GraŜyna Dąbrowska 1, Karina Kaczmarek 1, Edyta Skrzypek 2, Magdalena Szechyńska-Hebda 2
1 Zakład Genetyki, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu
2 Instytut Fizjologii Roślin im. F. Górskiego Polskiej Akademii Nauk w Krakowie
Wstęp
Liczne czynniki biotyczne i abiotyczne powodują wzmoŜoną generację reak-tywnych form tlenu, które w normalnych warunkach powstają jako nieuchronny produkt metabolizmu tlenowego. Do stresu oksydacyjnego dochodzi wówczas, gdy zaburzona zostaje fizjologiczna równowaga pomiędzy produkcją reaktywnych form tlenu a działaniem mechanizmów je usuwających. W bezpośrednią regulację komórkowego stęŜenia anionorodnika ponadtlenkowego O2⋅⋅⋅⋅_ i H2O2 zaangaŜowane są dysmutazy ponadtlenkowe (E.C.1.15.1.1; SOD - ang. superoxide dismutase), metaloproteiny katalizujące reakcję dysproporcjonowania (dysmutacji) dwóch anionorodników ponadtlenkowych do nadtlenku wodoru i tlenu cząsteczkowego [DAT i in. 2001]. Dysmutazy ponadtlenkowe eliminują zatem pierwszy produkt jednoelektronowej redukcji tlenu przekształcając go w nadtlenek wodoru, który usuwany jest następnie przez katalazy i/lub peroksydazy [SCANDALIOS 2005]. Roślinne dysmutazy ponadtlenkowe tworzą złoŜony i bardzo skuteczny system pierwszej linii obrony przed stresem oksydacyjnym [ALSCHER i in. 2002]. ChociaŜ rodzina SOD obejmuje kilka izozymów, to udowodniono, Ŝe jedynie MnSOD (ang. manganese superoxide dismutase) jest niezbędna do przetrwania organizmów w środowisku tlenowym [BAEK,SKINNER 2005].
1 Badania realizowano w ramach projektu badawczego nr 3 P06A 009 25 finansowanego przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa WyŜszego.
Regulacja ekspresji genu MnSod w stanie stresu oksydacyjnego pozwala komórce na precyzyjną, zróŜnicowaną w sile i czasie trwania odpowiedź na czynniki wywołujące stres [SKRZYCKI, CZECZOT 2004]. Stres jest powszechnie postrzegany jako niekorzystny czynnik środowiskowy, prowadzący do miejscowego uszkodzenia lub nawet zamierania tkanek oraz efektów metabolicznych, głównie podwyŜszonego poziomu oddychania i nagromadzenia się substancji szkodliwych, takich jak reaktywne formy tlenu i fenole [DUBERT 2003].
Metoda kultur in vitro jest niewątpliwie jedną z cenniejszych technik wspo-magających postęp w biologii molekularnej roślin. Kultury tkankowe stanowią ponadto
G. Dąbrowska i inni 84
dogodny system modelowy do badania mechanizmów róŜnicowania się tkanek i regeneracji roślin.
Vicia faba ssp. minor jest gatunkiem o znaczeniu gospodarczym. Opracowano wydajny sposób regeneracji bobiku, gdzie oś niedojrzałych zarodków (bez merystemów wierzchołkowych pędu i korzenia) tworzy kalus regenerujący, a oś dojrzałych zarodków (bez merystemów wierzchołkowych pędu i korzenia) - kalus nieregenerujący [SKRZYPEK
2001].
Wstępne badania przeprowadzono w celu uzyskania sondy molekularnej dla Vicia faba ssp. minor, umoŜliwiającej sprawdzenie czy gen kodujący manganową dysmutazę ponadtlenkową ulega róŜnicowej ekspresji u bobiku rosnącego w kulturach in vitro.
Materiał i metody
Materiał doświadczalny stanowił kalus bobiku odmiany Nadwiślański (Vicia faba ssp. minor). Po około 10 tygodniach od wysiania nasion bobiku na poletkach doświadczalnych, z roślin pobrano 4-5 cm strąki. Strąki i nasiona dezynfekowano 1 min. w 70% etanolu, 30 min w 10% Domestosie i płukano 5 razy wodą sterylną. Z niedojrzałych zarodków izolowano osie zarodków, tworzące kalus regenerujący (R).
Osie dojrzałych zarodków, z których otrzymano kalus nieregenerujący (NR), pobierano ze sterylnie skiełkowanych nasion bobiku rosnących na agarze w temperaturze 20°C w warunkach 18/6 godz. - dzień/noc. Kalus regenerujący i nieregenerujący indukowano na poŜywce MS [MURASHIGE,SKOOG 1962] z dodatkiem 3% sacharozy, 600 mg⋅dm-3 myo-inozytolu, 1000 mg⋅dm-3 hydrolizatu kazeiny, 1 mg⋅dm-3 NAA, 0,5 mg⋅dm-3 BAP i 0,25 mg⋅dm-3 GA3, w 16 godz. fotoperiodzie i w temperaturze 20°C. Uzyskany w ten sposób materiał przechowywano w temperaturze -80°C.
Materiał do izolacji całkowitego RNA uŜytego jako matryca w reakcji RT-PCR stanowiły siewki bobiku odmiany Nadwiślański. Nasiona moczono przez około 24 godziny w wodzie destylowanej w 30°C, po czym wysiewano do doniczek wypełnionych mieszaniną wilgotnego piasku i wernikulitu (2 : 1). Doniczki z roślinami przenoszono do komory klimatyzacyjnej, gdzie rosły na świetle ciągłym w temperaturze 26°C.
Izolacja i oznaczanie stęŜenia kwasów nukleinowych
Izolację RNA ze 100 mg tkanki roślinnej (zarówno z siewek jak i z kalusa) przeprowadzano zgodnie z protokołem odczynnika TRI-Reagent firmy MRC, Cincinnati [CHOMCZYŃSKI, SACCHI 1987]. Wyizolowane RNA przechowywano w temperaturze -80°C.
DNA plazmidowe otrzymywano metodą lizy alkalicznej przeprowadzonej zgodnie z protokołem [SAMBROOK i in. 1989]. Podczas badań do analizy restrykcyjnej DNA uŜywano enzymów EcoRI i XhoI w buforze 2×Y+/Tango (Fermentas).
Ilość i jakość kwasów nukleinowych (stosunek A260/A280) mierzono spektro-fotometrycznie przy pomocy urządzenia GeneQuant (Pharmacia).
Reakcje odwrotnej transkrypcji, PCR i ligacja
Reakcję odwrotnej transkrypcji przeprowadzono według protokołu opisanego przez SZYP i in. [2001]. W celu namnoŜenia fragmentu cDNA kodującego MnSod Vicia
KLONOWANIE cDNA I EKSPRESJA GENU KODUJĄCEGO ... 85 faba ssp. minor przeprowadzono reakcje amplifikacji ze starterami MnSOD1
(5’-ATTCAACGGCGGAGGTCAT3-’) i MnSOD2
(5’-GTAGTAGG-CATGTTCCCAAAC-3’) zaprojektowanymi przy pomocy programu OligoAnalyzer 3.0 dla sekwencji konsensusowej, powstałej w wyniku zestawienia sekwencji MnSod Pisum sativum z homologiczną sekwencją Arabidopsis thaliana (MSD1), obie sekwencje zdeponowane są w banku genów NCBI, pod numerami odpowiednio: X60170 i NP_187703. Do projektowania starterów dla cDNA kodującego MnSod bobiku wykorzystano sekwencję o najwyŜszej homologii pomiędzy MnSod grochu i rzodkiewnika, obejmującą fragment długości 318 pz. Mieszaninę reakcyjną stanowiły: 2 µg cDNA, 0,6 U polimerazy Taq (EurX), startery MnSOD1 i MnSOD2 i 5 mM dNTP (Promega). Reakcja przebiegała w następujących warunkach: 94°C - 10 min, 33 cykle (94°C- 45 s, 51°C - 45 s, 72°C - 45 s).
Produkt RT-PCR, fragment sekwencji genu kodującego MnSod V. faba, izolowano z Ŝelu agarozowego za pomocą zestawu QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen). Produkt PCR ligowano z wektorem pCR®II-TOPO (Invitrogen) według dołączonego protokołu.
Transformacja komórek bakteryjnych i izolacja DNA plazmidowego
Kompetentne komórki E. coli szczepu DH5α transformowano mieszaniną ligacyjną poprzez zastosowanie szoku cieplnego. Z wybranych kolonii bakteryjnych (transformantów) wyizolowano DNA plazmidowego potrzebnego do reakcji sekwencjonowania wykonanej z uŜyciem uniwersalnego startera M13_rev (5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’) w Pracowni Sekwencjonowania i Syntezy Oligo-nukleotydów Instytutu Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk w Warszawie.
Hybrydyzacja RNA (technika northern)
Rozdziału cząsteczek całkowitego RNA dokonywano w 1,2% denaturującym Ŝelu agarozowym z zawartością formaldehydu w temperaturze 4°C. RNA po elektroforezie przenoszono na membranę nylonową (SIGMA) według protokołu [SAMBROOK i in. 1989]. Następnie membranę naświetlano UV w celu związania RNA (GS Gene Linker, BioRad). Sondami molekularnymi do hybrydyzacji było wyznakowane jednoniciowe RNA bobiku i pszenicy uzyskane z cDNA kodującego manganową dysmutazę ponadtlenkową w reakcji transkrypcji in vitro z uŜyciem zestawu T7 Transcription Kit (Fermentas). Hybrydyzację prowadzono w buforze Denhardta (1%
w/v Ficoll (typ 400), 1% w/v poliwinylopirolidon, 1% w/v BSA) w temperaturze 65°C przez noc. Niezwiązaną sondę molekularną usuwano poprzez 3-krotne odpłukiwanie błony (10 minut w temperaturze 50°C) w roztworze 0,2 x SSC i 0,5% SDS.
Wizualizację przeprowadzano przy pomocy zestawu Phosphoimager FLA3000 (Fuji).
Wyniki i dyskusja
Kultury tkankowe są szczególnie naraŜone na wpływ czynników stresogennych, gdyŜ juŜ sama hodowla in vitro jest w znacznym stopniu stresująca. W warunkach in vitro dochodzi do zmiany stęŜenia i kierunku transportu substancji troficznych obecnych w poŜywce. RównieŜ stęŜenia regulatorów wzrostu oraz skład atmosfery otaczającej hodowane kultury, w tym warunki tlenowe i stęŜenie etylenu zmieniają się w trakcie prowadzenia kultur. Ponadto, uwaŜa się, Ŝe same kultury tkankowe, zwłaszcza izolacja eksplantatów, moŜe generować stres oksydacyjny, chociaŜby na skutek ekspozycji tkanek, leŜących in vivo w głębi, na bezpośrednie działanie tlenu atmosferycznego. JednakŜe, pomimo tak wielu negatywnych skutków, stres moŜe mieć
G. Dąbrowska i inni 86
równieŜ charakter pozytywny - indukujący procesy rozwojowe. W kulturach in vitro, warunki odbiegające od optymalnych wydają się odgrywać waŜną rolę czynnika sprawczego, stymulującego procesy róŜnicowania komórek. Bodźce stresowe mogą przyczyniać się do przywrócenia komórkom zdolności mitotycznej, a następnie do ponownego róŜnicowania, kończącego się często regeneracją nowej, kompletnej rośliny [DUBERT 2003].
Szerokie zastosowanie w badaniach procesów róŜnicowania oraz zmian ge-netycznych zachodzących w kulturach in vitro znalazły markery biochemiczne i molekularne. W wyniku analizy tkanki uzyskanej w kulturze, stwierdzono zróŜni-cowane wzory izoenzymatyczne dla hodowli embriogennej i nieembriogennej [KUCHARSKA 1994]. Od kilkunastu lat podejmowane są próby identyfikacji enzymów antyoksydacyjnych jako markerów róŜnicowania. Wydaje się, Ŝe aktywności peroksydazy, dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy mogą słuŜyć do oceny kompetencji kultur tkankowych do regeneracji.
W celu określenia wzorca ekspresji genu MnSod w eksplantatach, z których otrzymano kalus regenerujący i nieregenerujący przeprowadzono analizę typu northern dla bobiku odmiany Nadwiślański. W tym celu wyizolowano całkowite RNA z eksplantatów oraz siewek bobiku, a jego jakość sprawdzano spektrofotometrycznie oraz wizualnie poprzez elektroforezę w Ŝelu agarozowym. Obrazy rozdziału elektroforetycznego charakteryzowała obecność róŜnego rodzaju rybosomowego RNA (rys. 1). Mimo duŜej zawartości związków fenolowych w tkankach bobiku [SKRZYPEK, DUBERT 2002] pomiary spektrofotometryczne równieŜ potwierdziły wysoką jakość wyizolowanego RNA. Początkowo jako sondę molekularną wykorzystano MnSod3.1 pszenicy wielkości 702 pz [WU i in. 1999]. JednakŜe, nie uzyskano specyficznej hybrydyzacji do mRNA bobiku (rys. 1). Jakość sondy molekularnej z pszenicy MnSod3.1 była wcześniej sprawdzona poprzez wykorzystanie jej do przeszukania biblioteki cDNA P. nil [DĄBROWSKA i in. 2005]. Brak hybrydyzacji cDNA MnSod3.1 do mRNA manganowej dysmutazy ponadtlenkowej bobiku, świadczy raczej o niewystarczającej homologii między tymi sekwencjami, która moŜe wynikać z niskiego stopnia pokrewieństwa obu gatunków oraz ze zmienności somaklonalnej kultur in vitro, aniŜeli o zastosowaniu zbyt restrykcyjnych warunków hybrydyzacji czy odpłukiwania membran. Słuszność powyŜszego załoŜenia wydaje się potwierdzać niespecyficzna hybrydyzacja sondy MnSod3.1 do rRNA. Dlatego sondę molekularną MnSod dla kultur V. faba przygotowano poprzez reakcję RT-PCR wykonaną na matrycach cDNA otrzymanych na drodze odwrotnej transkrypcji całkowitego RNA, pochodzącego z dwóch niezaleŜnych izolacji. W wyniku obu reakcji PCR otrzymano spodziewany produkt wielkości około 318 pz (rys. 2).
NR R NR R
KLONOWANIE cDNA I EKSPRESJA GENU KODUJĄCEGO ... 87
A B
Rys. 1. A - Całkowite RNA z eksplantatów nieregenerujących (NR) i regenerujących (R) bobiku rozdzielone w 1,2% agarozowym Ŝelu denaturującym. B - Autoradiogram uzyskany po hybrydyzacji z sondą molekularną MnSod3.1 pszenicy wyznakowaną radioizotopowo (32P)
Fig. 1. A - Total RNAs from nonregenerating and regenerating explants of V. faba separated on 1.2% denaturing agarose gel. B - Autoradiograph obtained after hybridisation with the 32P-labeled probe MnSod of wheat
M K 1 2 3 4
Rys. 2. Produkty reakcji PCR przeprowadzonej na cDNA bobiku ze starterami MnSOD1 i MnSOD2. Poszczególne ścieŜki Ŝelu zawierają: M - markerowe DNA PerfectTM 100 bp, K - kontrola negatywna reakcji PCR, 1-2 - produkty reakcji PCR przeprowadzonej na matrycach cDNA z siewki I bobiku, 3-4 - produkty reakcji PCR przeprowadzonej na matrycach cDNA z siewki II bobiku
Fig. 2. The PCR products of reaction carried out with MnSOD1 and MnSOD2 primers using cDNA of faba bean. The pathways of gel contained: M -DNA PerfectTM 100 bp marker, K - negative control of PCR reaction, 1-2 - PCR products obtained using cDNA from first seedling of faba bean, 3-4 - PCR products obtained using cDNA from second seedling of faba bean
Produkt reakcji RT-PCR oczyszczono z Ŝelu, a efektywność przeprowadzonej izolacji 300 pz
G. Dąbrowska i inni 88
sprawdzono elektroforetycznie w Ŝelu agarozowym, a następnie wklonowano do wektora pCR®II-TOPO i przeprowadzono transformowację bakterii E. coli.
Z uzyskanych kolonii bakteryjnych wyizolowano DNA plazmidowe, które poddano analizie restrykcyjnej enzymem EcoRI w celu kontroli wektora na obecność poŜądanej wstawki cDNA (dane niepokazane). W ten sposób uzyskano klon cDNA wielkości 318 pz, który następnie zsekwencjonowano (rys. 3). Otrzymaną sekwencję nukleotydową MnSod V. faba zestawiono w programie ClustalW z sekwencją cDNA genu MnSod3.1 Triticum aestivum (GenBank numer dostępu U72212). Analiza porównawcza wykazała 72,3% podobieństwo między tymi sekwencjami na odcinku długości 318 pz.
Prawdopodobnie zbyt niska homologia między sekwencjami bobiku i pszenicy była przyczyna niepowodzeń we wstępnych etapach badań. Natomiast homologia cDNA bobiku z sekwencją cDNA MnSod P. sativum wynosi 95% (rys. 3).
V. faba minor
V. faba minor GGGAACCATGCCTACTAC 318 P. sativum GGGAA-CATGCCTACTAC 678
***** ************
Rys. 3. Porównanie sekwencji nukleotydowej cDNA V. faba z cDNA genu MnSod P. sativum wykonane w programie ClustalW. Podkreślono sekwencje przyłączania starterów MnSOD1 i MnSOD2. Gwiazdkami zaznaczono pozycje identycznych nukleotydów
Fig. 3. The comparison of nucleotide cDNA V. faba sequence with cDNA sequence of the P. sativum MnSod gene performed by ClustalW. Sequences of MnSOD1 and MnSOD2 primers are underlined. Asterisks indicate identical nucleotides
Sklonowane cDNA bobiku uŜyto do kolejnej hybrydyzacji z całkowitym RNA V. faba (rys. 4). Wykazano, Ŝe gen MnSod bobiku ulega wyŜszej ekspresji w kalusie zdolnym regeneracji niŜ kalusie nieregenerującym. Sonda molekularna specyficznie hybrydyzowała z transkryptem wielkości około tysiąca par zasad. Zademonstrowane eksperymenty pokazały, Ŝe sklonowany fragment cDNA genu MnSod V. faba moŜe być
KLONOWANIE cDNA I EKSPRESJA GENU KODUJĄCEGO ... 89 z powodzeniem wykorzystany jako sonda molekularna do badania poziomu ekspresji genu manganowej dysmutazy ponadtlenkowej w tkankach bobiku uzyskanych z kultur in vitro. W związku z tym zaplanowano szereg kolejnych eksperymentów takich jak badanie poziomu ekspresji w warunkach stresu termicznego i osmotycznego, które pozwolą na określenie stopnia zaangaŜowania badanego genu w odpowiedź na warunki stresu oksydacyjnego w kulturach in vitro.
NR R NR R
Rys. 4. A - Całkowite RNA z eksplantatów nieregenerujących (NR) i regenerujących (R) V.
faba rozdzielone w 1,2% agarozowym Ŝelu denaturującym. B - Autoradiogram uzyskany po hybrydyzacji z sondą molekularną MnSod bobiku wyznakowaną radioizotopowo (32P)
Fig. 4. A - A total RNAs from nonregenerating and regenerating explants of V. faba separated on the 1.2% denaturing agarose gel. B - Autoradiograph obtained after the hybridisation with the 32P-labeled probe MnSod of faba bean
Wnioski
1. Kalus bobiku zdolny do regeneracji wykazuje wyŜszą ekspresję genu kodującego manganową dysmutazę ponadtlenkową w porównaniu z kalusem nieregenerującym.
2. Ekspresja genu kodującego MnSOD moŜe być jednym z markerów róŜnicowania tkanek w warunkach in vitro.
Literatura
ALSCHER R.G.,ERTURK N.,HEATH L.S. 2002. Role of superoxide dismutases (SODs) in controlling oxidative stress in plants. J. Exp. Bot. 53: 1331-1341.
BAEK K-H.,SKINNER D.Z. 2005. Differential expression of manganese superoxide dis-mutase sequence variants in near isogenic lines of wheat during cold acclimation. Plant Cell Rep. 25: 223-230.
G. Dąbrowska i inni 90
CHOMCZYŃSKI P., SACCHI N. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid gua-nidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156-159.
DAT J.F.,INZÉ D.,VAN BREUSEGEM F. 2001. Catalase-deficient tabacco plants: tools for in planta studies on the role of hydrogen peroxide. Redox Rep. 6: 37-42.
DĄBROWSKA G.,PRUSIŃSKA J.,GOC A.2005. Identyfikacja cDNA genu RSH (RelA/SpoT homolog) zaangaŜowanego w odpowiedź Pharbitis nil na warunki stresowe. Zesz.
Probl. Post. Nauk Rol. 509: 333-341.
DUBERT F. 2003. Reakcje tkanek roślinnych in vitro na stres temperaturowy. X Ogól-nopolska konferencja kultur in vitro i biotechnologii roślin. Biotechnologia roślinna w biologii, farmacji i rolnictwie. Wydawnictwa Uczelniane Akademii Techniczno-Rolniczej, Bydgoszcz, 18.
KUCHARSKA M. 1994. Markery biochemiczne i molekularne w badaniach kultur in vitro.
Prace Ogrodu Botanicznego PAN, Warszawa - Powsin, 5/6: 9-18.
MURASHIGE T.,SKOOG F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.
SAMBROOK J.,FRITSCH E.F.,MANIATIS T.1989. Molecular cloning. A Laboratory Manual.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 10.38-10.40.
SCANDALIOS J.G. 2005. Oxidative stress: molecular perception and transduction of sig-nals triggering antioxidant gene defenses. Braz. J. Med. Biol. Res. 38: 995-1014.
SKRZYCKI M.,CZECZOT H.2004. Ekspresja genów dysmutazy ponadtlenkowej w stanie stresu oksydacyjnego. Post. Biol. Kom. 31: 81-92.
SKRZYPEK E. 2001. Optimization of the regeneration abilities of field bean (Vicia faba L.
minor) in in vitro culture. Biol. Bull. Poznań 38(1): 87-95.
SKRZYPEK E., DUBERT F. 2002. Wzrost, róŜnicowanie i regeneracja bobiku (Vicia faba L.
minor) w kulturach in vitro. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 488: 555-564.
SZYP I.,DĄBROWSKA G.,TRETYN A. 2001. Wykorzystanie tkanki kalusowej w badaniach nad molekularnymi podstawami fotoperiodycznej indukcji kwitnienia. Biotechnologia 2(53): 165-169.
WU G., WILEN R.W., ROBERTSON A.J., GUSTA L.V. 1999. Isolation, chromosomal loca-lization, and differential expression of mitochondrial manganese superoxide dismutase and chloroplastic copper/zinc superoxide dismutase genes in wheat. Plant Physiol. 120:
513-520.
Słowa kluczowe: Vicia faba ssp. minor, kultury in vitro, manganowa dysmutaza ponadtlenkowa
Skróty:
RT-PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy na matrycy cDNA (ang. reverse transcription-PCR), dNTP - trifosforany deoksyrybonukleotydów, SDS - dodecy-losiarczan sodu (ang. sodium dodecyl sulfate), BSA - albumina z surowicy bydlęcej (ang. bovine serum albumin), 20 × SSC - (3 mol NaCl⋅dm-3, 0,3 mol⋅dm-3 cytrynian sodu).
Streszczenie
KLONOWANIE cDNA I EKSPRESJA GENU KODUJĄCEGO ... 91 Dysmutazy ponadtlenkowe pełnią kluczową rolę w systemie antyoksydacyjnym, a ich obecność stwierdzono zarówno u bakterii tlenowych i droŜdŜy, jak i u roślin wyŜszych i zwierząt. Badania dotyczące wpływu warunków stymulujących bądź hamujących dyferencjację kalusa na wzorzec ekspresji genu manganowej dysmutazy ponadtlenkowej przeprowadzono na bobiku odmiany Nadwiślański (Vicia faba ssp.
minor). W oparciu o sekwencje dostępne w banku genów NCBI (National Center for Biotechnology Information), zaprojektowano startery i wykonano reakcję PCR w celu uzyskania fragmentu 318 pz, który wklonowano do wektora pCR®TOPII, zsekwencjonowano i uŜyto jako sondę do hybrydyzacji typu northern. Sondę wyznakowano radioizotopowo metodą transkrypcji in vitro, a po hybrydyzacji otrzymano sygnał dla transkryptu wielkości około tysiąca nukleotydów. Badania wykazały, Ŝe gen MnSod ulega wyŜszej ekspresji w kalusie regenerującym niŜ nieregenerującym bobiku.
cDNA CLONING AND EXPRESSION OF GENE ENCODING MANGANESE SUPEROXIDE DISMUTASE OF Vicia faba ssp. minor
IN REGENERATING AND NON-REGENERATING EXPLANTS
GraŜyna Dąbrowska 1, Karina Kaczmarek 1, Edyta Skrzypek 2, Magdalena Szechyńska-Hebda 2
1 Nicolas Copernicus University, Department of Genetic, Toruń
2 Institute of Plant Physiology, Polish Academy of Sciences, Kraków
Key words: faba bean, in vitro cultures, manganese superoxide dismutase
Summary
Superoxide dismutases play a key role in the antioxidant system that explains their presence not only in aerobic bacteria and yeast, but also in higher plants and animals. The study concerning the effect of various conditions that stimulate or inhibit the differentiation of callus on manganese superoxide dismutase gene expression pattern was carried out on material derived from Vicia faba ssp. minor cv. Nadwiślański. On the basis of sequences contained in the GenBank National Center for Biotechnology, primers were designed and used in PCR reaction aiming at the amplification of 318 bp product, which was cloned into a vector pCR®TOPOII, sequenced and used as a probe in northern hybridization. The probe was radiolabelled by in vitro transcription, and after the hybridization, signals were obtained for about 1000 bp transcript. The study showed a higher expression of MnSod gene in regenerating and non-regenerating faba bean callus.
Dr GraŜyna Dąbrowska
Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej Zakład Genetyki
Uniwersytet Mikołaja Kopernika ul. Gagarina 9
87-100 TORUŃ
e-mail: browsk@uni.torun.pl
G. Dąbrowska i inni 92
ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 93-103