W KULTURACH in vitro Ginkgo biloba L.
Agnieszka Szewczyk
Katedra i Zakład Botaniki Farmaceutycznej Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie
Wstęp
Miłorząb japoński (Ginkgo biloba L.) jest jedynym i reliktowym przedstawi-cielem klasy Ginkgopsida. Liście Ginkgo biloba L. są źródłem farmakologicznie czynnych laktonów z grupy di- i seskwiterpenoidów oraz związków flawonoidowych (o strukturze mono- i dimerycznej). Preparaty z liści są stosowane w lecznictwie, głównie w zaburzeniach krąŜenia mózgowego i obwodowego [WICHTL 1997]. Badania biogenezy terpenoidów oraz moŜliwości pozyskiwania tych związków metodami biotechnologicznymi, z róŜnego typu kultur in vitro tego gatunku, są przedmiotem wielu prac naukowych. W dostępnym piśmiennictwie jest natomiast niewiele doniesień na temat występowania innych metabolitów wtórnych w kulturach in vitro Ginkgo biloba. W tkance kalusowej oraz kulturach zawiesinowych stwierdzono obecność katechin i oligomerycznych proantocyjanidyn. Zawartość związków farmakologicznie czynnych jest niŜsza niŜ w roślinach gruntowych [BEEK 2000].
Celem niniejszej pracy było zbadanie moŜliwości zwiększenia produkcji fla-wonoidów poprzez zastosowanie metody elicytacji jasmonianem metylu kultur zawiesinowych z okazów Ŝeńskich Ginkgo biloba. Liczne doniesienia literaturowe wskazują, Ŝe jasmonian metylu moŜe stymulować kultury in vitro róŜnych gatunków roślin do zwiększenia produkcji biogenetycznie róŜnych grup metabolitów wtórnych m.in. antocyjanów, hyperycyny, saponin triterpenowych [LU 2001; WALKER 2002; PLATA
2003].
Materiał i metody Kultury in vitro
Komórkowe kultury zawiesinowe zainicjowano z tkanki kalusowej wyprowa-dzonej z liści okazów Ŝeńskich Ginkgo biloba L. otrzymanych z Ogrodu Botanicznego UJ w Krakowie. Wytrząsanie kultur zawiesinowych prowadzono w kolbach Erlen-meyera na poŜywce płynnej wg Murashige-Skooga [MURASHIGE, SKOOG 1962] z dodat-kiem pikloramu (4 mg⋅dm-3) oraz BA (2 mg⋅dm-3), pH 5,6, w temp. 25°C±1°C, przy ciągłym, sztucznym oświetleniu (ok. 2000 lx).
A. Szewczyk 224
Elicytacja
W ramach prowadzonych badań przetestowano ilość i sposób dodawania jasmonianu metylu: ilość dodawanego do hodowli jasmonianu metylu – 250 µM,125 µM, 50µM, 25 µM, sposób dodawania elicytora – po 0, 1, 2, 3 tygodniach hodowli.
Hodowle po elicytacji likwidowano co 24 godz. w ciągu 5 dni. Biomasę oraz poŜywki zbierano i liofilizowano.
Hydroliza
Badany materiał poddano hydrolizie roztworem wodnym kwasu solnego (25%
HCl) w celu odłączenia reszt cukrowych od aglikonów. 0,5 g zliofilizowanego surowca zalewano 5 ml 25% wodnego roztworu HCl oraz 25 ml MeOH i wytrząsano przez 60 min. Otrzymane hydrolizaty oczyszczono wstępnie od substancji balastowych techniką SPE (kolumna C18).
Analizy HPLC
Analizy prowadzono z wykorzystaniem aparatu Merck Hitachi (detektor UV L-7400, kolumna LiChrospher 100 RP-18e). Warunki analizy dla monomerycznych flawonoidów: λ = 370 nm, faza ruchoma metanol: 0,5% kwas fosforowy 1 : 1 v/v; sub-stancje wzorcowe (Sigma), czasy retencji (min.): apigenina RT = 34,7; kemferol RT = 31,7; kwercetyna RT = 16,1; luteolina RT = 18; mirycetyna RT = 6,85. Warunki analizy dla biflawonoidów: λ = 330 nm, faza ruchoma tetrahydrofuran : woda : 85% kwas fosforowy 40 : 60 : 1 v/v/v; substancje wzorcowe (Promochem), czasy retencji (min):
amentoflawon RT = 16,54; bilobetyna RT = 22,5; ginkgetyna RT = 25,19.
Wyniki i dyskusja
Na podstawie doniesień literatury stwierdzono, Ŝe stosowane dotychczas stęŜenia jasmonianu metylu (JM) jako elicytora zaleŜały od rodzaju gatunku rośliny i rodzaju kultury in vitro. W kulturze zawiesinowej Ipomoea batatas PLATA i in. [2003]
zastosowali 4,5-44,5 µM JM, natomiast ZHAO i in. [2004] w kulturze zawiesinowej Caesalpinia pulcherrima 0,3 mM tego związku. W korzeniach transformowanych Scutellaria baicalensis najlepsze okazało się stęŜenie 100 µM jasmonianu metylu [KUZOVKINA i in. 2001]. Po przeprowadzeniu optymalizacji procesu elicytacji w prezen-towanej pracy stwierdzono, Ŝe najlepsze wyniki uzyskano w przypadku uzupełnienia poŜywki 25 µM jasmonianu metylu po 2 tygodniach hodowli. W wyniku analizy chromatograficznej HPLC biomasy stwierdzono zwiększenie produkcji mono- i dimerycznych flawonoidów po elicytacji jasmonianem metylu. Tabela 1 przedstawia wyniki analizy ilościowej flawonoidów w kulturach kontrolnych i poddanych elicytacji.
Zaobserwowano 50% wzrost produkcji kwercetyny i kemferolu po 48 godz. od dodania elicytora. W przypadku biflawonoidów zaobserwowano zmiany ilościowe i jakościowe.
Po elicytacji znacząco zwiększyła się produkcja bilobetyny (87% po 48 godz.), wykryto równieŜ ginkgetynę oraz śladowe ilości amentoflawonu, nieobecne w próbach kontrolnych. W poŜywkach pobranych po 24 godz. i 48 godz. elicytacji stwierdzono śladową zawartość obu grup flawonoidów. W dostępnej literaturze nie znaleziono doniesień o występowaniu flawonoidów w kulturach in vitro Ginkgo biloba oraz o próbach zwiększenia ich produkcji metodą elicytacji. Po elicytacji jasmonianem metylu kultur korzeni transformowanych Scutellaria baicalensis, zawartość flawonoidów po 72 godz. wzrosła 2,3-krotnie [KUZOVKINA i in. 2001].
PRÓBY STYMULACJI PRODUKCJI METABOLITÓW WTÓRNYCH ... 225 Tabela 1; Table 1 Zawartość flawonoidów w kulturach in vitro Ginkgo biloba L.
Content of flavonoids in in vitro cultures of Ginkgo biloba L.
Zawartość flawonoidów
Content of flavonoids (mg⋅g-1 s.m.;
DM)
Czas dodania prekursora; Elicytor-adding time
kontrola control
24 godz.; 24 h 48 godz.; 48 h 72 godz.; 72 h 96 godz.; 96 h
Kwercetyna Quercetin
0,006±0,0003 0,0078±0,00009 0,0091±0,00003 0,009±0,0002 0,0086±0,0009
Kemferol Kaempferol
0,0021±0,0002 0,0029±0,0002 0,0044±0,0001 0,0041±0,0001 0,0037±0,00005
Ginkgetyna Ginkgetin
0,0005±0,0001 0,0007±0,00006 0,000935±0,0002 0,0009±0,0001 0,0008±0,0004
Wnioski
Zastosowanie elicytora w ilości 25 µM nie powoduje zamierania hodowli zawiesinowych w ciągu 5 dni. Wyniki analizy chromatograficznej HPLC pozwalają stwierdzić, Ŝe elicytacja jasmonianem metylu moŜe stymulować kultury Ginkgo biloba do zwiększenia produkcji flawonoidów.
Literatura
BEEK T.A. 2000. Ginkgo biloba. Harwood Academic Publishers, Amsterdam.
KUZOVKINA I.N.,GUSEVA A.V.,ALTERMAN I.E.,KARNACHUK R.A.2001. Flavonoid pro-duction in transformed Scutellaria baicalensis roots and ways of its regulation. Russian J. Plant Physiol. 48: 523-528.
LU M.B., WONG H.L., TENG W.L. 2001. Effects of elicitation on the production of saponin in cell culture of Panax ginseng. Plant Cell Rep. 20: 674-677.
MURASHIGE T., SKOOG F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15: 473-497.
PLATA N., KONCZAK-ISLAM I., JAYRAM S., MCCLELLAND K., WOOLFORD T., FRANKS P. 2003.
Effect of methyl jasmonate and p-coumaric acid on anthocyanin composition in sweet potato cell suspension culture. Biochem. Engineering Journ. 14: 171-177.
WALKER T.S., BAIS H.P., VIVANCO J.M. 2002. Jasmonic acid-induced hypericin produc-tion in cell suspension cultures of Hypericum perforatum L. (St. John’s wort).
Phytochemistry 60: 289-293.
WICHTL M. 1997. Teedrogen und Phytopharmaka. Wissenschaft. Verl., Stuttgart:
257-260.
ZHAO P.,YUKO I.,ISAO K.,YASUKUNI E.,HIROBUMI Y. 2004. Stimulating the production of homoisoflavonoids in cell suspenion cultures of Caesalpinia pulcherrina using cork tisssue. Phytochemistry 65: 2455-2461.
Słowa kluczowe: flawonoidy, Ginkgo biloba L., zawiesinowe komórkowe kultury,
A. Szewczyk 226
jasmonian metylu
Streszczenie
Kultury zawiesinowe Ginkgo biloba L. wyprowadzono z tkanek kalusowych regenerowanych z liści okazów Ŝeńskich. Kultury prowadzono na podłoŜu Murashige-Skooga z dodatkiem pikloramu (4 mg⋅dm-3) oraz BA (2 mg⋅dm-3). Zbadano wpływ stęŜenia i sposobu dodawania elicytora - jasmonianu metylu na akumulację fla-wonoidów oraz wzrost hodowli zawiesinowych. Stwierdzono, Ŝe najlepszą metodą jest dodatek 25 µM jasmonianu metylu w 14 dniu hodowli. Analizy ekstraktów metanolowych prowadzono metodą HPLC. Detekcję aglikonów flawonoidów pro-wadzono po hydrolizie glikozydów 25% wodnym roztworem HCl. Wyniki sugerują, Ŝe dodatek jasmonianu metylu moŜe stymulować kultury zawiesinowe Ginkgo biloba do zwiększenia produkcji flawonoidów.
THE STUDIES OF STIMULATION OF THE SECONDARY METABOLITE PRODUCTION IN in vitro
CULTURES OF Ginkgo biloba L.
Szewczyk Agnieszka
Chair and Department of Pharmaceutical Botany, Collegium Medicum, Jagiellonian University, Kraków
Key words: flavonoids, Ginkgo biloba L., cell suspension cultures, methyl ja-smonate
Summary
Cell suspension cultures of Ginkgo biloba L. were initiated from female plant callus cultures. Cultures were maintained on the Murashige-Skoog medium supplemented with picloram (4 mg⋅dm-3) and BA (2 mg⋅dm-3). The aim of this study was to investigate the impact of elicitor concentration and elicytor-adding time on the flavonoid accumulation and the cell growth of Ginkgo biloba cell suspensions. Methyl jasmonate was used as the elicytor. The optimum concentation of methyl jasmonate (25 µM) and time to add elicitor (14 the day of inoculation) was found. The analyses of methanol extracts were conducted by the HPLC method. Aglycons of flavonoids were detected after the hydrolisis of glycosides in 25% aqueous HCl. The results suggest that the addition of an elicytor to Ginkgo biloba cell suspension cultures could stimulate the production flavonoids.
Mgr Agnieszka Szewczyk
Katedra i Zakład Botaniki Farmaceutycznej Collegium Medicum Uniwersytet Jagielloński
ul. Medyczna 9 30-688 KRAKÓW
e-mail: agniszew@yahoo.com
ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 229-236