Anna Pindel
Katedra Botaniki, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie
Wstęp
Na prawidłowość rozwoju zarodków somatycznych, oprócz wielu innych czynników biotycznych i abiotycznych, wpływa w duŜej mierze rodzaj i stęŜenie, stosowanych do zestalania poŜywek, substancji Ŝelujących. „Twardość” poŜywki decyduje o statusie wodnym i dostępności róŜnych składników między innymi kwasu abscysynowego (ABA) i białek wpływających na dojrzewanie zarodków, u niektórych gatunków przez podniesienie stęŜenia agaru ogranicza się zjawisko szklistości.
Wiadomo, Ŝe róŜne gatunki w specyficzny sposób reagują na ten czynnik. Podjęto więc próbę zbadania tej zaleŜności u powstających drogą somatycznej embriogenezy zarodków szparaga ozdobnego.
W większości publikacji dotyczących embriogenezy u jednoliściennych autorzy podają tylko stęŜenia stosowanych substancji zestalających, rzadko zwracając uwagę na ich rodzaj [WANG i in. 2002; VIKRANT,RASHID 2003]. Agar jest mieszaniną polisacharydów o duŜej masie cząsteczkowej otrzymywanych z glonów z rodziny Rhodophyceae, z niego produkuje się przez oczyszczanie róŜne firmowe agary (Difco, Oxoid, Agarose) natomiast PhytagelTM jest produktem fermentacji bakterii zachodzącej w kontrolowanych warunkach (gellan gum), jego jakość jest lepsza i jest 2-3 razy
„twardszy” od pozostałych [TRIPLETT,JOHNSON 1999].
Celem pracy było zbadanie, czy rodzaj agaru uŜytego do zestalania poŜywek moŜe mieć wpływ na embriogenezę somatyczną u szparaga ozdobnego.
Materiał i metody
Wyselekcjonowany fenotypowo jasny, ziarnisty, embriogenny kalus szparaga gęstokwiatowego odmiany Sprengeri (Asparagus densiflorus L.) uzyskany z odcinków (krąŜków) międzywęźli etiolowanych siewek na poŜywce UM [UCHIMIYA, MURASHIGE
1974] z 2,0 mg⋅dm-3 2,4-D oraz 0,25 mg⋅dm-3 kinetyny umieszczano na poŜywce, która inicjowała pierwsze stadia rozwoju zarodków. Skład poŜywki ustalono we wcześniej-szych badaniach [PINDEL 2000]. Była to poŜywka płynna LS z 0,02 mg⋅dm-3 picloramu i 0,2 mg⋅dm-3 BA) [LINSMAIER, SKOOG 1965], na której badano wpływ agarów: Difco, Oxoid (Unipath LTD.) i PhytagelTM (Sigma) zastosowanych w stęŜeniach 0,2-1,0%, a takŜe podłoŜa płynnego na rozwój otrzymywanych drogą embriogenezy pośredniej zarodków somatycznych. Kolbki z eksplantatami w poŜywce płynnej były okresowo wstrząsane (maksymalna amplituda 100).
A. Pindel 170
Wyniki i dyskusja
Wiele gatunków jednoliściennych jest mikrorozmnaŜanych, równieŜ drogą somatycznej embriogenezy, w poŜywkach płynnych. Często jednak otrzymywane tą drogą zarodki charakteryzują się nieprawidłowym rozwojem, a u zregenerowanych roślin obserwowano szklistość. Z drugiej jednak strony zwiększanie stęŜenia agaru wpływa na dostępność nie tylko wody, ale i innych waŜnych składników poŜywki a szczególnie cytokinin [DEBERGH 1983; MOHOMED-YASSEN 2001]. Nie ma jednak jedno-znacznych danych, poniewaŜ róŜne eksplantaty dają róŜną odpowiedź.
W tabeli 1 zestawiono wyniki dotyczące rozwoju zarodków somatycznych szparaga (Asparagus densiflorus ‘Sprengeri’) z embriogennego kalusa na poŜywkach zestalonych agarami, PhytagelemTM oraz w poŜywce płynnej.
Tabela 1; Table 1 Rozwój zarodków somatycznych szparaga gęstokwiatowego odm. Sprengeri
w zaleŜności od stopnia utwardzenia poŜywki i rodzaju substancji Ŝelującej Development of asparagus Sprengeri cv. somatic embryos depending
on the medium hardness and type of gelling agents Substancja
Agar Difco 0,8 brak; lack zatrzymany rozwój zarodków w stadium ini-cjalnym
the development of embryos is stopped at the initial stage
in some embryos the development is disturbed by flatting embryonal axis
zamarły; dead PoŜywka płynna
Liquid medium
0 10 większość silnie wydłuŜonych, często bez plu-muli, liczne wtórne zarodki o nieprawidłowym
Agary Difco, Oxoid, oraz wysokie stęŜenie PhytageluTM nie gwarantują prawidłowego rozwoju. Fotografia 1 ilustruje powstawanie zarodków na poŜywce z Phytagelem TM , niektóre z nich mają nietypowy rozwój, zwłaszcza przy jego 0,2% stęŜeniu. Na to, Ŝe marka handlowa agaru odgrywa waŜną rolę w kulturach in vitro, zarówno juwenilnych jak i dojrzałych roślin, zwrócili uwagę juŜ PIERIK i in. [1997]. W większości prac do stabilizacji poŜywek stałych stosuje się agary głównie Difco, choć wielu autorów nie podaje nazw firm tylko stęŜenia. Agary róŜnią się między sobą zawartością róŜnych związków mineralnych, największe róŜnice dotyczą obecności jonów Ca, K, S i Cu, w agarze Oxoid jest teŜ stosunkowo duŜo azotu [BERUTO i in. 1999]. W połączeniu ze
skład-WPŁYW STANU FIZYCZNEGO PODŁOśA ... 171 nikami poŜywki mogą one wchodzić w pewne interakcje wpływające na rozwój kultury.
Fot. 1. Zarodki somatyczne na poŜywce utwardzonej Phytagelem TM. Strzałką zaznaczony zarodek o spłaszczonej osi
Photo 1. Somatic embryos on PhytagelTM containing medium. Abnormal embryo with flatting axis indicated by the arrow
Tabela 2; Table 2 Stopień uwodnienia zarodków somatycznych szparaga odm. Sprengeri
w zaleŜności od rodzaju i stęŜenia substancji Ŝelującej
Water content in somatic embryos of asparagus Sprengeri cv. depending on the type and concentration of gelling agents
Substancja Ŝelująca Gelling agent
StęŜenie agaru Agar concentration
(%)
Zawartość wody w zarodkach Water content in embryos
(%)
Agar Difco 0,8 brak zarodków (w embriogennym kalusie 90,1) lack of embryos (in embryogenic tissue 90.1) Agar Oxoid 1,0 brak zarodków (w embriogennym kalusie 90,1)
lack of embryos (in embryogenic tissue 90.1)
PhytagelTM 0,2
0,3 1,0
85,1 84,9
brak zarodków; lack of embryos PoŜywka płynna
Liquid medium
0 88,5
PEREZ-TORNERO i in. [2001] stosowali np. agar Hispanlab. S.A. w stęŜ. 0,7 lub 0,8%
lub Agargel (Sigma) 0,45 lub 0,5% i stwierdzili, Ŝe im wyŜsze stęŜenie tych substancji tym mniej szklistych pędów u moreli, choć zaleŜało to w duŜym stopniu od genotypu. U jednoliściennych np. u Crocus sativus często stosowany jest PhytagelTM[LOSCUTOV i in.
1999], choć VARSHNEY i in. [2000] w kulturach lilii uŜywali 0,8% agaru Quixcel.
RównieŜ w poŜywce płynnej (tab. 1) dojrzewanie zarodków szparaga było zakłócone, być moŜe wstrząsanie przyspieszało wtórną embriogenezę, zanim pierwotny zarodek osiągnął ostateczne stadium rozwoju (fot. 2).
A. Pindel 172
Zawartość wody w zarodkach (tab. 2) była niŜsza niŜ w embriogennym kalusie (o 5,5-5,8%), najmniej uwodnione były zarodki rozwijające się na poŜywce z PhytagelemTM w stęŜeniu 0,3%, czyli na podłoŜu gwarantującym najwyŜszą liczbę prawidłowo rozwijających się zarodków. MoŜna to chyba tłumaczyć jego wysokim stopniem „czystości” i duŜą twardością w porównaniu z innymi agarami.
Fot. 2. WydłuŜone zarodki z poŜywki płynnej Photo 2. Elongated embryos from liquid medium
Wnioski
1. PoŜywki płynne, oraz agary Difco i Oxoid nie są przydatne w procesie embriogenezy somatycznej u szparaga odm. Sprengeri.
2. Najlepiej przebiega rozwój zarodków na poŜywkach zestalonych PhytagelemTM, ale w dość niskich stęŜeniach.
Literatura
BERUTO M., BERUTO D., DEBERGH P. 1999. Influence of agar on in vitro cultures.
I. Physicochemical properties of agar and agar gelled media. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 35: 86-93.
DEBERGH P.C. 1983. Effects of agar brand and concentration on the tissue culture medium. Physiol. Plant. 59: 270-276.
LINSMAIER E.M.,SKOOG F.1965. Organic growth factor requirements of tobacco cul-tures. Physiol. Plant. 18: 100-127.
LOSCUTOV A.V.,BENINGER C.W., BALL T.M., HOSFIELD G.L., NAIR M., SINK K.C. 1999.
Optimization of in vitro conditions for stigma-like-structure production from half-ovary explants of Crocus sativus L. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 35: 200-205.
MOHOMED-YASSEN Y. 2001. Influence of agar and activated charcoal on uptake of gibberellin and plant morphogenesis in vitro. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 37:
204-205.
WPŁYW STANU FIZYCZNEGO PODŁOśA ... 173 PEREZ-TORNERO O., EGEA J.,OLMOS E.,BURGOS L.2001. Control of hyperhydricity in micropropagated apricot cultivars. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 37: 250-254.
PIERIK R.L.M.,OOSTERKAMP J.,MANSCHOT G.A.J.BARTH T.,SCHOLTEN H.J. 1997. Agar brand, a dominating factor for shoot growth of juvenile and adult Quercus robur L.
‘Fastigiata” in vitro. Plant Tiss. Cult. and Biot. 3/1: 27-31.
PINDEL A.2000. Przydatność róŜnych metod in vitro w rozmnaŜaniu szparagów ozdo-bnych. Zesz. Nauk. AR w Krakowie 266: 1-69.
TRIPLETT B.A.,JOHNSON D.S. 1999. Adding gelling agents to cotton ovule culture media leads to subtle changes in fiber development. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 35:
265-270.
UCHIMIYA H.,MURASHIGE T.1974. Evaluation of parameters in the isolation of viable protoplasts from cultured tobacco cells. Plant Physiol. 54: 936-944.
VARSHNEY A.,DHAVAN V.,SRIVASTAVA P.S.2000.A protocol for in vitro mass propagation of Asiatic hybrids of lily through liquid stationary culture. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 36: 383-391.
VIKRANT, RASHID A. 2003. Somatic embryogenesis from mesocotyl and leaf-base seg-ments of Paspalum scrobiculatum L., a Minor Millet. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 39:
485-489.
WANG Z.Y.,SCOTT M.,HOPKINS A.2002. Plant regeneration from embryogenic cell sus-pension cultures of Lolium temulentum. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 38: 446-450.
Słowa kluczowe: Asparagus densiflorus L. odm. Sprengeri, embriogeneza, agary
Streszczenie
Zarodki somatyczne otrzymywano drogą pośredniej embriogenezy somatycznej z kalusa indukowanego z odcinków międzywęźli siewek szparaga ozdobnego odmiany Sprengeri (Asparagus densiflorus) na poŜywce UM z 2,0 mg⋅dm-3 2,4-D i 0,25 mg⋅dm-3 kinetyny [PINDEL 2000]. Embriogenną tkankę umieszczano na poŜywkach o składzie podstawowym jak w LS z dodatkiem 0,02 mg⋅dm-3 pikloramu i 0,2 mg⋅dm-3 BA: płynnej (okresowo wstrząsanej przy 100 rpm) oraz zestalanych agarem Difco, Oxoid i PhytagelemTM. Obserwowano wpływ róŜnych rodzajów agarów i ich stęŜeń na prawidłowość rozwoju zarodków somatycznych. Stwierdzono, Ŝe PhytagelTM w stęŜeniu 0,3% gwarantował największą liczbę (83%) normalnie rozwiniętych zarodków.
THE EFFECT OF MEDIA HARDNESS ON THE ORNAMENTAL ASPARAGUS SOMATIC EMBRYOS DEVELOPMENT
Anna Pindel
Department of Botany, Agricultural University, Kraków
Key words: Asparagus densiflorus L. Sprengeri cv., somatic embryogenesis, gelling agents
Summary
Somatic embryos were obtained via indirect embryogenesis from ornamental
A. Pindel 174
asparagus. Calli were induced from the internodal segments of seedlings Asparagus densiflorus Sprengeri cv. on UM medium with 2.0 mg⋅dm-3 2,4-D and 0.25 mg⋅dm-3 kinetin [PINDEL 2000]. The embryogenic tissues were grown on liquid medium (temporary immersion) on a rotary shaker at 100 rpm and on Agar Difco, Oxoid or Phytagel - solidified LS media with the addition of 0.02 mg⋅dm-3 Picloram and 0.2 mg⋅dm-3 BA.
The differences between the type and concentrations of gelling agents on somatic embryos development were observed. It was concluded that PhytagelTM was very effective for normally development of ornamental asparagus somatic embryos. At the hardness of 0.3% of Phytagel TM 83% of normal developed somatic embryos were obtained.
Dr hab. Anna Pindel Katedra Botaniki
Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja al. 29 Listopada 54
31-425 KRAKÓW
e-mail: apindel@ogr.ar.krakow.pl
ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 175-184