Hanna Kruczkowska, Helena Pawłowska, Barbara Skucińska
Katedra Hodowli Roślin i Nasiennictwa, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie
Wstęp
Owies zwyczajny (Avena sativa L.) naleŜy do zbóŜ mniej opracowanych w kul-turze in vitro ze względu na jego niewielkie znaczenie ekonomiczne i mało zachęcające wyniki dotychczasowych badań. Coraz szersze wykorzystanie haploidów w hodowli jęczmienia, pszenicy czy pszenŜyta spowodowało ostatnio wzrost zainteresowania równieŜ gatunkami i genotypami zbóŜ o niskiej wydajności androgenezy i poszukiwanie czynników kultury stymulujących indukcję i regenerację haploidów.
Pierwsze próby haploidyzacji owsa podjęto w kulturze pylników przeszło 25 lat temu w USA i Kanadzie [CHUNG 1980 - cyt. za RINES i in. 1997; RINES,MCCOY 1980 - cyt. za RINES i in. 1997], a 10 lat później zastosowano w tym celu technikę krzyŜowań oddalonych [RINES, DAHLEEN 1990], najczęściej przez zapylanie pyłkiem kukurydzy.
Uzyskana w krzyŜowaniach liczba haploidalnych roślin owsa jest jednak bardzo niska, i nie zawsze wszystkie chromosomy kukurydzy ulegają eliminacji, co ogranicza przydatność tej metody dla celów hodowlanych [RINES i in. 1997; SIDHU i in. 2006]. Do tej pory nie opisano udanej androgenezy z izolowanych mikrospor owsa, a w kulturze pylników u większości badanych genotypów powstawał jedynie kalus lub nieliczne zarodki niezdolne do regeneracji roślin. W literaturze jest tylko kilka doniesień o regeneracji roślin w kulturze pylników uprawnych form owsa. Autorzy tych prac otrzymywali najczęściej od kilku do kilkunastu roślin z wielu tysięcy pylników wyłoŜonych na poŜywkę [RINES 1983; SUN i in. 1991 - cyt. za RINES i in. 1997; KIVIHARJU, TAURIAINEN 1999; KIVIHARJU i in. 2000].
Ostatnio fińskim badaczom udało się znacznie zwiększyć wydajność androgenezy u owsa zwyczajnego. U czterech badanych odmian i mieszańca odmianowego uzyskali od 2 do 30 zielonych roślin na 100 pylników wyłoŜonych na poŜywkę [KIVIHARJU i in.
2005]. Pozytywne rezultaty osiągnięte w kulturze pylników owsa w ośrodku fińskim są wynikiem bardzo intensywnych prac prowadzonych w ostatnim dziesięcioleciu.
Korzystne dla powstawania zarodków i późniejszej regeneracji zielonych roślin okazało się przede wszystkim zastosowanie stresu podwyŜszonej temperatury [KIVIHARJU, PEHU
1998], uŜycie poŜywki W14 o korzystniejszym składzie i proporcji związków azotowych w porównaniu z poŜywką MS [KIVIHARJU i in. 2000], zastąpienie sacharozy wolno rozkładającą się maltozą [KIVIHARJU i in. 1998], podwyŜszenie zawartości 2,4-D i obniŜenie poziomu cytokininy - BAP lub kinetyny [KIVIHARJU i in. 2000, 2005], a takŜe wprowadzenie poŜywki dwufazowej z Ficollem w fazie płynnej [KIVIHARJU i in. 1998].
Znaczący postęp uzyskano jednak dopiero po zastosowaniu wysokiego stęŜenia
H. Kruczkowska, H. Pawłowska, B. Skucińska 138
mioinozytolu oraz zwiększeniu poziomu etylenu w kulturze przez dodanie do poŜywki etefonu. Dzięki uŜyciu L-cysteiny udało się równieŜ ograniczyć brunatnienie i przedwczesne zamieranie pylników, które stanowi powaŜny problem w kulturach in vitro owsa [KIVIHARJU i in. 2005].
Jak wynika z dotychczasowych badań zdolność owsa do androgenezy jest szczególnie zaleŜna od genotypu. Celem tej pracy było sprawdzenie reakcji kilku polskich odmian owsa na indukcję androgenezy. Równocześnie badano wpływ niektórych składników poŜywki zastosowanych przez KIVIHARJU i in. [2005], z eliminacją najbardziej kosztownego jej składnika - Ficollu i próbą zwiększenia wydajności androgenezy przez zwielokrotnienie stęŜenia jonów miedzi. Sprawdzano równieŜ potrzebę wprowadzenia dodatkowego źródła etylenu - etefonu.
Materiał i metody
Badania przeprowadzono na pięciu polskich odmianach owsa: Chwat, Celer, Cekin, Cwał (oplewione) i Polar (nieoplewiona). Materiał pobrano z pola doświadczalnego Katedry Hodowli Roślin i Nasiennictwa AR w Krakowie, a odmianę Chwat dodatkowo z pomieszczenia wegetacyjnego o regulowanych warunkach wzrostu (temperatura 17°C, fotoperiod dzień/noc 16/8 godz., natęŜenie promieniowania 280 µmol⋅m-2⋅s-1). Odcinano źdźbła, gdy wierzchołek wiechy był wyczuwalny w pochwie liściowej, powyŜej nasady drugiego liścia, i umieszczano je w kolbach z wodą w temperaturze 4°C. Po 6-7 dniach chłodzenia wiechy ukryte w pochwie liściowej dezynfekowano przez spryskanie 70% etanolem. Do kultury izolowano pylniki z dolnych kwiatów kłoska, zawierające mikrospory w stadium średnio- i późnojednojądrowym. Stadium rozwojowe mikrospor oznaczano na preparatach gniecionych, barwionych acetokarminem. Ze względu na bardzo zróŜnicowany rozwój kwiatów w wiesze, przy wyborze pylników kierowano się cechami skorelowanymi z wybranym stadium, czyli długością pylników i ich wybarwieniem.
Pylniki wykładano do płytek Petriego (o średnicy 3 cm) zawierających 2,5 ml poŜywki. W doświadczeniu zastosowano poŜywkę indukującą zalecaną przez KIVIHARJU
i in. [2005], bez Ficollu, zawierającą sole mineralne i witaminy jak w poŜywce W14
[OUYANG 1989 - cyt. za KIVIHARJU i in. 2005], 50 mg⋅dm-3 cysteiny, 500 mg⋅dm-3 inozytolu, 5 mg⋅dm-3 2,4-D, 0,5 mg⋅dm-3 BA, 10% maltozy oraz 0,3% Phytagelu. Wprowadzono 4 kombinacje tej poŜywki róŜniące się zawartością etefonu i soli miedzi: A - 20 mg⋅dm-3 etefonu, 0,025 mg⋅dm-3 CuSO4, B - bez etefonu, 0,025 mg⋅dm-3 CuSO4 , AC - 20 mg⋅dm-3 etefonu, 2,5 mg⋅dm-3 CuSO4, BC - bez etefonu, 2,5 mg⋅dm-3 CuSO4. Odmianę Chwat badano we wszystkich kombinacjach poŜywki, pozostałe odmiany tylko na poŜywkach AC i BC. W kaŜdej kombinacji wyłoŜono 360 pylników z odmiany, powtórzenie stanowiło 6 płytek po 20 pylników. Z kaŜdej wiechy rozkładano równomiernie pylniki na wszystkie poŜywki. Płytki umieszczono na 5 dni w temperaturze 32°C (traktowanie wstępne), a następnie przeniesiono je do temperatury 25°C. Kulturę prowadzono w ciemności przez 8 tygodni. Powstałe w tym okresie zarodki i kalusy, większe od 1,5 mm, przenoszono na poŜywkę regeneracyjną zawierającą sole i witaminy jak w poŜywce W14, z dodatkiem 2 mg⋅dm-3 NAA, 0,5 mg⋅dm-3 KN, 2% sacharozy, 0,3% Phytagelu [KIVIHARJU i in. 2005]. Regenerację prowadzono przez 4 tygodnie na świetle o natęŜeniu promieniowania ok. 100 µmol⋅m-2⋅s-1 ,przy fotoperiodzie dzień/noc 16/8 godz. i temperaturze 25-26°C.
Po zakończeniu doświadczenia zestawiono dla odmian i kombinacji udział
PRÓBA INDUKCJI ANDROGENEZY U POLSKICH ODMIAN OWSA 139 reagujących pylników, liczbę zarodków i kalusów przeniesionych na poŜywkę re-generacyjną, liczbę roślin zielonych i albinotycznych. Przeprowadzono analizę zmienności oraz obliczono błąd standardowy dla liczby zarodków i kalusów.
Wyniki i dyskusja
U dwóch odmian (Celer i Polar) nie obserwowano Ŝadnej reakcji na indukcję androgenezy, u pozostałych odmian (Chwat, Cekin, Cwał) na pylnikach utworzyły się zarodki i kalusy (tab. 1). Udział pylników reagujących na indukcję androgenezy był niewielki i wahał się od 0,6% (Cekin) do 15,2% (Chwat), reszta pylników zamarła.
Zarodki i kalusy większe niŜ 1,5 mm, przeniesione na poŜywkę regeneracyjną równieŜ zamierały, a tylko nieliczne z odmian Chwat i Cwał zregenerowały rośliny. Nie zauwaŜono większych róŜnic pomiędzy materiałem odmiany Chwat pochodzącym z pomieszczenia wegetacyjnego i zebranym z pola. Niewielka skuteczność zastosowanych kombinacji i duŜa zmienność wyników uniemoŜliwiły wykazanie istotnych róŜnic pomiędzy badanymi czynnikami i pozwoliły tylko na wskazanie pewnych tendencji rzutujących na tok dalszych badań.
Tabela 1; Table 1 Indukcja androgenezy i regeneracja roślin w kulturze pylników owsa
(w przeliczeniu na 100 pylników)
Induction of androgenesis and plant regeneration in anther culture of oat (per 100 anthers)
* rośliny mateczne z pomieszczenia wegetacyjnego; donor plants from growth room
Z dwóch odmian, które regenerowały pędy, lepsze wyniki pod względem wszystkich badanych parametrów otrzymano u odmiany Chwat. W badaniach (niepublikowanych) nad androgenezą u owsa, prowadzonych w IHAR Radzików, równieŜ wskazano na tę odmianę jako wyróŜniającą się zdolnością do regeneracji.
Mimo, Ŝe poŜywki indukujące nie zawierały Ficollu, liczba zregenerowanych roślin była porównywalna z wynikami uzyskanymi przez autorów fińskich dla słabiej regenerujących genotypów. Pozytywny wpływ Ficollu na rozwój zarodków i rege-nerację roślin został potwierdzony w wielu pracach nad androgenezą zbóŜ, począwszy od badań KAO [1981]. Ze względu na wysoką cenę tego składnika Ŝelującego poŜywkę jego szerokie zastosowanie w hodowli byłoby jednak zbyt kosztowne. Z tego powodu w
H. Kruczkowska, H. Pawłowska, B. Skucińska 140
doświadczeniu zastąpiono go Phytagelem. Wyniki osiągnięte u odmian Chwat i Cwał pozwalają przypuszczać, Ŝe przy uŜyciu Ficollu wydajność androgenezy mogłaby być wyŜsza.
Innym składnikiem poŜywki indukującej, który zwiększa udział reagujących pylników oraz zregenerowanych roślin, moŜe być siarczan miedzi uŜyty w zwielo-krotnionym stęŜeniu w porównaniu z ilością standardową stosowaną w poŜywkach [WOJNAROWIEZ i in. 2002]. U badanych odmian w kombinacji ze stukrotnie zwiększonym stęŜeniem CuSO4, lecz bez etefonu (kombinacja BC), obserwowano wyraźnie większą zdolność do tworzenia zarodków i kalusów niŜ z dodatkiem etefonu (kombinacja AC).
Etefon dodany do poŜywki indukującej przy standardowym poziomie miedzi wpłynął równieŜ pozytywnie na powstanie tych struktur (kombinacja A). Regeneracja roślin u odmiany Chwat wystąpiła tylko w kombinacjach bez egzogennego etylenu (kombinacja B i BC). Taka reakcja na dodatkowe źródło etylenu moŜe znaleźć wyjaśnienie w literaturze, która wskazuje na genotypowe róŜnice w wytwarzaniu endogennego etylenu przez pylniki oraz odmienne zapotrzebowanie tego hormonu w procesie indukcji androgenezy i procesie regeneracji roślin [PUA 1999].
Wnioski
1. W kulturze pylników pięciu polskich odmian owsa (Chwat, Celer, Cekin, Cwał, Polar) uzyskano regenerację u odmian Chwat i Cwał: 1,1-3,6 roślin ogółem, w tym 1,1-2,3 roślin zielonych w przeliczeniu na 100 pylników wyłoŜonych na poŜywkę (w poŜywce indukującej nie stosowano Ficollu).
2. Zaobserwowano, Ŝe stukrotne zwiększenie stęŜenia CuSO4 w poŜywce indu-kującej lub dodatek etefonu przyczyniły się do zwiększenia liczby zarodków i kalusów utworzonych na pylnikach. Równoczesne zastosowanie obu tych składników było mniej skuteczne.
3. U odmiany Chwat bardziej korzystne dla regeneracji roślin były kombinacje poŜywki indukującej bez etefonu.
Literatura
KAO K.N. 1981. Plant formation from barley anther cultures with Ficoll media.
Z. Pflanzenphysiol. 103: 437-443.
KIVIHARJU E.,PEHU E.1998.The effect of cold and heat pretreatments on anther culture response of Avena sativa and Avena sterilis. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 54: 97-104.
KIVIHARJU E.,PUOLIMATKA M.,SAASTAMOINEN M.,HOVINEN S.,PEHU E. 1998. The effect of genotype on anther culture response of cultivated and wild oats. Agric. Food Sci. Finl.
7: 409-422.
KIVIHARJU E.,TAURIAINEN A. 1999. 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and kinetin in anther culture of cultivated and wild oats and their interspecific crosses : plant regeneration from Avena sativa L. Plant Cell Rep. 18: 582-588.
KIVIHARJU E., PUOLIMATKA M.,SAASTAMOINEN M., PEHU E. 2000. Extension of anther culture to several genotypes of cultivated oats. Plant Cell Rep. 19: 674-679.
KIVIHARJU E.,MOISANDER S.,LAURILA J. 2005. Improved green plant regeneration rates from oat anther culture and the agronomic performance of some DH lines. Plant Cell
PRÓBA INDUKCJI ANDROGENEZY U POLSKICH ODMIAN OWSA 141 Tiss. Organ Cult. 81: 1-9.
PUA E.C. 1999. Morphogenesis in cell and tissue cultures: role of ethylene and poly-amines, w: Morphogenesis in Plant Tissue Cultures. Soh W.Y., Bhojwani S.S. (Red.).
Kluwer, Dordrecht: 255-303.
RINES H.W. 1983. Oat anther culture: genotype effects on callus initiation and the production of a haploid plant. Crop Sci. 23: 268-272.
RINES H.W.,DAHLEEN L.S. 1990. Haploid oat plants produced by application of maize pollen to emasculated oat florets. Crop Sci. 30: 1073-1078.
RINES H.W.,RIERA-LIZARAZU O.,NUNEZ V.M.,DAVIS D.W.,PHILLIPS R.L. 1997. Oat haplo-ids from anther culture and from wide hybridizations, w: In vitro Haploid Production in Higher Plants. Jain SM., Sopory SK., Veilleux RE. (Red.), Kluwer, Dordrecht 4:
205-221.
SIDHU P.K.,HOWES N.K.,AUNG T.,ZWER P.K.,DAVIES P.A.2006. Factors affecting oat haploid production following oat x maize hybridization. Plant Breed. 125: 243-247.
WOJNAROWIEZ G.,JACQUARD C.,DEVAUX P.,SANGWAN R.S.,CLÉMENT C. 2002. Influence of copper sulfate on anther culture in barley (Hordeum vulgare L.). Plant Sci. 162:
843-847.
Słowa kluczowe: owies zwyczajny, androgeneza, stęŜenie siarczanu miedzi, etylen
Streszczenie
W kulturze pylników badano zdolność do androgenezy pięciu polskich odmian owsa. Zastosowano poŜywki zalecane przez KIVIHARJU i in. [2005], lecz bez Ficollu.
Wprowadzono róŜne kombinacje poŜywek róŜniące się stęŜeniem siarczanu miedzi i etefonu. Regenerację uzyskano u odmian Chwat i Cwał: 1,1-3,6 roślin ogółem na 100 pylników wyłoŜonych na poŜywkę. Stukrotne zwiększenie stęŜenia CuSO4 lub dodatek etefonu w poŜywce indukującej sprzyjały zwiększeniu liczby zarodków i kalusów.
Równoczesne wprowadzenie etefonu i podwyŜszenie stęŜenia miedzi w poŜywce było mniej korzystne. Odmiana Chwat, która okazała większą wydajność androgenezy niŜ odmiana Cwał, regenerowała rośliny jeśli pylniki wyłoŜono na poŜywki bez etefonu.
ATTEMPT AT INDUCTION OF ANDROGENESIS IN THE POLISH OAT CULTIVARS
Hanna Kruczkowska, Helena Pawłowska, Barbara Skucińska Department of Plant Breeding and Seed Science,
Agricultural University, Kraków
Key words: oat, androgenesis, concentration of copper sulfate, ethylene
Summary
The experiment tested the potential for androgenesis in five Polish oat cultivars in anther culture. The various combinations, used in the experiment on the medium recommended by KIVIHARJU et al. [2005], though without Ficoll, varied in their concentration of copper sulfate and Ethephon. Regeneration was obtained in Chwat and Cwał cvs: 1.1-3.6 plants per 100 anthers. A hundredfold increase in CuSO4
concentration or an addition of Ethephon into the induction medium resulted in an increased number of embryos and calli. However, an addition of Ethephon accompanied
H. Kruczkowska, H. Pawłowska, B. Skucińska 142
by a simultaneous increase in the copper concentration in the medium was less favorable. Chwat cv. which showed greater efficiency of androgenesis than Cwał cv., regenerated plants better when its anthers were placed on the medium without Ethephon.
Dr inŜ. Hanna Kruczkowska
Katedra Hodowli Roślin i Nasiennictwa Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja ul. Łobzowska 24
31-140 KRAKÓW
e-mail: rkhrn@ar.krakow.pl
ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 143-154