długości fal 360-450 nm, w przypadku kontroli, lampy firmy Tungsram 40W F33 o białej barwie światła [BACH, ŚWIDERSKI 2000]. NatęŜenie promieniowania światła białego na poziomie kultury roślin wynosiło 60 µmol⋅m-2⋅s-1. Wilgotność względna kamery fitotronowej wynosiła 80%.
Przez sześć miesięcy prowadzono pomiary biometryczne. Oceniano następujące cechy: liczba pędów uzyskana z pojedynczego eksplantatu, długość namnoŜonych pędów oraz liczba i długość korzeni powietrznych o ile doszło do ich regeneracji na poŜywce proliferacyjnej, świeŜa masa pędów, korzeni i kalusa, jeśli następowało kalusowanie, sucha masa tkanek zregenerowanych z pojedynczego eksplantatu.
Reprezentatywne próby liści utrwalano w aldehydzie glutarowym, a następnie po odwodnieniu i nasyceniu, zatapiano w Eponie 812. Tak przygotowane bloczki krojono przy uŜyciu ultramikrotomu Tesla 490A na skrawki o grubości 1µm. Dokumentację fotograficzną wykonywano przy uŜyciu mikroskopu świetlnego.
Zawartość barwników w liściach oznaczano zgodnie z metodyką uŜytą przez BACH iŚWIDERSKIEGO [2000].Do oznaczania stęŜenia chlorofili i karotenoidów pobierano próbki pędów o masie 200 mg. ZamroŜone próbki homogenizowano w moździerzu porcelanowym w acetonie z dodatkiem węglanu wapnia i piasku kwarcowego. Ekstrakt sączono do kolbki miarowej 10 ml, a następnie zmierzono absorbancję na spektrofotometrze Jasco V-530 w kuwetach 0,5 cm przy wybranych długościach fali 662, 645 i 470 nm. StęŜenie barwników obliczono według wzorów LICHTENTHALER i WELLBRUN [1983].
Doświadczenie prowadzono dwukrotnie w 23 powtórzeniach dla materiału hodowanego w UV i w takiej samej liczbie powtórzeń dla kontroli naświetlanej światłem białym. Uzyskane wyniki oceniano statystycznie z zastosowaniem programu Statistica 6,1 oraz testu F.
Wyniki i dyskusja
Zielono zabarwione tkanki ciał protokormopodobnych hodowane na stałej poŜywce regenerowały liczne pędy, które po osiągnięciu stadium 2-3 liści pobierano do doświadczenia z UF-A. JuŜ w trakcie pierwszego pasaŜu kultur pędowych zaobserwowano pojawianie się pąków przybyszowych. Naświetlanie kultur ultra-fioletem wywołało ograniczenie liczby regenerowanych struktur. Liczba pędów uzyskana w trakcie sześciomiesięcznego okresu trwania kultury na świetle UV-A była statystycznie istotnie niŜsza aniŜeli liczba pędów namnoŜonych w kulturze kontrolnej hodowanej na świetle białym i wynosiła średnio 5,13 dla UV oraz 11,61 dla światła białego (tab. 1). ŚwieŜa masa pędów równieŜ okazała się istotnie zróŜnicowana w tym układzie doświadczalnym. Większość uzyskanych w trakcie mikrorozmnaŜania pędów regenerowała korzenie powietrzne, przeciętnie od 1 do 7, jednak statystycznie istotną róŜnicę wykazano w przypadku pomiaru ich świeŜej masy (tab. 1).
WSTĘPNA CHARAKTERYSTYKA MORFOLOGICZNA, ANATOMICZNA ... 61 Tabela 1; Table 1 Proliferacja i potencjał morfogenetyczny kultur pędowych Cattleya hodowanych
w świetle UV oraz w świetle białym (* oznacza statystycznie istotne róŜnice dla α = 0,05) Proliferation and morphogenetic potential of Cattleya shoots cultured
under UV and white light (*are significantly different at α = 0.05) Rodzaj
ó odchylenie standardowe; standard deviation
Pod względem budowy morfologicznej organy zregenerowane w trakcie kultury w świetle UV-A nie odbiegały od kontroli, lecz osiągały mniejsze rozmiary (fot. 1a i b).
Wyraziste róŜnice dotyczyły budowy anatomicznej liści regenerowanych w zastosowanym zakresie światła. Ultrafiolet spowodował przerost komórek epidermy liści, zaburzenia w procesie róŜnicowania mezofilu i zniekształcenie struktury elementów waskularnych, przy jednoczesnym ograniczeniu liczby wiązek przewodzących w liściu (fot. 2a i b).
StęŜenie barwników fotosyntetycznych czynnych u roślin naświetlanych pro-mieniowaniem zakresu UV-A było znacząco niŜsze w porównaniu do analogicznego stęŜenia w roślinach kontrolnych (rys. 1). W przeliczeniu na świeŜą masę stęŜenie sumy chlorofili i karotenoidów było 1,7 razy niŜsze i wynosiło odpowiednio 21,24 i 4,15 mg⋅100 g-1 świeŜej masy. Odpowiadały im odpowiednio niŜsze stęŜenia chlorofili a i b (rys. 1), jednak większy spadek stęŜenia zanotowano dla chlorofilu a - prawie dwukrotny.
W badaniach dotychczas prowadzonych w warunkach in vitro, dotyczących wpływu rozkładu spektralnego światła na wzrost i morfogenezę kultur, zwykle uŜywano roślin dwuliściennych. JeŜeli chodzi o jednoliścienne, BACH i ŚWIDERSKI [2000]
opublikowali wyniki dotyczące kultur hiacynta, MENKE-MILCZAREK i in. [2001]
wykorzystali w tym celu rośliny zboŜowe, GABRYSZEWSKA i in. [2002] funkię, Przedstawicieli Orchidaceae wprowadzili do badań TANAKA i in. [1998].
T. Cybularz-Urban, E. Hanus-Fajerska, A. Świderski 62
WSTĘPNA CHARAKTERYSTYKA MORFOLOGICZNA, ANATOMICZNA ... 63 Fot. 1. Wpływ naświetlania kultur Cattleya intermedia × C. aurantiaca światłem białym
(1a) oraz ultrafioletem (1b) na proces organogenezy w eksplantatach pędowych Photo 1. The influence of white (W) (1a) and UV light (1b) on Cattleya intermedia × C.
aurantiaca organogenesis in shoot explants cultivated in vitro me - mezofil; mesophyll ep - epiderma; epidermis
v.b. - wiązka przewodząca; vascular bundle
Fot. 2. Szczegóły budowy anatomicznej liści zregenerowanych w świetle białym (W) i w ultrafiolecie (UV)
Photo 2. Anatomical features of leaves regenerated under white (W) and ultraviolet (UV) light
Rys. 1. StęŜenie chlorofili i karotenoidów w pędach mieszańca Cattleya po 6 miesiącach kultury in vitro
Fig. 1. Concentration of chlorophyls and carotenoids in hybryd Cattleya shoots cultivated in vitro for 6 months
Klon uŜyty w prezentowanym doświadczeniu charakteryzuje się powolnym wzrostem organów wegetatywnych. Optymalny wzrost roślin uzyskuje się w świetle rozproszonym [OSZKINIS 2004], z tego względu ten właśnie materiał roślinny wydawał się odpowiedni dla uzyskania wyrazistych wyników w odpowiedzi na naświetlanie UV-A. Naświetlanie młodych roślin mieszańca w sposób ciągły w okresie półrocznym wywołało wyraźne zmiany anatomiczne, morfologiczne i biochemiczne w porównaniu z kontrolą. Ich niezbyt ostry przebieg tłumaczyć moŜe częściowy udział niebieskiej części widma, co wynika z charakterystyki uŜytej lampy.
Rolę światła w morfogenezie łączy się z działaniem światła na substancje wzrostowe. Światło moŜe wpływać na indukowanie lub hamowanie biosyntezy, rozpadu i transportu regulatorów wzrostu, moŜe takŜe zmieniać wraŜliwość tkanek na regulatory endogenne i egzogenne [BALARDI i in. 1988; KOPCEWICZ i in. 1992; DASILVA, DEBERGH 1997].
JednakŜe informacje na temat wpływu barwy światła na róŜnicowanie, wzrost i
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
UV Control UV Control UV Control UV Control
Chlorophyll a Chlorophyll b Carotenoids Chlorophylls
Pigments concentration [mg/100g]
T. Cybularz-Urban, E. Hanus-Fajerska, A. Świderski 64
rozwój pędów oraz korzeni są w wielu przypadkach niejednoznaczne. Wynika to zapewne z porównania róŜnego rodzaju materiału roślinnego, a takŜe stosowania do badań roślin w róŜnych stadiach rozwoju i odmiennej metodyki oraz róŜnych źródeł światła [MICHALCZUK 2000].
Wyniki przedstawione w niniejszej publikacji stanowią podstawę do kontynuacji prac doświadczalnych nad wpływem promieniowania ultrafioletowego na kultury Cattleya.
Planowane jako kolejne doświadczenie łagodniejsze traktowanie UV-A (częściowy udział światła białego i skrócony czas ekspozycji) moŜe ujawnić spo-dziewane korzyści między innymi w postaci wytworzenia podwyŜszonego poziomu fenoli. Substancje te jako antyoksydanty chronią rośliny nie tylko przed ujemnymi skutkami stresu świetlnego, ale takŜe, wpływając na podniesienie ich odporności na patogeny, mogą decydować o lepszym przygotowaniu roślin do przejścia w warunki ex vitro [STREB i in. 1998;LAPLAZE i in. 1999; KRIZEK 2004; PFÜNDEL i in. 2006]. Zastosowanie UV-A stwarza takŜe moŜliwość bardziej naturalnego kształtowania określonego pokroju roślin, przykładowo zwiększenia ich zwartości przy równoczesnym ograniczeniu udziału drogich fitohormonów.
Celowe wydaje się równieŜ przeprowadzenie eksperymentów z wykorzystaniem krótszego zakresu widma, mianowicie UV-B (280-320 nm), które moŜe równieŜ indukować szereg waŜnych procesów morfogenetycznych roślin.
Literatura
BACH A.,ŚWIDERSKI A.2000.The effect of light quality on organogenesis of hyacynthus orientalis L. in vitro. Acta Biol. Cracow. Ser. Bot. 42/1: 115-120.
BALARDI R.,ROSSI F.,LECARI B.1988.In vitro shoot development of Prunus GF655-2:
interaction between light and benzyladenine. Physiol. Plant. 74: 440-443.
DASILVA M.H.M.,DEBERGH PC.1997.The effect of light quality on the morphogenesis of in vitro cultures of Azorina vidalii (Wets.) Feer. Plant Cell, Tiss.Org. Cult. 17: 133-142.
GABRYSZEWSKA E.,WOJTANIA A.,TUŁACZ L.2002.Wpływ regulatorów wzrostu, paklobu-trazolu oraz rodzaju światła na wzrost i rozwój pędów Hosta sieboldiana (Hook.) Engl.
in vitro. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 448: 611-621.
KOPCEWICZ J.,TRETYN A.,CYMERSKI M.1992.Fitochrom i morfogeneza roślin. PWN, Warszawa: 252 ss.
KOZAK D.1991.Shoot regeneration from various parts of Narcissus cv. Carlton through tissue culture. Prace ISiK, Ser. B 16: 58-106.
KRIZEK D.T.2004. Influence of PAR and UV-A in determining plant sensitivity and photomorphogenic responses to UV-B radiation. Invited review. Photochemistry and Photobiology 79(4): 307-315.
LAPLAZE L., GHERBI H., FRUTZ T.,PAWLOWSKI K., FRANCHE C.,MACHEIX J.,AUGUY F., BOGUSZ D.,DUHOUX E. 1999.Flawan-containg cells delimit Frankia-infected compar-tments in Casuarina glauka nodules. Plant Physiol. 121: 113-122.
LICHTENTHALER H.K., WELLBRUN A.R. 1983. Determination of total carotenoids and chlorophyll a and b of leaf extracts in different solvents. Biochem. Soc. Trans. 603:
591-592.
MENKE-MILCZAREK I.,śEBROWSKI J.,ZIMNY J.2001.Wpływ jakości światła na somaty-czną embriogenezę pszenicy. Biotechnologia 2/53: 99-103.
MICHALCZUK B. 2000. Wpływ jakości światła oraz eksplantatu na morfogenezę pędów
WSTĘPNA CHARAKTERYSTYKA MORFOLOGICZNA, ANATOMICZNA ... 65 petunii w kulturach in vitro. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 473: 177-184.
OSZKINIS K.2004.Storczyki. PWRiL Warszawa: 32-36.
PFÜNDEL E.E.,AGATI G.,CEROVIC Z.G.2006.Optical properties of plant surface, w: Bio-logy of the plant cuticule. Rieder M., Müller C. (Eds), Annual Plant Review. Blackwell Publishing 23: 216-249.
STREB P.,SHANG W.,FEIERABEND J.,BLIGNY R. 1998. Divergent strategies of photoprote-ction in high mountain plants. Planta 207: 313-324.
TANAKA M.,TAKAMURA T.,WATANABE H.,ENDO M.,YANAGI T.,OKAMOTO K.1998.In vitro growth of Cymbidium platlets cultured under superbright red and blue light emmiting diodes (LEDs). Journ. Hort. Science and Biotech. 73/1: 39-44.
Słowa kluczowe: storczyki, mikrorozmnaŜanie, UV-A, światło białe
Streszczenie
Licznie występujące w naturalnych warunkach gatunki Cattleya rozwijają się najlepiej w świetle rozproszonym. Mieszaniec C. intermedia × C. aurantiaca został przeniesiony do warunków kultury in vitro przez izolację merystemów z wierzchołków wzrostu pędów poprzez fazę ciał protokormopodobnych a następnie namnaŜany w formie kultur pędowych na zmodyfikowanej poŜywce MS z dodatkiem 2,0 mg⋅dm-3 siarczanu adeniny, 9,7 mg⋅dm-3 kwasu askorbinowego, 0,2 mg⋅dm-3 zeatyny, 4,95 mg⋅dm-3 BA, i 1,0 mg⋅dm-3 NAA, 3,0 g⋅dm-3 sacharozy i 8,0 g⋅dm-3 agaru Difco.
Kulturę prowadzono w stałej temperaturze 25°C±2°C, w warunkach fotoperiodu 16/8 godz. Jako źródło światła stosowano monochromatyczne lampy firmy Philips TLD 36W o długości fal 360-450 nm oraz, w przypadku kontroli, lampy firmy Tungsram 40W F33 o białej barwie światła. NatęŜenie promieniowania światła białego na poziomie kultury wynosiło 60 µmol⋅m-2⋅s-1. Naświetlanie kultur pędowych ultrafioletem wywołało ograniczenie liczby oraz świeŜej masy regenerowanych pędów przybyszowych. Na większości pędów uzyskanych w trakcie mikrorozmnaŜania nastąpiła spontaniczna regeneracja korzeni powietrznych. W kulturach eksponowanych na światło UV-A świeŜa masa zregenerowanych korzeni była istotnie niŜsza w porównaniu z kontrolą. Organy wegetatywne zregenerowane w trakcie kultury w ultrafiolecie nie odbiegały od kontroli pod względem budowy morfologicznej, pomimo iŜ osiągały znacznie mniejsze rozmiary. Natomiast wyraziste róŜnice dotyczyły budowy anatomicznej liści regenerowanych w trakcie naświetlania UV-A i liści roślin kontrolnych. Ultrafiolet spowodował przerost komórek epidermy liści, zaburzenia w procesie róŜnicowania mezofilu i zniekształcenie struktury elementów waskularnych, przy jednoczesnym ograniczeniu liczby wiązek przewodzących w liściu. StęŜenie barwników fotosyntetycznych czynnych u roślin naświetlanych promieniowaniem zakresu UV-A było znacząco niŜsze względem roślin kontrolnych naświetlanych światłem białym.
PRELIMINARY MORPHOLOGICAL, ANATOMICAL AND BIOCHEMICAL CHARACTERISTIC
OF MICROPROPAGATED Cattleya HYBRID UNDER UV-A AND WHITE LIGHT ILLUMINATION
T. Cybularz-Urban, E. Hanus-Fajerska, A. Świderski 66
Teresa Cybularz-Urban 1, Ewa Hanus-Fajerska 1, Adam Świderski 2
1 Department of Botany, Agricultural University, Kraków
2 Department of Biochemistry, Agricultural University, Kraków
Key words: orchid, micropropagation, UV-A, white light Summary
Numerous Cattleya species occuring in nature are developing in scattered light.
Tissue culture was obtained by isolation of meristems from Cattleya intermedia x C.
aurantiaca.
Protocorm-like bodies were regenerated in the liquid medium, and afterwards shoot cultures was initiated on the modified MS medum supplemented with 2.0 mg⋅dm-3 adenine sulphate, 5.0 mg⋅dm-3 benzylaminopurine, 0.2 mg⋅dm-3 zeatin, 1.0 mg⋅dm-3 naphtaleneacetic acid, 3% (w/v) sucrose and solidified with 0.8% (w/v) agar Difco.
Cultures were kept at 25°C±2°C, with 16-h light and 8-h dark period per day, under UV-A and white light respectively. The exposure of shoot culture to UV-A resulted in reduction of the number and fresh weight of regenerated adventitious shoots. The after-effect observed in the majority of regenerated shoots was spontaneous rhizogenesis. In cultures exposed to UV-A fresh weight of regenerated aerial roots was significantly lower as compared to the control. Vegetative organs regenerated during the submission to ultraviolet illumination were of considerably smaller size, still their morphology was undisturbed. Instead, the distinct dissimilarities were observed in the anatomy of leaves regenerated in UV-A and in white light. UV-A induced excessive growth of epidermal cells, disturbances in mesophyll differentiation, deformation of vascular elements and reducing of vascular bundle number were observed. Concentration of photosynthetically active pigments was lower in plants exposed to UV-A.
Dr Teresa Cybularz-Urban Katedra Botaniki
Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja Al. 29 Listopada 54
31-425 KRAKÓW
e-mail: tcybularz@ogr.ar.krakow.pl
ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 69-82