Artyku³ przegl¹dowy Review
Ujemny wp³yw podwy¿szonej temperatury otocze-nia na p³odnoæ krów jest zjawiskiem znanym i opisy-wanym w wielu publikacjach (9, 22). W warunkach klimatu subtropikalnego i tropikalnego, a tak¿e latem w strefie klimatu umiarkowanego wywo³uje przejcio-wy spadek p³odnoci, przejawiaj¹cy siê obni¿eniem zap³adnialnoci oraz zaburzeniami w sekrecji hormo-nów p³ciowych, dojrzewania pêcherzyków jajniko-wych i przebiegu cyklu rujowego (22). U krów nara-¿onych na stres cieplny dochodzi do pogorszenia ja-koci oocytów oraz wzrostu miertelnoci zarodkowej (3, 4, 27). Nale¿y podkreliæ jednak, ¿e porównywa-nie procesów zachodz¹cych w komórkach zarodków rozwijaj¹cych siê in vivo oraz w warunkach laborato-ryjnych jest niemo¿liwe. Obserwuje siê znacz¹ce ró¿-nice w ekspresji genów wa¿nych w procesie rozwoju w zarodkach hodowanych in vitro oraz in vivo (12). Porównano grupê szeciu markerów genowych zaan-ga¿owanych w kompakcjê, metabolizm, podatnoci na stres oraz przetwarzanie RNA w blastocystach bydlê-cych rozwijaj¹bydlê-cych siê in vivo oraz produkowanych in vitro. Ekspresja trzech sporód badanych genów (trans-portera glukozy 1, desmocollin 2 oraz plakophilin) by³a
znacz¹co wy¿sza w zarodkach rozwijaj¹cych siê in vivo w porównaniu do zarodków hodowanych in vitro. Po-dobnych ró¿nic nie stwierdzono natomiast w ekspre-sji genów bia³ka szoku cieplnego 70.1, E-kadheryny oraz poly(A) polimerazy (12). Rozwój zarodków in vitro, w okrelonych po¿ywkach i warunkach inkuba-cji przebiega odmiennie od analogicznych procesów zachodz¹cych w jajowodach i macicy. Pe³ne odtwo-rzenie specyficznego rodowiska macicznego oraz subtelnych biochemicznych i fizjologicznych zale¿no-ci istniej¹cych pomiêdzy organizmem matki a zarod-kiem w warunkach stresu cieplnego nie zawsze jest mo¿liwe. W niniejszym opracowaniu przedstawiono skutki stresu cieplnego w odniesieniu do zarodków byd³a hodowanych in vitro i eksponowanych na dzia-³anie podwy¿szonej temperatury otoczenia we wczes-nym okresie przedimplantacyjwczes-nym.
Stadium rozwoju zarodków
Przedimplantacyjny rozwój zarodkowy jest dyna-micznym procesem, który obejmuje takie etapy, jak: namna¿anie komórek, ich ró¿nicowanie i mieræ. Pro-cesy te s¹ cile regulowane przez sygna³y
wymienia-Wp³yw stresu cieplnego na rozwój zarodków byd³a
we wczesnym okresie przedimplantacyjnym
RENATA W£ODARCZYK, MAGDALENA IZDEBSKA*, ALINA GRZANKA*, JÊDRZEJ M. JAKOWSKI
Katedra Weterynarii Rolniczej Wydzia³u Hodowli i Biologii Zwierz¹t AR, ul. Wojska Polskiego 52, 60-625 Poznañ *Katedra i Zak³ad Histopatologii i Embriologii Collegium Medicum UMK w Toruniu, ul. Kar³owicza 24, 85-092 Bydgoszcz
W³odarczyk R., Izdebska M., Grzanka A., Jakowski J. M.
Influence of heat shock on the development of bovine embryos in the early preimplantation stage
Summary
This article presents the results of thermal stress on embryos exposed to heat stress during early preim-plantation stage. The repercussions of heat stress are, among others, uterus hyperthermia, the inhibition of embryonic development and death. It seems that embryos are most frequently endangered or damaged by heat shock the early stage of development (2-4 cells), because during this period most embrionic genes remain inactive. Embryos at a more advanced stage of development are able to activate a range of mechanisms in order to protect embryonic cells against the destructive influence of heat shock. One of the defensive reactions activated by embryos is the increased secretion of antioxidants and HSP; i.e. Heat Shock Proteins. Apoptosis is a natural process activated as a response to heat shock, eliminating the damaged cells. Consequently, some embryos at the stage of ³ 8 cells have developed mechanisms responsible for activating apoptosis, thus damaged cells go under selective and controlled elimination with omitting general necrosis. If damage con-cern a small number of embryonic cells, the embryo is still able to continue its development. Subtle biological mechanisms responsible for embryonic reaction to heat shock are still unknown. There are attempts to explain a part of them of through laboratory research.
kiem (3, 27). Brak jest jednak bli¿szych danych od-nonie do ekspresji genu odpowiedzialnego za sekre-cjê interferonu t oraz wytwarzania tej cytokiny przez kilkukomórkowe zarodki nara¿one na stres cieplny w warunkach in vitro.
Ekspozycja zarodków na dzia³anie podwy¿szonej temperatury jest tak¿e bodcem do powstawania w ich komórkach HSP 70 bia³ek szoku gor¹ca (heat shock protein). Proteina ta posiada przypuszczalnie zdolnoæ odbudowy uszkodzonych bia³ek oraz ochrony RNA zarodków podczas stresu termicznego (6). Wed³ug wiêkszoci autorów, zarodek nabywa zdolnoæ do syn-tezy HSP 70 dopiero w momencie aktywacji w³asne-go genomu, przy czym najwczeniej obecnoæ tew³asne-go bia³ka obserwowano w zarodkach 8-komórkowych (6). Zarodki we wczesnym stadium rozwoju (2-4 komór-kowym) s¹ najbardziej nara¿one na uszkodzenia spo-wodowane podwy¿szon¹ temperatur¹, poniewa¿ w tym okresie wiêkszoæ genów zarodkowych pozostaje nie-aktywna (6, 13, 17, 20). Z innych badañ wynika jed-nak, ¿e pod wp³ywem ostrego stresu cieplnego (42°C) do syntezy HSP 70 zdolne s¹ równie¿ zarodki 2-ko-mórkowe (4, 6). Ekspozycja dwukomórkowych zarod-ków na temperaturê 41°C spowodowa³a równie¿ wzrost odsetka skondensowanych j¹der z 4,5% do 21,8% odpowiednio w grupie kontrolnej i dowiad-czalnej. Stres cieplny spowodowa³ zablokowanie woju zarodków w stadium 8-komórkowym. Swój roz-wój do stadium > 8-komórkowego kontynuowa³o je-dynie 25% zarodków w porównaniu do 67% zarod-ków w grupie kontrolnej. O zablokowaniu rozwoju dopiero w stadium 8-komórkowym mo¿e wiadczyæ wysoki odsetek zarodków rozwijaj¹cych siê do stadium 2- oraz 4-komórkowego (odpowiednio w grupie kon-trolnej i dowiadczalnej 100% i 98% oraz 98% i 96%) (23).
Rolê mechanizmu kontroli, którego celem jest eli-minacja uszkodzonych morfologicznie lub funkcjonal-nie komórek odgrywa we wczesnym stadium rozwoju zarodka apoptoza (2, 21). Zmiany apoptotyczne s¹ tak-¿e jednym z mierzalnych skutków ekspozycji zarod-ków na podwy¿szon¹ temperaturê. Najbardziej popu-larn¹ metod¹ wykrywania uszkodzeñ powsta³ych m.in. pod wp³ywem dzia³ania wysokiej temperatury w
za-rodkach jest TUNEL (TdT-mediated deoxyuridine tri-phosphate-biotin/digoxygenin nick end-labeling) (30). Rycina 1 ukazuje obraz z mikroskopu konfokalne-go przedstawiaj¹cy apoptozê w 7-dniowych zarodkach byd³a. Komórki martwe (apoptotyczne) daj¹ce pozy-tywny wynik reakcji TUNEL, zabarwiaj¹ siê na kolor zielony, natomiast komórki ¿ywe (proliferuj¹ce), bar-wione jodkiem propidyny przyjmuj¹ zabarwienie czer-wone (11, 16). Wynikiem reakcji TUNEL jest mikro-skopowy obraz zarodka z wyranie zaznaczonymi miejscami degeneracji.
Zarodki we wczesnym stadium rozwoju (2-4-komór-kowe), nie posiadaj¹ce jeszcze zdolnoci do akty-wacji mechanizmów apoptotycznych zamieraj¹ (21). Rycina 2 przedstawia zale¿noæ pomiêdzy stadium roz-woju zarodków eksponowanych na dzia³anie podwy¿-Ryc. 1. Obraz z mikroskopu konfokalnego przedstawiaj¹cy apoptozê w 7-dniowych zarodkach (10)
Objanienia: Chromatyna obszar wybarwiony na czerwono przy pomocy jodku propidyny (PI), zdegenerowane j¹dra apoptotycz-ne obszary wybarwioapoptotycz-ne na zielono (pozytywny wynik reakcji TUNEL); A morula z jednym skondensowanym j¹drem apop-totycznym; B morula z kilkunastoma j¹drami apoptotycznymi; C, D blastocysta z wieloma apoptotycznymi, skondensowany-mi i pofragmentowanyskondensowany-mi j¹draskondensowany-mi; E blastocysta z apoptotycz-nymi j¹drami tylko w wewnêtrznej masie komórek (Inter Cell Mass ICM); F blastocysta, na której lini¹ oddzielono ICM w celu u³atwienia liczenia j¹der
szonej temperatury a liczb¹ wszystkich komórek pra-wid³owych oraz liczb¹ komórek apoptotycznych, po-wsta³ych na skutek dzia³ania podwy¿szonej tempera-tury. Po 9-godzinnej ekspozycji zarodków w stadium 2- i 4-komórkowym na temperaturê 41°C obserwuje siê istotne zmniejszenie liczby komórek zarodka, jed-nak zjawisku temu nie towarzyszy wzrost liczby ko-mórek apoptotycznych (4, 5). Fakt ten wydaje siê wska-zywaæ, ¿e zamieranie zarodków we wczesnych sta-diach rozwoju w efekcie dzia³ania podwy¿szonej tem-peratury mo¿e mieæ charakter procesu nekrotycznego. Skutki dzia³ania stresu termicznego s¹ istotnie mniejsze w bardziej zaawansowanym stadium rozwo-ju zarodków. Jak wynika z niektórych badañ, ³ 8-ko-mórkowy zarodek posiada ju¿ dobrze wykszta³cone mechanizmy aktywacji apoptozy, w zwi¹zku z tym uszkodzone komórki ulegaj¹ selektywnej i kontrolo-wanej eliminacji, z pominiêciem przebiegaj¹cej w nie-kontrolowany sposób uogólnionej nekrozy. Jeli uszko-dzenie dotyczy niewielkiej liczby komórek zarodka, to jest on zdolny do kontynuacji swego rozwoju (17).
Wysokoæ temperatury i czas ekspozycji W wielu badaniach przedstawiano wp³yw ró¿nego czasu ekspozycji oraz wysokoci temperatury na roz-wój zarodków we wczesnym stadium przedimplanta-cyjnym (1, 4, 5, 21, 38). Modele dowiadczalne
obej-mowa³y ocenê rozwoju, w warunkach in vitro, zarod-ków nara¿onych na dzia³anie podwy¿szonej tempera-tury zarówno sta³ej, jak i zmiennej (5, 21, 25, 27, 28). W badaniach wp³ywu podwy¿szonej sta³ej tempe-ratury na rozwój zarodków w warunkach in vitro po-równywano trzy zakresy temperatur sta³ych: 38,5°C typow¹ dla ciep³oty wewnêtrznej byd³a, 41°C cha-rakterystyczn¹ dla ³agodnego stresu cieplnego oraz 43°C temperaturê tzw. ostrego stresu cieplnego (27). Po ekspozycji na dzia³anie temperatury 39°C i 41°C odsetek zarodków kontynuuj¹cych rozwój do stadium ³ 16-komórkowego znacznie siê zmniejszy³ i wyno-si³ odpowiednio 31,4% i 12,2% (5). Rycina 3 przed-stawia nasilenie apoptozy w 16-komórkowych zarod-kach byd³a eksponowanych na dzia³anie podwy¿szo-nej temperatury. Dziewiêciogodzinna ekspozycja 16--komórkowych zarodków na sta³¹ temperaturê 41°C oraz 42°C doprowadzi³a do wzrostu odsetka komórek apoptotycznych z 8,1% w kontrolnej grupie zarodków hodowanej w temp. 38,5°C do odpowiednio 16,0% oraz 17,3% (21).
Rycina 4 ilustruje zale¿noæ pomiêdzy d³ugoci¹ czasu ekspozycji na podwy¿szon¹ temperaturê a nasi-leniem apoptozy w 16-komórkowych zarodkach byd-³a. Reakcjê TUNEL przeprowadzono w 5. dniu po in-Ryc. 2. Zale¿noæ pomiêdzy stadium rozwoju zarodków
eks-ponowanych na dzia³anie podwy¿szonej temperatury a licz-b¹ wszystkich komórek prawid³owych oraz liczlicz-b¹ komórek apoptotycznych powsta³ych na skutek dzia³ania podwy¿szo-nej temperatury (20)
Objanienia: Grupa kontrolna zarodki hodowane w temperatu-rze 38,5°C; grupa eksperymentalna zarodki eksponowane na dzia-³anie podwy¿szonej temperatury (40-41°C).
Ryc. 3. Nasilenie apoptozy w 16-komórkowych zarodkach byd³a eksponowanych na dzia³anie podwy¿szonej tempera-tury (20)
Ryc. 4. Zale¿noæ pomiêdzy d³ugoci¹ czasu ekspozycji na podwy¿szon¹ temperaturê a nasileniem apoptozy w 16-ko-mórkowych zarodkach byd³a (20)
no zarodki z grupy eksperymentalnej wynosi³a pocz¹t-kowo 39,5°C, a nastêpnie podczas 8 godzin by³a stopniowo podwy¿szana o 0,19°C a¿ do osi¹gniêcia wartoci 41°C. Nastêpnie stopniowo j¹ obni¿ono i utrzymywano przez 12 godzin na poziomie 40,5°C. Hodowlê zakoñczono 12-godzin¹ inkubacj¹ w temp. 40°C. Ekspozycjê wed³ug identycznego schematu prze-prowadzono 2-krotnie, a nastêpnie zarodki umieszczo-no w temperaturze 39°C na 96 godzin. Odsetek zarod-ków, które rozwinê³y siê do stadium ³ 8-komórko-wego wyniós³ po 72 godzinach 2% w porównaniu do 28,4% zarodków osi¹gaj¹cych to samo stadium roz-woju w grupie kontrolnej. Po 144 godzinach hodowli odsetek zarodków, które rozwinê³y siê do stadium ³ 8-komórkowego wyniós³ w grupie dowiadczalnej 0,9% w porównaniu do 12,3% w grupie kontrolnej (28). Pod wp³ywem podwy¿szonej, temperatury do-chodzi³o równie¿ do zmian w ultrastrukturze i morfo-logii komórek zarodków (25).
Stê¿enie tlenu i CO2 w rodowisku hodowlanym W warunkach hodowli in vitro wzrost temperatury powoduje spadek stê¿enia CO2 oraz obni¿enie pH po-¿ywki hodowlanej (25). Pod wp³ywem podwy¿szonej temperatury podobne zmiany maj¹ tak¿e miejsce w ro-dowisku macicznym. W warunkach in vitro wzrost stê¿enia CO2 powoduje wzrost liczby prze¿ywaj¹cych i prawid³owo rozwijaj¹cych siê zarodków (27). Na prze¿ywalnoæ zarodków nara¿onych na stres cieplny w warunkach laboratoryjnych znacz¹co wp³ywa nie tylko stê¿enie CO2 ale tak¿e koncentracja tlenu (24). Przy 5% stê¿eniu tlenu w po¿ywce hodowlanej eks-pozycja zarodków na umiarkowany stres cieplny (38,5--41°C) powodowa³a mieræ 39,5% zarodków, podczas gdy zwiêkszenie zawartoci tlenu do 20,95% zmniej-sza³o odsetek zamieraj¹cych zarodków do 26,5% (24). W innych badaniach nie odnotowano znacz¹cego wp³y-wu stresu cieplnego na stê¿enie tlenu na zewn¹trz oraz wewn¹trz os³onki przejrzystej. Natomiast zu¿ycie tle-nu, obliczone na postawie ró¿nicy jego stê¿enia na zewn¹trz oraz wewn¹trz os³onki przejrzystej, zmala³o pod wp³ywem temperatury 41°C z 25,58% do 12,25% odpowiednio w grupie kontrolnej i dowiadczalnej (23).
Ró¿nice rasowe a wra¿liwoæ na stres termiczny Zagadnienie wra¿liwoci zarodków na stres termicz-ny jest znacznie mniej poznane w odniesieniu do ras byd³a wykazuj¹cych wysok¹ tolerancjê termiczn¹ (20). W celu porównania stopnia wra¿liwoci na stres ter-miczny zarodków krów o wysokiej oraz niskiej tole-rancji termicznej zarodki krów ras brahman, senepol, holstein i angus eksponowano na temperaturê 41°C przez 6 godzin. Zahamowanie rozwoju oraz zmniej-szenie ca³kowitej liczby komórek zarodków stwierdzo-no u wszystkich badanych ras. Rycina 5 przedstawia wp³yw stresu termicznego na rozwój zarodków byd³a w zale¿noci od rasy krów. Ujemny wp³yw podwy¿-szonej temperatury by³ znacznie wiêkszy w odniesie-niu do zarodków krów holstein i angus ni¿ brahman. Rozwój zarodków rasy senepol w warunkach hodowli in vitro by³ bardzo s³aby nawet w temperaturze 38,5°C, dlatego ocena skutków ekspozycji na podwy¿szon¹ temperaturê nie by³a mo¿liwa (20). Negatywne efekty ekspozycji na podwy¿szon¹ temperaturê (41°C przez 6 godzin) badano równie¿ w odniesieniu do zarodków ras brahman, romosinuano oraz angus (8). Najwiêk-sz¹ ró¿nicê pomiêdzy odsetkiem zarodków rozwijaj¹-cych siê do stadium bastocysty w grupach kontrolnej i eksperymentalnej zanotowano w przypadku krów rasy angus. Podczas hodowli w temperaturze 38,5° odse-tek ten wyniós³ 30,5%, natomiast po hodowli w tem-peraturze 41°C uzyskiwano jedynie 4,8% blastocyst. Najwy¿sz¹ opornoæ na dzia³anie podwy¿szonej tem-peratury wykaza³y zarodki krów rasy romosinuano. W wyniku hodowli zarodków > 8-komórkowych w temperaturze 38,5°C rozwój do stadium blastocys-ty konblastocys-tynuowa³o 27,5% zarodków, natomiast w tem-peraturze 41°C odsetek ten wyniós³ 17,8% (8). Praw-dopodobnie krowy ras hodowanych w klimacie gor¹-cym (brahman, senepol, romosinuano) posiadaj¹ gen kontroluj¹cy wra¿liwoæ komórek na stres termiczny, dziêki któremu ich zarodki wykazuj¹ naturalnie wy¿-sz¹ odpornoæ na dzia³anie podwy¿szonej temperatu-Ryc. 5. Wp³yw stresu termicznego na rozwój zarodków byd³a w zale¿noci od rasy krów (18)
ry (20). Podobnej zale¿noci nie stwierdzono w od-niesieniu do 2-4 komórkowych zarodków rasy brah-man, gdy¿ geny odpowiedzialne za termotolerancjê ulegaj¹ ekspresji najwczeniej w stadium 8-komórko-wym (14).
Wp³yw podwy¿szonej temperatury na cytoszkielet komórek zarodków
Kluczow¹ rolê w rozwoju zarodków oraz podzia-³ach ich komórek odgrywa cytoszkielet (26). Jest to kompleks w³ókien bia³kowych rozci¹gniêtych w cy-toplazmie, koordynuj¹cy jej strukturê oraz ruchy. Cy-toszkielet jest wysoce dynamiczn¹ struktur¹, która nadaje komórce formê trójwymiarow¹, kontroluje jej kszta³t, jak równie¿ przemieszczanie siê organelli i se-gregacjê chromosomów. Cytoszkielet zbudowany jest z trzech typów w³ókien bia³kowych, którymi s¹: mi-krofilamenty (zbudowane z aktyny), mikrotubule (zbu-dowane z tubuliny) oraz filamenty porednie. Elementy cytoszkieletu s¹ bardzo wra¿liwe na uszkodzenia spo-wodowane szokiem termicznym (26). W nielicznych badaniach oceniano wp³yw podwy¿szonej temperatu-ry na zmiany cytoszkieletu podczas mejozy zachodz¹-cej w oocytach oraz podczas zap³odnienia i formowa-nia zygoty. W oocytach nara¿onych na dzia³anie ³a-godnego stresu termicznego (40-41°C) zaobserwo-wano zahamowanie mejozy w stadium metafazy I, anafazy I lub telofazy I, podczas gdy oocyty grupy kontrolnej nie nara¿onej na stres cieplny znajdowa³y siê w fazie metafazy II. Oocyty z grupy eksperymen-talnej nie zosta³y zap³odnione, wzglêdnie nieprawid³o-wo przebiega³ proces formowania zygoty (26). Ryci-na 6 ilustruje anomalie kszta³tu oraz zmiany po³o¿e-nia organelli w komórkach zarodków zwi¹zane z uszkodzeniem struktur cytoszkieletu pod wp³ywem dzia³ania podwy¿szonej temperatury. Zmiany te i za-burzenia m.in. ruch organelli do centrum blastome-ru, powiêkszenie odleg³oci pomiêdzy b³onami j¹dro-wymi mo¿na obserwowaæ przy pomocy mikroskopu wietlnego lub elektronowego (25).
Zapobieganie uszkodzeniom zarodków w warunkach in vitro
Zdolnoæ do prze¿ycia zarodka nara¿onego na dzia-³anie stresu cieplnego zwiêksza indukowana termoto-lerancja (1, 10, 21). W odpowiedzi na podwy¿szon¹ temperaturê otoczenia komórki zarodka produkuj¹ zwiêkszon¹ iloæ bia³ek szoku gor¹ca (HSP Heat Shock Protein) oraz antyoksydantów (np. glutationu). Wydaje siê, ¿e ekspozycja zarodków na ³agodny stres cieplny (39-40°C) jest bodcem do wytworzenia sub-stancji uodparniaj¹cych komórki zarodka na dzia³anie póniejszego, ostrego szoku termicznego (6). W wa-runkach hodowli in vitro istnieje mo¿liwoæ ochrony komórek zarodka przed uszkodzeniami spowodowa-nymi podwy¿szon¹ temperatur¹ przez dodawanie do po¿ywki hodowlanej substancji ochronnych. Stres cieplny oddzia³uj¹cy na komórkach zarodków
powo-duje dysfunkcjê mitochondriów oraz aktywacjê enzy-mów odpowiedzialnych za powstawanie wolnych rod-ników. Rezultatem 6-godzinnej ekspozycji 2-komór-kowych zarodków bydlêcych na temperaturê 41°C by³ obrzêk mitochondriów spowodowany obni¿eniem po-tencja³u b³on tych organelli. W wyniku zaburzenia funkcji b³on mitochondrialnych w komórkach zarod-ków wzrasta³ poziom wapnia, a reaktywne formy tlenu powodowa³y otwarcie kana³ów b³onowych. Zachodzi³a równie¿ fosforylacja oksydacyjna blokuj¹ca syntezê ATP (adenosine triphosphate) w mitochondriach (23). Stwierdzono, ¿e dodanie antyoksydantów do po¿ywki hodowlanej neutralizuje wole rodniki i zapobiega uszkodzeniom zarodków (5, 10, 25). Nowsze badania nie potwierdzaj¹ jednak takiego dzia³ania antyoksy-dantów. Dodanie do po¿ywki hodowlanej 100 µM witaminy E nie spowodowa³o zmniejszenia odsetka uszkodzonych zarodków. Po 9-godzinnej ekspozycji na temperaturê 41°C rozwój zarodków do stadium blastocysty obni¿y³ siê z 51,2% do 3,4% w grupie kon-trolnej oraz z 54% do 5,2% w hodowli z dodatkiem Ryc. 6. Anomalie kszta³tu oraz zmiany po³o¿enia organelli w komórkach zarodków zwi¹zane z uszkodzeniem struktur cytoszkieletu pod wp³ywem dzia³ania podwy¿szonej tempe-ratury (24)
Objanienia: Preparaty ogl¹dane w mikroskopie wietlnym (zdjê-cia A, C, E) barwione przy u¿yciu b³êkitu toluidynowego oraz ogl¹dane w mikroskopie elektronowym (zdjêcia B, D, F). Zarod-ki by³y hodowane przez 6 godzin w temperaturze 38°C (A i B), 41,0°C (C i D) oraz 43°C (E i F). Strza³ki wskazuj¹ obszary cyto-plazmy pozbawione organelli. ZP zona pellucida, PVS prze-strzeñ periwitelinowa, N j¹dro, mv mikrow³ókna
temperaturê wywiera tak¿e rekombinowany bydlêcy hormon wzrostu GH (rbGH) (13). W celu wykaza-nia wp³ywu GH na czêstoæ wystêpowawykaza-nia apoptozy w zarodkach bydlêcych oceniono odsetek 8-dniowych zarodków, w których pojawi³a siê przynajmniej jedna komórka apoptotyczna. W przypadku hodowli prowa-dzonej bez dodatku GH odsetek ten wynosi³ 58%, na-tomiast w wyniku dodania GH do po¿ywki hodowla-nej apoptoza wyst¹pi³a w komórkach 21% zarodków (13). Jak wynika z przegl¹du pimiennictwa, negatyw-ny wp³yw wysokich temperatur na rozwój i prze¿y-walnoæ zarodków bydlêcych we wczesnym okresie przedimplantacyjnym jest niew¹tpliwy. Biologiczne mechanizmy odpowiedzialne za reakcjê zarodka na dzia³anie wysokiej temperatury nie zosta³y jednak w pe³ni poznane. Czêæ z nich próbuje siê obecnie wy-janiaæ w oparciu o badania przeprowadzane w wa-runkach laboratoryjnych.
Pimiennictwo
1.Al-Katanani Y. M., Paula-Lopes F. F., Hansen P. J.: Effect of season and exposure to heat stress on oocyte competence in Holstein cows. J. Dairy Sci. 2002, 85, 390-396.
2.Beere H. M., Green D. R.: Stress management-heat shock protein-70 and the regulation of apoptosis. Trends Cell. Biol. 2001, 11, 6-10.
3.Demmers K. J., Jabbour H. N., Deakin D. W., Flint A. P. F.: Production of interferon by red deer (Cervus elaphus) conceptuses and the effects of roIFN-t on the timing of luteolysis and the success of asynchronous embryo transfer. J. Reprod. Fertil. 2000, 118, 387-395.
4.Ealy A. D., Drost. M., Hansen P. J.: Developmental changes in embryonic resistance to adverse effects of maternal heat stress in cows. J. Dairy Sci. 1993, 76, 2899.
5.Ealy A. D., Lannett Howell J., Monterroso V. H., Adchiga C. F., Hansen P. J.: Development changes in sensitivity of bovine embryos to heat shock and use of antioxidants. J. Anim. Sci. 1995, 73, 1401-1407.
6.Edwards J. L., Hansen P. J.: Differential responses of bovine oocytes and preimplantation embryos to heat shock. Mol. Reprod. Dev. 1997, 46, 138--145.
7.Edwards J. L., King W. A., Kawarsky S. J., Ealy A. D.: Responsiveness of early embryos to environmental insults: potential protective roles of hsp70 and glutathione. Theriogenology 2001, 55, 209-223.
8.Hernández-Cerón J., Chase C. C., Hansen P. J.: Differences in heat toleran-ce between preimplantation embryos from Brahman, Romosinuano, and Angus breeds. J. Dairy Sci. 2004, 87, 53-58.
9.Jakowski J. M., Olechnowicz J., Urbaniak K.: Letnia ja³owoæ krów. Medy-cyna Wet. 2005, 61, 1323-1327.
10.Ju J. C., Parks J. E., Yang X.: Thermotolerance of IVM-derived bovine oocy-tes and embryos after short-term heat shock. Mol. Reprod. Dev. 1999, 53, 336-340.
11.Knijn H. M., Gjørret J. O., Vos P. L. A. M., Hendriksen P. J. M., Van der Weijden B. C., Maddox-HyttelP., Dieleman S. J.: Consequences of in vivo
17.Matwee C., Betts D. H., King W. A.: Apoptosis in the early bovine embryo. Zygote 2000, 8, 57-68.
18.Memili E., First N. L.: Zygotic and embryonic gene expression in cow: a review of timing and mechanisms of early gene expression as compared with other species. Zygote 2000, 8, 87-96.
19.Paula-Lopes F. F., Al-Katanani Y. M., Majewski A. C., McDowell L. R., Hansen P. J.: Manipulation of antioxidant status fails to improve fertility of lactating cows or survival of heat-shocked embryos. J. Dairy Sci. 2003, 86, 2343-2351.
20.Paula-Lopes F. F., Chase C. C., Al-Katanani Y. M., Krininger C. E., Rive-ra R. M., Tekin S., Majewski A. C., Ocon O. M., Olson T. A., Hansen P. J.: Genetic divergence in cellular resistance to heat shock in cattle: differences between breeds developed in temperate versus hot climates in responses of preimplantation embryos, reproductive tract tissues and lymphocytes to in-creased culture temperatures. Reproduction 2003, 125, 285-294.
21.Paula-Lopes F. F., Hansen P. J.: Heat shock-induced apoptosis in pre-implantation bovine embryos is a developmentally regulated phenomenon. Biol. Reprod. 2002, 66, 1169-1177.
22.Rensisa F. de, Scaramuzzi R. J.: Heat stress and seasonal effects on repro-duction in the dairy cow a review. Theriogenology 2003, 60, 1139-1151. 23.Rivera R. M., Dahlgren G. M., Castro e Paula L. A. de, Kennedy R. T.,
Hansen P. J.: Actions of thermal stress in two-cell bovine embryos: oxygen metabolism, glutathione and ATP content and the time- course of develop-ment. Reproduction 2004, 128, 33-42.
24.Rivera R. M, Hansen P. J.: Development of cultured bovine embryos after exposure to high temperatures in the physiological range. Reproduction 2001, 121, 107-115.
25.Rivera R. M., Kelley K. L., Erdos G. W., Hansen P. J.: Alterations in ultra-structural morphology of two-cell bovine embryos produced in vitro and in vivo following a physiologically relevant heat shock. Biol. Reprod. 2003, 69, 2068-2077.
26.Roth Z., Hansen P. J.: Disruption of nuclear maturation and rearrangement of cytoskeletal elements in bovine oocytes exposed to hest shock during ma-turation. Reproduction 2005, 129, 235-244.
27.Ryan D. P., Blakewood E. G., Lynn J. W., Munyakazi L., Godke R. A.: Effect of heat-stress on bovine embryo development in vitro. J. Anim. Sci. 1992, 70, 3490-3497.
28.Sugiyama S., McGowanb M., Kafic M., Philipsa N., Younga M.: Effects of increased ambient temperature on the development of in vitro derived bovi-ne zygotes. Theriogenology 2003, 60, 1039-1047.
29.Winkle L. J. van: Amino acid transport regulation and early embryo develop-ment. Biol. Reprod. 2001, 64, 1-12.
30.Zabel M. (red.): Immunocytochemia. PWN, Warszawa 1999, 218-225.
Adres autora: mgr Renata W³odarczyk, ul Sieradzka 16/4, 60-163 Poznañ; e-mail: renia.wlodarczyk@poczta.onet.pl
