Ewa Dziedzic, Włodzimierz Lech, Monika Małodobry
Katedra Sadownictwa i Pszczelnictwa, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie
Wstęp
Wraz z pojawieniem się technologii in vitro otworzyły się nowe moŜliwości badania procesów fizjologicznych, które w warunkach naturalnych zachodzą głęboko w tkankach roślinnych. Jednym z takich procesów jest zapłodnienie zaląŜków, z których powstają nasiona, dające szanse na rozwój następnego pokolenia. Zapłodnienie in vitro moŜe być alternatywną metodą, mniej inwazyjną, w porównaniu do transformacji tkanek roślinnych, umoŜliwiającą w ogólnym pojęciu uzyskiwanie nowych form roślin.
Znajduje zastosowanie przy eliminacji niezgodności gametofitycznej, umoŜliwia wykonywanie krzyŜówek odległych form oraz skrócenie czasu otrzymywania wyników prac hodowlanych, stwarza moŜliwość badań dotyczących kontroli zapłodnienia roślin wyŜszych (mikrokultury zarodka i bielma), jak równieŜ moŜe być wykorzystane do badań związanych z doborem zapylaczy dla odmian gatunków sadowniczych. W tym ostatnim przypadku moŜe odegrać duŜą rolę dla gatunków z waŜnego gospodarczo rodzaju Prunus, dla którego wprowadzane są aktualnie nowe technologie hodowli [MARTINEZ-GÓMEZ i in. 2003].
Jednak przeprowadzenie zapylenia i zapłodnienia zaląŜków gatunków drzew owocowych z rodzaju Prunus jest trudnym zadaniem, ze względu na krótki okres kwitnienia roślin, co stwarza duŜe trudności w prawidłowym określeniu czasu efektywnego zapylenia, warunku niezbędnego do przeprowadzenia zapylenia in vitro.
Wymagane są ponadto duŜe zdolności manualne przy izolacji zaląŜka i ziaren pyłku, jak równieŜ znajomość składu i doboru poŜywek odpowiednich dla kiełkowania ziaren pyłku. Potwierdzeniem powyŜej wymienionych trudności badań jest fakt, Ŝe częściej podejmowane są badania na gatunkach krzewów owocowych, które posiadają wiele zaląŜków w zaląŜni [GRAY i in. 1990] niŜ na gatunkach drzew pestkowych. DuŜo trudności sprawiają równieŜ, kultury zapłodnionych zaląŜków i zarodków w początkowych etapach swojego wzrostu, ze względu na heterotroficzny sposób odŜywiania się tych ostatnich w bardzo wczesnych stadiach rozwoju. Mało danych literaturowych potwierdza fakt udanej kultury wczesnych etapów rozwoju zarodka [TRONCOSO i in. 2003], dlatego częściej prowadzi się hodowlę zarodków bardziej zaawansowanych w rozwoju, które są juŜ zdolne do samodzielnego odŜywiania się.
Badania tego typu, które prowadzi się na znacznie szerszą skalę, mają szczególne znaczenie w przypadku, gdy nowopowstałe zarodki są odrzucane przez tkanki macierzyste z powodu istniejących niezgodności między nimi. Znajduje równieŜ zastosowanie w przypadku otrzymywania roślin z nasion, których zarodki nie są zdolne do kiełkowania, takŜe przy ominięciu barier post-zygotycznych oraz do uzyskiwania roślin mieszańcowych, w przypadku braku rozwoju bielma. Technika ta, zwana
„embryo rescue”, umoŜliwia wyizolowanie zarodków, powstałych po zapyleniu zaląŜków w warunkach naturalnych, oraz ich hodowlę na odpowiednich poŜywkach z
E. Dziedzic, W. Lech, M. Małodobry 106
wykorzystaniem kultur in vitro. Pełny sukces, w postaci prawidłowo rozwiniętych roślin, osiąga się z zarodków izolowanych z tkanek matecznych 60 dni po kwitnieniu, jednak dąŜy się do pobierania zarodków, w jak najkrótszym czasie po kwitnieniu.
W Katedrze Sadownictwa i Pszczelnictwa AR w Krakowie przez szereg lat prowadzono doświadczenia na dwóch gatunkach z rodzaju Prunus, tj. śliwach i czereśniach. Badania te polegały, z jednej strony na zapylaniu zaląŜków w warunkach in vitro i podejmowaniu prób hodowli zapłodnionych zaląŜków, natomiast z drugiej na hodowli w warunkach sztucznych zarodków, izolowanych z kwiatów zapylanych w warunkach naturalnych, w bardzo wczesnych stadiach rozwojowych.
W prezentowanej publikacji przedstawiono część wyników wieloletnich prac, w porównaniu do osiągnięć prezentowanych w literaturze światowej.
Materiał i metody
Zapylanie zaląŜków śliw i czereśni przeprowadzano na poŜywkach w warunkach in vitro. Kwiaty przeznaczone do izolacji pyłku pobierano z sadu dwa dni przed kwitnieniem i przechowywano w chłodni. Natomiast zaląŜki izolowano z zaląŜni kwiatów w pełni kwitnienia. Sterylizację materiału roślinnego, tzn. zaląŜni i pylników oraz zapylanie zaląŜków śliw i czereśni przeprowadzano według metodyki opracowanej przez autorów i przedstawionej w kolejnych doniesieniach [LECH i in. 1993; DZIEDZIC i in.
1997, 1999]. Trzy dni po zapylaniu, z zaląŜków zdejmowano osłonki i wydobyte ośrodki wraz z woreczkami zaląŜkowymi (dalej określonymi jako „ośrodki”) przenoszono na poŜywki MURASHIGE i SKOOGA [1962] - MS z dodatkiem 3% sacharozy, zestalone 0,4%
agarem poŜywki P1, P2, P3 (tab. 1). W trakcie hodowli prowadzono obserwacje tkanek na poŜywkach, a z części obiektów wykonano preparaty parafinowe.
Tabela 1; Table 1 PoŜywki stosowane w doświadczeniach dotyczących zapylania zaląŜków i kultury zarodków
Media used for pollination of ovules and culture of embryos
Stosunkowo łatwiejszym zadaniem jest hodowla zarodków zaawansowanych w rozwoju tzn. takich, które są juŜ zdolne do samodzielnego odŜywiania się. Z zaląŜni kwiatów zapylanych w sadzie pobierano zarodki i wykładano na poŜywki w celu umoŜliwienia ich rozwoju. Zarodki pozostawały początkowo w zaląŜku (pod postacią
„niańki”), a potem izolowano zarodki z tkanek zaląŜka. Zarodki kilku odmian śliw, pochodzące z kwiatów po swobodnym zapyleniu w sadzie, pobierano 34, 41, 46 oraz 52
STAN BADAŃ NAD ZAPŁODNIENIEM in vitro ... 107 dni po kwitnieniu umieszczając następnie na poŜywkach: P5, P6, P7, P8 (tab. 1).
Wykonywano równieŜ zapylanie odmian czereśni: Kordia × Hedelfińska, Van × Hedelfińska oraz Hedelfińska × Van w sadzie. Po upływie 60 dni, od czasu zapylania, z nasion izolowano zarodki i wykładano na poŜywki P1, P2, P3 oraz P4. Po swobodnym zapyleniu czereśni ptasiej w warunkach naturalnych pobrano zaląŜki w dwóch terminach - 8 oraz 15 dni od kwitnienia. Z zaląŜków usunięto integumenty i tylko ośrodki wyłoŜono na poŜywkę P10 (tab. 1).
Wyniki i dyskusja
Podstawowym warunkiem umoŜliwiającym przeprowadzenie zapylenia zaląŜków na poŜywkach jest chemotropizm łagiewek pyłkowych. Z powodu braku tkanek szyjki słupka, które w warunkach naturalnych biorą udział w kierowaniu wzrostem łagiewki, udowodnienie występowania chemotropizmu łagiewek pyłkowych w pobliŜu zaląŜków potwierdza moŜliwość skierowania łagiewek do mikropyle zaląŜków, a następnie do woreczka zaląŜkowego. Występowanie chemotropizmu w przypadku śliw zostało udowodnione i potwierdzone obliczeniami statystycznymi, które zamieszczono w publikacjach [DZIEDZIC i in. 1997, 1999; DZIEDZIC 2004].
W trakcie kultury ośrodków na poŜywkach obserwowano zmiany w ich wyglądzie, część ośrodków nie podejmowała rozwoju, tkanki ciemniały i zamierały stopniowo, część powiększała się nadmiernie wykazując przerosty tkanek, tzw.
hiperplazję, czemu towarzyszyło kurczenie się woreczka zaląŜkowego, obserwowane na przekrojach parafinowych tych tkanek. Jednocześnie w nielicznych przypadkach, obserwacje woreczka zaląŜkowego wskazały, na obecność pojedynczych wolnych jąder bielmowych od mikropyle do końca chalazalnego, co moŜe świadczyć o zapłodnieniu, jak sugerują to badania RUBIO-CABETAS, SOCIAS [1996].
Natomiast nadmierny rozwój tkanki, od strony mikropyle, powodował pow-stawanie, tzw. kalotki, warstwy bardzo mocno zbitych komórek o grubych ścianach, która uniemoŜliwiała prawidłowe pobieranie składników odŜywczych z poŜywki i w efekcie zamieranie nowopowstałych struktur [DZIEDZIC i in. 2001]. Pozytywne symptomy rozwoju zaląŜków obserwowano w przypadku zaląŜków czereśni odmiany Hedelfińska, zapylanych pyłkiem tej samej odmiany. Po dziewiętnastu dniach od zapylania zaląŜków (szesnastu od usunięcia osłonek zaląŜków) i przeniesienia ośrodków na poŜywkę P1 w jednym spośród 45 sztuk hodowanych ośrodków zaobserwowano zamiany w wyglądzie i rozwoju. Stwierdzono pojawienie się zawiązka korzonka oraz liścieni w kolorze mlecznobiałym. Zygotyczny zarodek wykazywał strukturę polarną, wyraźnie oddzielającą się od pozostałej części ośrodka. W czasie dalszej hodowli na poŜywce nie nastąpiło jednak otwarcie się liścieni i uwolnienie stoŜka wzrostu pędu. Z kalusa, którym pokryły się liścienie, wyrosła jasnozielona, delikatna struktura podobna do pędu, zakończona słabo wykształconym liściem. Struktura ta nie wykazywała oznak rozwoju, nie obserwowano równieŜ zmian nekrotycznych hodowanych tkanek.
Drugim kierunkiem badań były kultury in vitro zapłodnionych zaląŜków oraz zarodków (pobieranych we wczesnych etapach rozwoju).
W przypadku śliw, po swobodnym zapyleniu kwiatów w sadzie, oraz czereśni po krzyŜowym zapyleniu kwiatów zarodki izolowano w róŜnym czasie od kwitnienia i prowadzono ich kulturę na poŜywkach (tab. 2). Jest to zgodne ze spostrzeŜeniami HU i ZANETTINI [1995], według których, wiek izolowanych zarodków decyduje o sukcesie kultury i naleŜy kaŜdorazowo doświadczalnie takie zaleŜności określić. JuŜ po kilku dniach od wyłoŜenia na poŜywki zarodków, na nielicznych kulturach obserwowano zazielenienie i otworzenie się liścieni, dzięki czemu uwalniał się merystem
wierz-E. Dziedzic, W. Lech, M. Małodobry 108
chołkowy pędu. Równocześnie zaobserwowano wzrost i wydłuŜanie się korzonka zarodkowego. Stosowane poŜywki róŜniły się rodzajem i zawartością substancji wzrostowych. Prawidłowością był fakt, Ŝe im młodsze zarodki były wykładane na znacznie dłuŜszego czasu - 42 dni, aby rozwinęły się rośliny.
Tabela 2; Table 2 Liczba dni potrzebnych do rozwoju zarodków śliwy i czereśni w rośliny,
po wyłoŜeniu na poŜywkę, w zaleŜności od liczby dni po kwitnieniu (pobieranie zarodków śliw i czereśni)
Number of days needed for plum and cherry embryo development, after placing them on the media, depending on a number of days after flowering Gatunek/ Odmiana zapłodnione zaląŜki. I tak dla czereśni ptasiej zapłodnione zaląŜki pobrano 8 oraz 15 dni po kwitnieniu, po czym na poŜywki wyłoŜono jedynie ośrodki z woreczkami. W chwili wykładania ośrodków na poŜywkę wyróŜniono trzy klasy wielkości. W tabeli 3 przedstawiono wyniki, jakie uzyskano po 30 dniach kultury ośrodków na poŜywce.
Ośrodki pobierane 8 dni po kwitnieniu rozróŜniono wg trzech grup długości:
średnia długość 2,1; 2,9 oraz 3,3 mm. Ośrodki izolowane z zaląŜków pobieranych w pierwszym terminie odznaczały się jedynie większą długością, ale nie stwierdzono w nich zróŜnicowania tkanek. Natomiast ośrodki pobieranie w terminie drugim (o średniej długości 4,3 i 4,5 mm) znacznie powiększyły swoją wielkość i odznaczały się zaawansowaniem w rozwoju. MoŜna było w nich wyróŜnić rozwijające się zarodki, o prawidłowej strukturze. Liścienie - początkowo o mlecznobiałej barwie - wykazywały rozwój, pojawiały się zielonawe struktury przypominające liście, jednak z oznakami zaburzenia fizjologicznego, jakim jest szklistość tkanek. W kolejnych dniach początko-we szybkie tempo rozwoju stopniowo słabło i miesiąc później nie zanotowano spodziewanych kolejnych etapów rozwoju zarodków.
Tabela 3; Table 3 Procent oraz długość ośrodków czereśni ptasiej
(pobranych 8 oraz 15 dni po kwitnieniu) wykazujących rozwój po 30 dniach kultury na poŜywce
STAN BADAŃ NAD ZAPŁODNIENIEM in vitro ... 109 Per cent and length of Prunus avium nuceluses showing the development
after 30 days of culture (ovules isolated 8 and 15 days after flowering)
Wykładanie na poŜywkę Placing the nucelluses on the media
Ocena po 30 dniach kultury ośrodków na poŜywce Estimation of nuceluses after 30 days of culture liczba ośrodków
number of nuceluses
średnia długość ośrodków mean length of nuceluses
(mm)
procent ośrodków wykazujących rozwój
percent of nuceluses showing development
średnia długość ośrodków mean length of nuceluses
(mm) 8 dni po kwitnieniu; 8 days after flowering
28 2,1 0 0
27 2,9 18,5 4,5
22 3,3 22,7 4,5
15 dni po kwitnieniu; 15 days after flowering
4 4,3 20,0 5,2
10 4,5 45,0 7,6
Porównując powyŜsze wyniki, jakie uzyskano po izolacji zapłodnionych za-ląŜków w stosunkowo krótkim czasie po kwitnieniu wydaje się, Ŝe naleŜy je traktować jako pierwsze osiągnięcie na drodze pokonywania trudności w kulturach wczesnych etapów rozwoju zapłodnionych zaląŜków i zarodków drzew owocowych.
Potwierdzeniem powyŜszego stwierdzenia niech będzie porównanie dotychczasowych badań w tej dziedzinie prowadzonych na świecie w ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat (tab. 4).
W tabeli 3 przedstawiono osiągnięcia uzyskane przez wielu autorów dotyczące prowadzenia badań nad niedojrzałymi zarodkami izolowanymi z zaląŜni od 28 do 60 dni po kwitnieniu.
Zarodki regenerują w wysokim procencie, a następnie przekształcają się w prawidłowo uformowane rośliny, kiedy są pobierane z nasion z niedojrzałych owoców. Takie doświadczenia prowadzone były na brzoskwiniach [PINTO i in. 1993, 1994; RIZZO i in. 1998; SCOZZOLI, PASINI 1992; SRIVASTAV i in. 2004], czereśniach [KUKHARCHYK,KASTRICKAYA 2006].
E. Dziedzic, W. Lech, M. Małodobry 110
Izolowane w tym terminie zarodki kiełkowały na poŜywkach w trakcie kultury w wysokim procencie (73%) dając prawidłowo zregenerowane rośliny. Szansą rozwoju zarodków powstałych po wykonaniu krzyŜowań oddalonych oraz w obrębie pokolenia F2 mieszańców międzygatunkowych jest izolacja z tkanek macierzystych i hodowla na poŜywkach. Metoda ta stanowi uproszczenie tradycyjnych metod hodowli dzięki mniejszym wymaganiom dotyczącym miejsca i czasu kultury. Na stosunkowo niewielkiej przestrzeni moŜna hodować wiele zarodków, które dają szansę otrzymania obiecujących mieszańców. I tak na przykład spośród 25 000 hodowanych zarodków czereśni ponad 500 adoptowano do warunków ex vitro i wysadzono do sadu [KUKHARCHYK,KASTRICKAYA 2006].
Metoda izolacji zarodków, po krzyŜowym zapyleniu, stosowanym w badaniach hodowlanych stwarza moŜliwość znacznie szybszej oceny otrzymanych siewek, tak jak w przypadku siewek brzoskwini, gdy juŜ w sześć miesięcy po wykiełkowaniu zarodków moŜna było dokonać oceny siewek [ARBELOA i in. 2003].
WaŜny jest termin pobierania niedojrzałych zarodków z nasion, powinien mieć miejsce natychmiast po zbiorze owoców. Przetrzymywanie owoców, nawet trzytygodniowe, jak w przypadku brzoskwini znacznie obniŜyło procent uzyskanych z zarodków roślin i ich Ŝywotność [ANDERSON i in. 2006].
Najkorzystniejszym cukrem, spośród kilku przebadanych w poŜywkach, dla rozwoju młodych zarodków brzoskwini okazały się sacharoza i glukoza, które umoŜliwiły otrzymanie silnych roślin, przydatnych do uprawy w szklarni [SCOZZOLI, PASINI 1992]. W niektórych przypadkach korzystna jest dwu etapowa kultura, najpierw indukowanie wzrostu zarodka wewnątrz zaląŜka, a następnie przenoszenie na nową poŜywkę. Taka procedura została zastosowana dla wczesnych odmian brzoskwini, umoŜliwiając uzyskanie z zarodków izolowanych 46 dni po kwitnieniu, nawet 50%
zregenerowanych roślin [ENJI i in. 1992].
Bardzo waŜnym zagadnieniem, w trakcie kultury zarodków w zaląŜku, jest prawidłowe odŜywienie rozwijających się zarodków. W tym przypadku tkanki zaląŜka ograniczają kontakt zarodka z poŜywką, co skutkuje brakiem dopływu substancji odŜywczych oraz brakiem lub nieprawidłowym rozwojem młodych struktur. Dlatego polecana jest metoda perforacji zaląŜków, które następnie są zagłębiane mikropylarnym końcem w poŜywkę. Opracowana i zastosowana dla zarodków brzoskwini metoda umoŜliwiła 2-4-krotnie większy ich wzrost [PINTO i in. 1993, 1994], ponadto dodatek aminokwasu L-glutaminy równieŜ wpłynął korzystnie na wzrost i rozwój zaląŜków.
Wnioski
1. Po zapylaniu w warunkach in vitro zaląŜków czereśni odm. Hedelfińska pyłkiem tej samej odmiany uzyskano rozwój zarodków do stadium liścieni.
2. Zarodki izolowane z niedojrzałych nasion śliw oraz czereśni (od 34 do 60 dni po kwitnieniu) po wyłoŜeniu na poŜywki wykazały prawidłowy rozwój w rośliny.
3. Powodzenie w warunkach in vitro kultury zarodków pobieranych we wczesnych etapach rozwoju w większym stopniu zaleŜy od stopnia zaawansowania w rozwoju niŜ składu zastosowanej poŜywki.
Literatura
ANDERSON N.,BYRNE D.H.,RAMMING D.W.2006.In ovule culture success as affected by sugar source and fruit storage duration in nectarine.Acta Hort. 713: 89-92.
STAN BADAŃ NAD ZAPŁODNIENIEM in vitro ... 111 ARBELOA A.,DAORDEN M.E.,GARCIA E.,MARIN J.A.2003.Successful establishment of in vitro culture of Prunus cerasifera hybrids by embryo culture of immature fruits.Acta Hort. 616:375-378.
BROOKS H.J., HOUGH L.F.1958. Vernalization studies with peach embryos. Proc. Am.
Soc. Hortic. Sci. 71: 95-102.
CHEÉ R., POOL R.M. 1987. Improved inorganic media constituents for in vitro shoot multiplication of Vitis. Scientia Horticulturae 32: 85-95.
DZIEDZIC E. 2004. Applying of in vitro method at the plum flowering studies. Scientific Works of the Lithuanian Institute of Horticulture and Lithuanian University of Agriculture 23(2): 92-104.
DZIEDZIC E.,LECH W.,MAŁODOBRY M.,JANKUN A.1997.Studies on fertilization of plum in vitro. Acta Hort. 478: 113-118.
DZIEDZIC E., LECH W., MAŁODOBRY M., JANKUN A. 1999. Badania zapłodnienia śliw w warunkach in vitro. Bibliotheca Fragmenta Agronomia 6: 75-80.
DZIEDZIC E.,LECH W.,MAŁODOBRY M. 2001. Wczesne stadia embriogenezy po zapyleniu śliw w warunkach in vitro. Biotechnologia 2(53): 54-61.
DRUART PH.,GRUSELLE R. 1986. Plum (Prunus domestica), w: Biotechnology in Agri-culture and Forestry. Bajaj Y.P.S. (Ed.) Vol. 1 Trees I. Springer Vg. Berlin: 131-154.
ENJI Z.,QIANG Y.,YULANG W.,DECHUN W. 1992. Studies on in-ovule embryo culture technique of early-maturing and very early maturing peach. Acta Hort. 300: 325-330.
GERCHEVA P.,ZHIVONDOV A.2002.Embryo rescue of early ripening plum cultivars. Acta Hort. 577: 165-168.
GRAY D.J.,MORTENSTEN J.A.,BENTON C.M.,DURHAM R.E.,MOORE G.A.1990.Ovule cul-ture to obtain progeny from hybrid seedless bunch rapes. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 15(6):
1019-1024.
HU C.Y., ZANETTINI M.H.B.1995. Embryo culture and embryo rescue for wide cross hybrids, w: Plant Cell Tissue and Organ Culture. Gamborg O.L., Philips G.C. (Red), Springer: 129-141.
IVANIČKA J.,PRETOVA A. 1986. Cherry (Prunus avium L.), w: Biotechnology in Agri-culture and Forestry, Bajaj Y.P.S. (Ed.), Vol. 1 Trees I. Springer Vg. Berlin: 154-169.
KUKHARCHYK N.,KASTRICKAYA M. 2006. Embryo rescue techniques in Prunus L. bree-ding. Journal of Fruit and Ornamental Plant Research 14 suppl 1: 129-135.
KÜDEN A.B.,BÜYÜKALACA S.,TANRIVER E.,GÜLEN H. 1996. Embryo rescue of peach breds.
Eucarpia Symposium, Horticulturae Research International, East Malling: 125.
LECH W.,MAŁODOBRY M.,LECH M.,NOWAK B. 1993. In vitro fertilization of plum. Acta Hort. 359: 269-276.
LLOYD G.,MCCOWN B.1980. Commerially-feasible micropropagation of mountain laurel Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture. Proc. Int. Plant. Prop. Soc. 30: 421-427.
MARTINEZ-GÓMEZ P,SOZZI G.O.,SÁNCHEZ-PÉREZ R.,RUBIO M.,GRADZIEL T.M. 2003. New approaches to Prunus tree crop breeding. Food, Agriculture & Environmental 1(1):
52-63.
MONNIER M.1976. Culture in vitro de l’embryon immature de Capsella bursa-pastoris.
Moench. Rev.Cytol. Biol. Vég. 39: 1-120.
MURASHIGE T.,SKOOG F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.
PINTO A.C., BYRNE D.H., ROGERS S.M.D. 1993. Influence of ovule perforation, plant
E. Dziedzic, W. Lech, M. Małodobry 112
growth regulators and L-glutamine on in vitro growth of immature peach embryos. In Vitro Cell Dev. Biol. 29: 55-58.
PINTO A.C.,ROGERS S.M.D.,BYRNE D.H.1994. Growth of immature peach embryos in response to media, ovule support method and ovule perforation. HortScience 29(9):
1081-1083.
RIZZO M., BASSI D.,BYRNE D.,PORTER K. 1998. Growth of immature peach [Prunus persica (L.) Batsch.] embryos on different media Acta Hort. 465: 141-147.
RUBIO-CABETAS M.J.,SOCIAS R. 1996. Fertilization assessment and postzygotic develop-ment in several ontra- and interspecific Prunus hybrids. Euphytica 90: 325-330.
SCHMIDT H.,KETZEL A. 1993. Regeneration of adventitious shoots in vitro cherries IV.
Adventitious shoot regeneration of cotyledons and embryo rescue as tools in cherry breeding. Gartenbauwissenschaft 58(2): 64-67.
SCOZZOLI A.,PASINI D. 1992. Effects of different media constituents on the development of peach embryos cultured in vitro. Acta Hort 300: 265-268.
SRIVASTAV M.,SINGH S.K.,ARORA R.L.,KRISZNA B. 2004. Embryo culture studies in sub-tropical peach (Prunus persica Batsch.). Acta Hort 662: 297-301.
STEWART J.M.,HSU C.L.1977. In ovule embryo culture and seedling development of cotton (Gossypium hirsutum L). Planta 137: 113-117.
TRONCOSO A.,CANTOS M.,LINAN J.,TRONCOSO J.,RAPOPORT F. 2003. In vitro development and germination of immature olive embryos. J. Hort. Sci. and Biotech. 78(5): 728-733.
WHITE P.R.1943. A handbook of plant tissue. Cattel. Lancaster.
Słowa kluczowe: zapłodnienie in vitro, Prunus, kultury zaląŜków, zarodek
Streszczenie
Stosowane metody biotechnologiczne, polegające na transformacji tkanek roślinnych wzbudzają często liczne kontrowersje, dlatego poszukuje się obecnie alternatywnych, mniej inwazyjnych, sposobów prowadzenia badań z roślinami. Jedną z waŜnych metod, która stwarza potencjalnie duŜe moŜliwości naukowych zastosowań, jest zapłodnienie in vitro. Badania dotyczące tego zagadnienia są prowadzone głównie na roślinach takich jak tytoń, czy kukurydza. Natomiast niewiele jest doniesień dotyczących doświadczeń wykonywanych na roślinach drzewiastych. W omawianej prezentacji podjęto próbę przedstawienia obecnego stanu wiedzy na temat zapłodnienia in vitro gatunków z rodzaju Prunus. Badania dotyczące poznania tego zagadnienia prowadzone są dwutorowo. Z jednej strony opracowywane są metody doprowadzające do zapłodnienia zaląŜków na poŜywkach, na których umieszczane są zarówno zaląŜki jak i ziarna pyłku, a takŜe podejmowane są próby uzyskania pierwszych podziałów zygoty i prazarodka. Z drugiej strony pobierane są niedojrzałe zarodki powstające po zapyleniu i zapłodnieniu w warunkach naturalnych, które są następnie prowadzone w kulturach sterylnych w celu uzyskania z nich prawidłowo rozwiniętych roślin. Zarodki pobierane są w róŜnych etapach rozwoju, od kilku do 60 dni po kwitnieniu.
Przedstawiono dotychczasowe osiągnięcia w badaniach, z uwzględnieniem stoso-wanych poŜywek, warunków kultury i etapów rozwoju, jaki osiągnięto dla posz-czególnych gatunków z rodzaju Prunus.
STAN BADAŃ NAD ZAPŁODNIENIEM in vitro ... 113 CURRENT INVESTIGATIONS ON FERTILIZATION
in vitro OF Prunus SPECIES
Ewa Dziedzic, Włodzimierz Lech, Monika Małodobry
Department of Pomology and Apiculture, Agricultural University, Kraków
Key words: in vitro fertilization, Prunus, ovule culture, embryo
Summary
Biotechnology methods relying on transformation works cause much controversy, therefore presently less invasive methods concerning the studies on plants are investigated. One of the important method which make possible the practical applications is the fertilization in vitro. There are a few reports presenting the investigations performed on the fruit trees. In this paper the current achievement concerning fertilization in vitro of Prunus species is presented. The studies covering that problem are conducted in two ways. On one hand, the methods of ovule fertilization on the media and obtaining the first zygote and proembryo divisions are elaborated. On the other hand the immature embryos are isolated after pollination of flowers in natural conditions and cultivated on the artificial media up to the stage of correctly developed plants. The embryos are taken at different times after flowering, from several days up to
Biotechnology methods relying on transformation works cause much controversy, therefore presently less invasive methods concerning the studies on plants are investigated. One of the important method which make possible the practical applications is the fertilization in vitro. There are a few reports presenting the investigations performed on the fruit trees. In this paper the current achievement concerning fertilization in vitro of Prunus species is presented. The studies covering that problem are conducted in two ways. On one hand, the methods of ovule fertilization on the media and obtaining the first zygote and proembryo divisions are elaborated. On the other hand the immature embryos are isolated after pollination of flowers in natural conditions and cultivated on the artificial media up to the stage of correctly developed plants. The embryos are taken at different times after flowering, from several days up to