TULIPANA (Tulipa gesneriana L.)
Małgorzata Maślanka, Anna Bach
Katedra Roślin Ozdobnych, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie
Wstęp
Tulipany naleŜą do waŜnych gospodarczo ozdobnych roślin cebulowych. Swoją popularność zawdzięczają walorom dekoracyjnym oraz wszechstronnością zastosowania. Rośliny te odznaczają się niskim współczynnikiem rozmnaŜania, dlatego wciąŜ poszukuje się nowych, wydajnych metod ich otrzymywania, a tym samym obniŜenia kosztów uprawy. Tradycyjny wegetatywny sposób rozmnaŜania tulipanów to bardzo powolny proces, a wprowadzenie nowej odmiany do produkcji zajmuje 25 lat [DE HERTOGH, LE NARD 1993]. Kultury in vitro poprzez procesy organogenezy oraz somatycznej embriogenezy stwarzają moŜliwość znacznego skrócenia tego okresu [GUDE, DIJKEMA 1997]. Opracowane do tej pory metody somatycznej embriogenezy nie pozwalają na pozyskiwanie zarodków o zadowalającej jakości [BACH, PTAK 2001].
Celem niniejszej pracy było określenie wpływu kwasu abscysynowego (ABA) na dojrzewanie i konwersję somatycznych zarodków tulipana. ABA znany jest nie tylko jako inhibitor wzrostu, ale takŜe jako związek wspomagający dojrzewanie zarodków somatycznych [WILHELM i in. 2004].
Materiał i metody
Doświadczenie przeprowadzono w Katedrze Roślin Ozdobnych Akademii Rolniczej w Krakowie. W tym celu wykorzystano cebule tulipanów odmian: Apeldoorn (naleŜących do grupy mieszańców Darwina) i Rosy Wing (pojedyncze późne) o obwodzie 11-12 cm. Cebule poddano 12-tygodniowemu chłodzeniu. Zdezynfekowane słupki, wyizolowane z cebul, cięto na 1-2 mm eksplantaty i wykładano na poŜywki do szalek Petriego. PoŜywki inicjalne zawierały sole mineralne według MURASHIGE i SKOOG
[1962], 3% sacharozy oraz regulatory wzrostu: Picloram (25 i 50 µM) i BAP (0,25-10 µM). Kultury trzymano w ciemności, w 20°C i pasaŜowano na świeŜe poŜywki w odstępach 4-tygodniowych. Tworzący się Ŝółty, globularny kalus przenoszono następnie na poŜywkę ze zmniejszoną zawartością regulatorów wzrostu, w celu formowania i rozwijania zarodków somatycznych, zgodnie z procedurą według BACH i PTAK [2002].
Somatyczne zarodki w fazie statudium torpedy, długości 5-10 mm, odejmowano od kalusa embriogenicznego i umieszczano po 5 na poŜywce wzbogaconej o ABA w stęŜeniu 10 µM. Po tygodniu przenoszono je na poŜywkę zawierającą regulatory: NAA
M. Maślanka, A. Bach 156
i BAP (w stęŜeniu 0,25 i 2,5 µM) w celu dojrzewania i konwersji do roślin. W drugim, dziesięciotygodniowym etapie doświadczenia część zarodków hodowano w ciemności a część na świetle. Po tygodniu działania ABA zmierzono masę i długość zarodków oraz oceniono zawartość suchej masy. Po 11 tygodniach od inicjacji doświadczenia obserwacje wzbogacono jeszcze o stopień deformacji zarodków oraz o ich przeŜywalność. Doświadczenie wykonano w pięciu powtórzeniach.
Wyniki doświadczenia opracowano statystycznie za pomocą metody analizy wariancji, zaleŜnie od danych, w układzie dwu- lub trzyczynnikowym, z zastosowaniem testu Duncana. Oceny istotności róŜnic pomiędzy średnimi dokonano przy uwzględnieniu poziomu istotności α = 0,05.
Wyniki i dyskusja
Wykazano, Ŝe ABA hamował przyrost świeŜej masy zarodków oraz ich długość w porównaniu z kontrolą. Jego wpływ dało się zauwaŜyć zarówno po tygodniu kultury, jak i po kolejnych dziesięciu tygodniach, podczas których zachowanie się zarodków było następstwem jego wcześniejszego działania (tab. 1-4). Po tygodniu kultury pod wpływem ABA, odnotowano istotnie mniejszy przyrost świeŜej masy zarodków (tab.
1).
Tabela 1; Table 1 Wpływ ABA na przyrost świeŜej masy zarodków
(współczynnik przyrostu świeŜej masy GV*) Effect of ABA on the weight of the embryos
(weight increase factor the GV*)
Odmiana; Cultivar PoŜywka; Medium Ciemność; Darkness
Apeldoorn 5 µM Pic, 1 µM BAP 0,474 c**
5 µM Pic, 1 µM BAP, 10 µM ABA 0,12 a
Rosy Wing 5 µM Pic, 1 µM BAP 0,242 b
5 µM Pic, 1 µM BAP, 10 µM ABA 0,11 a
*GV = mk-mp/mp (mk - masa końcowa; final weight; mp - masa początkowa; initial weight)
** średnie oznaczone tymi samymi literami nie róŜnią się istotnie na poziomie istotności α = 0,05; means marked with the same letter do not differ significantly at the significance level α = 0.05
Przyrost długości zarodków pod wpływem ABA był takŜe mniejszy, choć róŜnice między średnimi z doświadczenia i kontroli nie były istotne, a w przypadku zarodków odmiany Apeldoorn tygodniowe działanie ABA przyczyniło się nawet do nieznacznego wzrostu ich długości (tab. 2, 4). WILSON i in. [1999] uzyskał podobne wyniki u zarodków Picea abies. Wykazał on, Ŝe długość zarodków poddanych działaniu ABA maleje wraz ze wzrostem jego stęŜenia w poŜywce. Pod wpływem egzogennego ABA stwierdzono równieŜ słabszy wzrost eksplantatów słupkowych tulipana [KAWA, SANIEWSKI 1986].
Biorąc pod uwagę czynnik światła, istotnie mniejszy przyrost długości oraz świeŜej masy zarodków odnotowano w ciemności, ale tylko w przypadku odmiany Apeldoorn, zarówno u zarodków poddanych wcześniej działaniu ABA jak i kontrolnych. U odm.
Rosy Wing światło nie miało wpływu na omawiane cechy (tab. 3, 4).
Tabela 2; Table 2 Wpływ ABA na przyrost długości zarodków (mm)
Effect of ABA on length of the embryos (mm)
WPŁYW KWASU ABSCYSYNOWEGO ORAZ ŚWIATŁA NA WZROST I ROZWÓJ ... 157
Odmiana; Cultivar PoŜywka; Medium Ciemność; Darkness
Apeldoorn 5 µM Pic, 1 µM BAP 0,48 ab
5 µM Pic, 1 µM BAP, 10 µM ABA 0,68 b
Rosy Wing 5 µM Pic, 1 µM BAP 0,56 ab
5 µM Pic, 1 µM BAP, 10 µM ABA 0,1 a Objaśnienia: patrz tabela 1; Explanations: see Table 1
Tabela 3; Table 3 Następczy wpływ ABA na przyrost świeŜej masy zarodków
(współczynnik przyrostu świeŜej masy GV*) Post-treatment effect of ABA on weight of the embryos
(weight increase factor the GV*)
Odmiana; Cultivar PoŜywka; Medium Ciemność; Darkness Światło; Light
Apeldoorn 2,5 µM BAP, 0,25 µM NAA 4,042 b 16,158 d
2,5 µM BAP, 0,25 µM NAA*** 3,492 ab 9,804 c
Rosy Wing 2,5 µM BAP, 0,25 µM NAA 2,268 ab 2,204 ab
2,5 µM BAP, 0,25 µM NAA*** 0,956 a 0,708 a
*GV = mk-mp/mp (mk - masa końcowa; final weight; mp - masa początkowa; initial weight)
** średnie oznaczone tymi samymi literami nie róŜnią się istotnie na poziomie istotności α = 0,05; means marked with the same letter do not differ significantly at the significance level α = 0.05
*** po wcześniejszym zastosowaniu ABA; after ABA treatment
Tabela 4; Table 4 Następczy wpływ ABA na przyrost długości zarodków (mm)
Post-treatment effect of ABA on the length of the embryos (mm)
Odmiana; Cultivar PoŜywka; Medium Ciemność; Darkness Światło; Light
Apeldoorn 2,5 µM BAP, 0,25 µM NAA 8,96 bc 15,76 d
2,5 µM BAP, 0,25 µM NAA 5,44 ab 11,94 cd
Rosy Wing 2,5 µM BAP, 0,25 µM NAA 4,78 ab 4,36 ab
2,5 µM BAP, o,25 µM NAA 1,44 a 1,6 a
Objaśnienia: patrz tabela 3; Explanations: see Table 3
Ze względu na identyczność warunków doświadczenia, którym poddano obie odmiany tulipanów moŜna przypuszczać, Ŝe reakcja zarodków na światło zaleŜy od genotypu rośliny. Zawartość suchej masy zarodków wskazała, Ŝe pod wpływem ABA pobierały one mniej wody z poŜywki. ABA zmniejszał więc uwodnienie zarodków. Mniejsza ilość wody w zarodkach zwiększa ich tolerancję na suszę i daje moŜliwość ich długo-trwałego mroŜenia. Zjawisko to przedstawione zostało przez SHIOTA i in. [1999]
w doświadczeniu z zarodkami somatycznymi marchwii, których desykacja była moŜliwa po zastosowaniu egzogennego ABA. Według WILHELM i in. [2004], zawartość wody w komórkach jest waŜnym czynnikiem wpływającym na proces dojrzewania, a tym samym produkcję wysokiej jakości zarodków somatycznych dębu. Do większego uwodnienia zarodków przyczyniło się natomiast światło, ale tylko w przypadku odmiany Apeldoorn. Pod wpływem światła stwierdzono takŜe większy procent zdeformowanych zarodków (maksymalnie o 48%), z wyjątkiem zarodków odmiany Rosy Wing, dla których mniej korzystna w tym przypadku była ciemność (tab. 5).
M. Maślanka, A. Bach 158
Według WILHELM i in. [2004], ABA zapobiega formowaniu nienormalnych struktur zarodka. W naszym doświadczeniu natomiast ABA nie wpłynął istotnie na deformacje zarodków obu odmian (tab. 5). Pod wpływem światła wszystkie zarodki Apeldoorn uległy zazielenieniu. W przypadku odm. Rosy Wing wybarwiło się zaledwie 28%
zarodków po zastosowaniu ABA i 62% w kontroli. VEISSEIRE i in. [1994] sugeruje hamujący wpływ ABA na zazielenienie „torped” Hevea brasiliensis. Stwierdzenia tego nie moŜna jednak odnieść do zarodków odmiany Apeldoorn. Być moŜe róŜnice między odmianami wynikają z ich przynaleŜności do innych grup tulipanów. Odmiana Rosy Wing, naleŜąca do tulipanów pojedynczych późnych, później rozpoczyna wegetację w porównaniu z odmianą Apeldoorn.
Tabela 5; Table 5 Następczy wpływ ABA na stopień deformacji zarodków (%)
Post-treatment effect of ABA on the malformation of embryos (%)
Odmiana; Cultivar PoŜywka; Medium Ciemność; Darkness Światło; Light
Apeldoorn 2,5 µM BAP, 0,25 µM NAA 40 ab 60 bc
2,5 µM BAP, 0,25 µM NAA 20 a 68 c
Rosy Wing 2,5 µM BAP, 0,25 µM NAA 40 ab 55 bc
2,5 µM BAP, 0,25 µM NAA 56 bc 36 ab
Po 11 tygodniach kultury stwierdzono najmniejszą przeŜywalność kontrolnych zarodków odm. Rosy Wing umieszczonych na świetle, kształtującą się na poziomie 64%. Zarodki tej odmiany w duŜym stopniu uległy nekrozie. PrzeŜywalność pozostałych zarodków, niezaleŜnie od zastosowanego czynnika, nie róŜniła się między sobą istotnie (tab. 6).
Tabela 6; Table 6 Następczy wpływ ABA na przeŜywalność zarodków (%)
Post-treatment effect of ABA on the survival of embryos (%)
Odmiana; Cultivar PoŜywka; Medium Ciemność; Darkness Światło; Light
Apeldoorn 2,5 µM BAP, 0,25 µM NAA 100 b 100 b
2,5 µM BAP, 0,25 µM NAA 100 b 92 b
Rosy Wing 2,5 µM BAP, 0,25 µM NAA 88 b 64 a
2,5 µM BAP, 0,25 µM NAA 100 b 100 b
Objaśnienia patrz tabela 3; Explanations see Table 3
W doświadczeniu zaobserwowano takŜe, Ŝe 40% zarodków odmiany Apeldoorn tworzy pędy, które w przypadku odm. Rosy Wing pojawiły się zaledwie u 4%
zarodków.
W tych samych warunkach odnotowano istotne róŜnice w zachowaniu się zarodków obu odmian, co oznaczałoby, Ŝe stopień reakcji somatycznych zarodków na ABA zaleŜy takŜe od ich genotypu.
O jakości zarodków somatycznych decydują nie tylko cechy morfologiczne ale takŜe zawartość wody w komórkach i relacje między ABA a poziomem proliny, wpływające na ich dojrzewanie [WILHELM i in. 2004], dlatego teŜ niezbędne będzie wykonanie podobnych analiz odnośnie badanych zarodków.
Wnioski
WPŁYW KWASU ABSCYSYNOWEGO ORAZ ŚWIATŁA NA WZROST I ROZWÓJ ... 159 1. Kwas abscysynowy w kulturach in vitro zmniejsza przyrost świeŜej masy
so-matycznych zarodków tulipanów.
2. Kwas abscysynowy zmniejsza uwodnienie zarodków.
3. Zdolność syntezy chlorofilu oraz tworzenia pędów przez somatyczne zarodki tulipanów zaleŜy od ich genotypu.
Literatura
BACH A., PTAK A. 2001. Somatic embryogenesis and plant regeneration from ovaries of Tulipa gesneriana L. in vitro cultures. Acta Hort. 560: 391-394.
BACH A., PTAK A. 2002. Nowa metoda mikrorozmnaŜania tulipana (Tulipa gesneriana L.) z tkanek zaląŜni. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 483: 13-19.
DE HERTOGH A., LE NARD M. 1993. The physiology of flower bulbs. Elsevier, Amster-dam-London-New York-Tokyo: 624 ss.
GUDE H., DIJKEMA M.H.G.E. 1997. Somatic embryogenesis in tulip. Acta Hort. 430:
275-300.
KAWA L., SANIEWSKI M. 1986. The effect of gibberellic acid and abscisic acid on tulip pistil growth in vitro. Acta Hort. 177: 129-134.
MURASHIGE T., SKOOG F. 1962. A revised medium on the growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15: 473-497.
SHIOTA H., TACHIBANA K., WATABE K., KAMADA H. 1999. Successful long-term preserva-tion of abscisic-acid-treated and desiccated carrot somatic embryos. Plant Cell Reports 18: 749-753.
VEISSEIRE P., LINOSSIER L., COUDRET A. 1994. Effect of abscisic acid and cytokinins on the development of somatic embryos in Hevea brasiliensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 39: 219-223.
WILHELM E., PREWEIN CH., VAGNER M. 2004. Water status and physiological parameters in relation to oak somatic embryo quality and germination ability. COST 843: 37-38.
Abstracts. Quality Enhancement of Plant Production through Tissue Culture. Saanen, Switzerland 2004.
WILSON G., HUNTER CH., MOYLAN E. 1999. Effect of abscisic acid on maturation and growth of somatic embryos of Picea abies. Abstracts of the Sixth Annual Meeting of the Working Group. Czech Republic 1999, COST 822: 32-33.
Słowa kluczowe: tulipan, somatyczna embriogeneza, somatyczne zarodki, kwas abscysynowy
Streszczenie
Somatyczne zarodki tulipana odmian Apeldoorn i Rosy Wing, w stadium torpedy, poddano tygodniowemu działaniu kwasu abscysynowego. Większość zarodków na obecność ABA w poŜywce zareagowała mniejszym przyrostem długości (o 24-82%
w zaleŜności od warunków kultury) oraz mniejszym przyrostem świeŜej masy (o 14-75%) w porównaniu z kontrolą. Sucha masa zarodków wskazuje, Ŝe pod wpływem ABA pobierały one mniej wody z poŜywki. Światło przyczyniło się do większego
M. Maślanka, A. Bach 160
uwodnienia zarodków (zarówno z kontroli jak i po ABA) ale tylko w przypadku odmiany Apeldoorn. Na świetle, zielone zarodki odmiany Apeldoorn wykazały blisko dwukrotnie większy przyrost długości oraz trzy- i czterokrotnie większy przyrost świeŜej masy, w porównaniu z ciemnością, co stanowi istotną róŜnicę. RóŜnic takich nie odnotowano u odm. Rosy Wing. Pod wpływem światła stwierdzono równieŜ deformacje większości zarodków (maksymalnie o 48%). Ponadto na świetle odnotowano najmniejszą przeŜywalność kontrolnych zarodków odm. Rosy Wing, kształtującą się na poziomie 64%. Po 11 tygodniach od załoŜenia doświadczenia, zaobserwowano tworzenie pędów, głównie przez zarodki odmiany Apeldoorn. Zarodki somatyczne odmiany Rosy Wing charakteryzują się mniejszą zdolnością tworzenia pędów i syntezy chlorofilu oraz mniejszą Ŝywotnością w porównaniu z zarodkami odmiany Apeldoorn.
EFFECT OF ABSCISIC ACID AND LIGHT ON THE GROWTH AND DEVELOPMENT OF TULIP (Tulipa gesneriana L.)
SOMATIC EMBRYOS
Małgorzata Maślanka, Anna Bach
Department of Ornamental Plants, Agricultural University, Kraków
Key words: tulip, somatic embryogenesis, somatic embryos, abscisic acid
Summary
Somatic embryos of tulip, cvs Apeldoorn and Rosy Wing at the torpedo stage were treated with abscissic acid for one week. The growth regulator contained in the medium had an influence on the majority of embryos. Their length was much lower (about 24-82% depending on the culture conditions) in comparison with the control.
Moreover, their weigth was also lower (about 14-75%) in comparison with non-treated ABA embryos. Under the influence of ABA, the embryos did uptake so much water from the medium, which was indicated by the dry weight. In case of cv. Apeldoorn, the light enhanced the hydration of embryos, both ABA treated and non-treated ones. In light, the green embryos increased nearly twice in length and three to four times in weight than the embryos from darkness. It is a significant difference. Such differences were not noticed in the case of cv. Rosy Wing. Under the influence of light, the majority of embryos increased their malformation (max. 48%). What is more, in the same culture condition, the viability was the lowest in the case of non-treated ABA cv. Rosy Wings embryos. This survival rate was at the level of 64%. After 11 weeks of in vitro culture first shoots appeared. Most of these shoots came from cv. Apeldoorn. Somatic embryos of cv. Rosy Wing in comparison with embryos of cv. Apeldoorn showed a lower ability of forming shoots, chlorophyll synthesis and the lower viability.
Mgr inŜ. Małgorzata Maślanka Katedra Roślin Ozdobnych
Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja Al. 29 Listopada 54
31-425 KRAKÓW
e-mail: maslankam@ogr.ar.krakow.pl
ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 163-168