ROCZNIKI GLEBOZNAW CZE T. X, Z. 1, W ARSZAW A 1961
OLGIERD NOWOSIELSKI
U PR O SZ C Z O N A M ETO DYK A O Z N A C Z A N IA M IKROELEM ENTÓW ZA POMOCĄ A S P E R G I L L U S N IG E R
Zakład Chemii Rolniczej SGGW—Warszawa Kierow nik — prof. dr M. Górski
WSTĘP
Na m ożliw ość oznaczania m ik roelem en tów za pom ocą A spergillu s ni-
g e r zw racano u w agę już w końcu m in ion ego i na początku b ieżącego
stu lecia (R a u l i n w 1869, B e r t r a n d w 1911 i in.). W latach tr zy d ziesty ch S t e i n b e r g opracow ał m eto d y oczyszczania p ożyw ek z m i k ro elem en tów oraz w ykazał, że są on e n iezb ęd ne do w zrostu A. niger. S m i t , M u l d e r i G e r r e t s e n w latach 1938— 1949 opracow ali skład p ożyw ek oraz m etod y k ę oznaczania m ik roelem en tów . M etodykę tę, a w szczególn ości sposoby oczyszczania p ożyw ek z m ik roelem en tów , u dosk on alili N i c h o l a s i F i e l d i n g [4]. P ew n e zm ian y w m etod yce w p row ad zili S t a p p (1953) oraz S c h e f f e r i w sp ółpracow n icy (1958). J e n s e n i H e n r i к s e n (1955— 1958) dają w yczerp u jący jej rys h i storyczn y.
M ulder, G erretsen, W elch er i B ecjw ith , J en sen i H enriksen, N icholas i w spółpracow nicy, N ow osielsk i oraz in n i stosow ali m etodę A. niger do oznaczania m ik roelem en tów nie tylk o w gleb ie, ale także w m ateriale roślin nym . N iejed n ok rotn ie stw ierd zon o na różnych m ateriałach, że m e todą A. niger u zysk u je się te sam e w y n ik i co i m etodam i ch em iczn ym i i sp ek traln ym i. M etodę tę m ożna b y uznać za now y typ m etod y an ali tyczn ej.
M etoda A. n iger odznacza się isto tn y m i zaletam i. D ostępn e form y m i k roelem en tó w m ożna nią oznaczać w p rost w badanym m ateriale, a w ięc w gleb ie, naw ozie czy roślin ie unikając ty m sam ym k łop o tliw eg o spo rządzania w yciągów . Inne form y m ik roelem en tó w łączn ie z ogólną ich zaw artością m ożna ozn aczyć m etodą A. n ig e r podobnie jak in n y m i m e todam i po odpow iednim spreparow aniu badanego m ateriału (w w y c ią gach, po spaleniu czy stop ien iu itp.). P ierw iastk i tow arzyszące w stę ż ę
-152 O. N ow osielski
niach sp otyk an ych w m ateriałach b iologiczn ych nie przeszkadzają
w oznaczeniach m etodą A. niger; unika się w ięc usuw ania p ierw iastk ów przeszkadzających, n iezbędnego przy in n ych m etodach *, a nieraz bardzo u ciążliw ego.
M etoda ta je st bardzo czuła; n iektóre pierw iastki, np. m olibden, m ożna nią oznaczyć w stężen iach w ielok rotn ie n iższych od tych, przy k tórych m ożna pracow ać n ajczu lszym i m etodam i fizyk och em iczn ym i; jak dotąd jest ona jed yn ą m etodą nadającą się do oznaczania śladow ych ilo ści m i k roelem en tów w enzym ach m ikroorganizm ów . P rzy dużej czu ło ści ch a rak teryzu je ją jedn ocześn ie dość duża dokładność; rzadko różnica m ię dzy rów n oległym i oznaczeniam i przekracza k ilk an aście procent.
O statnie badania G ó r s k i e g o i w sp ółpracow n ików w yk azu ją, że
ogólną zaw artość n iek tórych k ation ów w m a teria le roślin n ym m ożna ozn aczyć m etodą A. n ig e r w p rost w odw ażce bez uprzedniego spalania.
Trudnością w p osługiw aniu się tą m etodą w d otych czasow ym w y k o naniu M u ldera-N icholasa jest pracochłonność, w yn ikająca z jej b io lo gicz n ego charakteru. Dużo czasu i od pow iedn ich w arun k ów w ym aga o tr zy m an ie do k ażdorazow ego szczep ien ia św ieży ch zarodników (ze szczep u w rażliw ego na d any m ik roelem en t), sterylizacja p ożyw k i z badaną su b stan cją przed inkubacją i oczyszczan ie p ożyw ek z oznaczonych m ik ro ele m entów .
C elem tej pracy było poznanie m ożliw ości zm niejszen ia pracochłon n ości m etod y A. niger.
BADANIA WŁASNE
OTRZYMYWANIE ZARODNIKÓW DO SZC ZEPIEŃ
Na w stęp ie spraw dzano p rzydatność posiadanego szczepu do oznacza nia m ik roelem en tów (szczep ten sprow adzony przed k ilk u nastu la ty od S ek ery był stosow an y do ozn aczeń potasu i fosforu, a ostatn io także i m agnezu oraz azotu). Zarodniki grzyba w y sia n o na w y sterylizow an ym
ch leb ie i u zysk ane po 7— 10 dniach w zrostu now e zarodniki badano pod
w zg lęd em p rzyd atn ości do oznaczania Fe, Zn, Mn, Cu i Mo. W ty m celu szczep ion o n im i p ożyw k i zaw ierające w szystk ie p otrzebne dla A. n iger sk ład n ik i w stężen iu op tym aln ym , a badany m ik roelem en t w stężen iach w zrastających od śladów do op tym aln ych . Stosow ano pożyw k ę M ulder- N icholasa, zaw ierającą w litrze w od y redestylow an ej:
50 g sacharozy, 5 g K N O3, 0,6 g N aH2P 0 4, 0,6 g MgSC>4 7H20 ,
1 U suwania pierwiastków przeszkadzających unika się także w m etodzie atom o w ej spektroskopii absorpcyjnej, nad którą badania zostały jednak dopiero niedaw no rozpoczęte [1].
Oznaczanie m ikroelem entów metodą A. niger 153
oraz 3 m g FeCls 6H2O, 2 m g Z11SO4 ТЩО, 0,6 m g CUSO4 бН^О,
0,3 m g M11SO4 4H2O, 0,3 m g NaMoC>4 2H2O,
U żyw an o sacharozę M ercka oraz so le firm y B akers (analitical reagant); w od ę d estylow an o w k olu m n ie jon itow ej (am berlit M B-1), a n astęp n ie red estylow an o w szk le.
P oży w k ę w ilości 50 m l w lew an o do zlew ek ze szkła P y re x -U S A , d o dawano w zrastające ilości brakującego m ik roelem en tu , szczepiono ba
Rys. 1. W pływ Fe na wzrost A. niger. Średnia z 3 powtórzeń Błąd oznaczenia ± 0,58 jig
Influence of Fe on the growth of A. niger. Avernge of 3 replications S.D. ± 0,58 ng
d anym i zarodnikam i, w staw ian o do pom ieszczenia o tem p eratu rze 33— 35 °С i po 3 dniach w zrostu grzybn ię zbierano, suszono i w ażono. U zy
skane w y n ik i przedstaw iono w postaci k rzyw y ch (rys. 1— 5).
W kom binacjach bez dodatku jedn ego z m ik ro elem en tów grzyb nie rozw ijał się (— Fe, — Zn, — Mn) lu b rozw ijał się bardzo słabo (— Mo
z p lon em s. m. grzyb n i około 100 mg); tylk o w k om b in acji bez dodatku
m ied zi w zrost b ył stosunkow o duży, plon s. m. grzyb n i w y n o sił około
450 m g (rys. 6 i 7).
W raz ze w zrostem d aw k i w yłączon ego m ik roelem en tu plon grzybn i rósł osiągając przy stężen iach o p tym aln ych około 1100 m g. Jed n ocześnie w zrastała ilość zarodników . G rzybnie ser ii ze w zrastającym i daw kam i cynku już przy n ajm n iejszych stężen iach teg o pierw iastka m ia ły zarod n ik i koloru czarnego. G rzybnie serii ze w zrastającym i d aw kam i M n i Mo
154 O. Nowosielski
Rys. 2. W pływ Zn na wzrost A. niger. Średnia z w ielu powtórzeń * Influence of Zn on the growth of A. niger.
A verage of many replications *
Rys. 4. W pływ Cu na wzrost A. niger. Średnia z w ielu powtórzeń Influence of Cu on the growth of A. niger.
Average of m any replications
Rys. 3. W pływ Mn na wzrost. A. niger. Średnia z 5 powtórzeń
Influence of Mn on the growth of A. niger. A verage of 5 replications
Rys. 5. W pływ Mo na wzrost A. niger. Średnia z w ielu powtórzeń ** Influence of Mo on the growth of
A. niger ** * B łąd o zn a czen ia ±0,28 jig- S.D. = ±0,28 a g
Oznaczanie m ikroelem entów m etodą A. niger 155
przy m n iejszych stężen iach n ie zarodn ikow ały w ogóle, a przy w ięk szych p o k ryw a ły się zarodnikam i koloru białego, przechodzącego w raz ze w zro stem stężeń w czarny. G rzybnie na p ożyw ce ze w zrastającym i daw kam i Cu m ia ły przy n ajm n iejszych stężen iach zarodniki koloru białego, który w raz ze w zrostem stężeń przechodził w kolor jasnożółty, żółty, różne od cien ie brązow e, do zabarw ienia ciem noczarnego.
R eakcja badanego szczep u na w zrastające d aw ki p oszczególnych m i k roelem en tó w b yła podobna do reak cji szczep ów A. niger o p isyw an ych
Rys. 6. W pływ Zn na w zrost A. niger Influence of Zn on the grow th of A. niger
przez M uldera i N icholasa. P ozw ala ona na ilościow e ozn aczen ie Fe, Zn, Mn i Mo na podstaw ie plonu s. m. g rzyb n i oraz na jak ościow e lub „pół- ilościow e” ozn aczanie ty c h m ik roelem en tów oraz m ied zi na podstaw ie ilości i koloru zarodników . Stw ierdzono też, że jeden szczep A. niger m oże b yć stosow an y do oznaczania różnych m ik roelem en tów .
P rzygo to w an ie św ieżych zarodników do szczep ien ia je st kłop otliw e, postanow iono w ięc spraw dzić m ożliw ość dokonyw ania szczep ień w y su szo n y m i zarodnikam i. W ty m celu zebrano je w dużej ilości z w yrosłej
na ch leb ie grzybni, p rzem yw ano około 1 godz na sączku wodą red esty lo -
waną, po czy m w ysu szon o w tem p eratu rze pokojow ej i szczepiono nim i pożyw ki. Z arodniki n iezależn ie od czasu p rzechow yw ania w stan ie p o w ietrzn ie su ch ym (od k ilk u d n i do k ilk u lat) k iełk o w a ły i rozw ijały się n orm aln ie dając op tym aln e plony s. m. grzybn i (1100 mg) już po 2,5 dobach w zrostu w tem peraturze 35 °C.
STERYLNOSC WZROSTU
S terylizacja p ożyw k i w au tok law ie zapew nia w praw dzie w zrost w y łączn ie u żyw an eg o szczepu, je st jednak pracochłonna, a poza ty m m oże w prow adzić zm ian y w zaw artości d ostęp n ych m ik roelem en tów . Zam iast ste ry liz a cji zastosow ano p ożyw k ę zakw aszoną bądź kw asem taninow ym , bądź cy try n o w y m do p H 3 oraz znacznie krótszy ok res w zrostu niż
136 O. Now osielski
35 °С, a n ie 26 °С. W ty ch w arunkach n ie obserw ow ano zakłóceń w e w zroście grzyba ze stron y in n ych m ikroorganizm ów n aw et w ted y, k ied y
do p ożyw k i w prow adzono w ilgotn ą gleb ę w prost z pola (tabl. 1).
T a b l i c a 1 D o k ł a d n o ś ć o z n a c z a n i a c y n k u z a pomocą u p r o s z c z o n e j m e to d y A, n i g e r A c c u r a c y o f z i n c d e t e r m i n a t i o n s by s i m p l i f i e d A. n i g e r me th o d B ad a ny m a t e r i a ł - T e s t e d m a t e r i a l I l o é c b r a n a i o o z n a c z a n i a t j . dod aw an a do 50 ml p o ż y w k i P o r t i o n u s e d i n d e t e r m i n a t i o n i . e . a d d e d t o 50 ml o f n u t r . 80l . Z a w a r t o ś ć c y n k u w p r ó b c e Z i n c c o n t e n t i n s a m p l e mg b - a a b e z d o d a t k u Zn w i t h o u t 2n a d d i t i o n b z d o d a t k i e m i Aig Zn p r z e d o z n a c z a n i e m w i t h a d d i t i o n 1 Mg Zn b e f o r e d e t e r m i n a t i o n G l e b a b i e l . l e k k a - P o d s o l l i g h t l . o g 2 , 6 3 , 8 1 , 2 G l e b a b r u n . ś r e d . - Brown e a r t h medium 1 , 0 g 6 . 3 7 . 2 0 , 9 0 , 5 g 3 ,1 - -R e n d z l n a k r e d o w a 1 , 0 g в , 5 R e n d z i n a s o i l c r e t a c e o u s 0 , 5 g 4 . 4 5 . 2 0 , 8 T o r f n i e k i - L o w - m o o r - s o i l 0 , 1 g 1 . 9 2 , 6 0 , 7 0 , 2 g 3 , 7 - -Wodny r o z t w . a l k a l i c z n e g o s t o p u g l e b y 0 , 2 ml 2 , 0 4 , 0 1 , 2 n r 1 - 1 g g l e b y w 200 ml wody 0 , 4 ml 5 , 5 6 , 5 1 , 0 W a t e r s o l u t i o n o f / m e l t e d w i t h c a r b o n a t e s / s o i l N r . 1 - 1 g o f s o i l d i l u t e d i n 200 ml w a t e r Wodny r o z t w . p o p i o ł u s ło m y ż y t a - p o p i ó ł 1 ml 1 . 8 2 , 7 0 , 9 z 2 g pow. s . m. w 100 ml wody 2 ml 3 , 4 4 , 5 1.1 Ash f r o m 2 g o f a i r d r y r y e s t r a w d i l u t e d i n 100 ml w a t e r B ł ą d o z n a c z e n i a = ± 0 , 2 £ . E . = ± 0 . 2
OCZYSZCZANIE POŻYWKI Z MIKROELEMENTÓW
C zystość prod uk ow an ych do niedaw na soli, cukru oraz w od y d e sty lo w an ej była n iedostateczn a i d latego m usiano p ożyw k ę oczyszczać z ba danego m ik roelem en tu . O pracowano w ie le sp osobów oczyszczania (S tein berg 1939, N ich olas i F ield in g 1951, D onald i S w ab y 1954 i in.), w szy st k ie on e są pracochłonne, a n iektóre zaw odne. W tej p racy zajęto się po ch od zen iem zan ieczyszczeń , badając p oszczególne sk ład n ik i pożyw ki. W w y n ik u przeprow adzonych badań stw ierdzono, że m ożna dobrać tak i sposób d esty la cji w od y oraz so le o takiej czystości, że oczyszczanie p o
Oznaczanie m ikroelem entów metodą A. niger 157
OPIS UPROSZCZONEJ METODY
W ykonanie oznaczeń m etodą A. n ig e r po w prow adzeniu do niej w y żej om ów ion ych zm ian sta je się bardzo proste. Sporządza się p ożyw k ę z o d p ow iednio cz y sty ch so li i w ody, o sk ład zie podanym na str. 3. 50 m l tej p ożyw k i um ieszcza się w zlew kach o pojem ności 250— 400 m l, ze znaną ilością badanej su b stan cji (gleba, roślina, w yciągi), zaw ierającą ilość ozn aczanego m ik roelem en tu m niejszą od op tym aln ej dla A . n iger, szczep i su ch ym i zarodnikam i p rzygotow an ym i raz na d łu g i czas w sposób o p i san y na str. 5 i w sta w ia do p om ieszczen ia o tem peraturze 35 °C na 2,5 doby. Zawartość badanego m ik roelem en tu ocenia się ilościow o na pod staw ie p lonu s. m. grzyb n i lub „p ółilościow o” na p odstaw ie zarodniko w ania — w obu przypadkach przez porów nanie z w zorcem .
OZNACZANIE ŻELAZA I CYNKU
Ż elazo m ożna oznaczać w ilościach od 0,5 do 10 jig, cyn k w granicach od 0,1 do 10 |ig. S tosow an e daw ki będą w ięc zależały od zaw artości tych sk ład n ików w badanym m ateriale. W przypadku oznaczania d ostęp n ych form ty c h sk ład n ik ów w glebach p olsk ich odpow iednią odw ażką po w ietrzn ie su ch ej gleb y dla F e m oże być 2 g, dla Zn — l g .
O znaczeń m ożna d okonyw ać w zlew kach p yrex ow ych , jenajsk ich lub w zw y k ły ch szklankach. A by uniknąć oczyszczania, w ystarczy sporządzić p ożyw k ę z so li k rajow ych d.a. i czystej sacharozy (G liw ice) oraz w od y red estylow an ej w szkle; jako środka ham u jącego w zrost inn ych m ikro organ izm ów m ożna u żyć kw asu tan inow ego w ilości 5 g na litr lub kw asu
cytryn ow ego w ilości 10 g na litr.
J eśli w tych w arunkach czystości p lon s.m . grzybn i z k om binacji ze row ej (bez dodatku Zn czy Fe) je st w ysok i, tj. w y n o si przeszło 200— 300 m g, w ów czas n ależy ją oczyścić lub sporządzić p o żyw k ę z czystych soli (B aker’s reagent).
Spośród spraw dzonych sposobów oczyszczania sposób N ich olasa -F iel- dinga jest nienajprostszy, ale za to bardzo skuteczny. W m etod zie tej dziesięciok rotnie stężon ą p ożyw k ę doprow adza się za pom ocą kw asu sol
n ego do pH 5,5, um ieszcza w lejk u rozdzielczym , dodaje 5 m l 8-h y d ro-
k sy ch in o lin y na 500 m l pożyw ki i w ytrząsa w ciągu 1 m in. W rezu ltacie tw orzą się ch in olan y żelaza i cynku. N astęp n ie dodaje się 3-k rotnie re-
d estylow an ego ch loroform u i całość p onow nie w ytrząsa około 1 m in.
C hinolany rozpuszczają się w chloroform ie, a te n jako cięższy oddziela się od p ożyw k i opadając na dno. W arstw ę chloroform u z chinolanam i w yp u szcza się z lejk a i ponow nie d odaje chloroform u. O czyszczanie to pow tarza się k ilk a razy. R esztki chloroform u n a leży usunąć z p ożyw k i
158 O. Now osielski
za pom ocą red estylow an ego eteru w lejk u rozdzielczym . Po o czy szczen iu
m akropożyw ki dodaje się m ik rop ożyw k ę i całość rozcieńcza 10-k ro tn ie.
Ilości żelaza i cynku stw ierd zan e za pom ocą tej m etod y w gleb ie są zb liżon e do ilości tzw . d ostęp n ych form żelaza i cyn k u ek strahow an ych
z gleb y za pom ocą dithizonu [8] (tabl. 2).
T a b l l o a 2 Cynk d o s t ę p n y d l a A. n i g e r a cyn k w y c i ą g u z d i t h i z o n e m o z n a c z o n y k o l o r y m e t r y c z n i e Z i n o a v a i l a b l e t o A. n i g e r and z i n c e x t r a o t a b l e w i t h d i t h i z o n e and d e t e r m i n e d c o l o r i m e t r l c a l l y Z a w a r t o ś ć c y n k u - mg/ 1g g l e b y -Zn o o n t e n t X s o l i X Zwyżka plo nó w l u c e r n y pod wpływem 4 , 8 kg Z n / h a xx % R o d z a j g l e b y - S o i l t y p e pH н2о Metoda A. n i g e r A. n i g e r method Metod a o h e m i c z n a C h e m io a l me tho d i n c r e a s e o f a l f - a l f a c r o p c a u s e d by a p p l i c a t i o n o f Zn - 5 l b s / a c r e G l e b a b r u n . c i ę ż . - Brown he av y s o i l 7 , 7 0 , 5 0 , 3 3 40 G l e b a b r u n , p y ło w a ś r e d . Brown c l a y loam e a r t h 7 , 8 0 , 4 0 , 4 3 78 G l e b a b r u n . ś r e d . - Vanado c l a y 7 , 5 0 , 1 0 , 1 3
-X* ** - Dane o t r z y m a n e od d r L.A. Browna z U n i w e r s y t e t u w K a l i f o r n i , USA D at a o b t a i n e d f r o m d r L.A . Brown, U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a , USA
O ZNACZENIE M A N G A N U
M angan oznacza się tą m etodą w ilościach od 0,01 do 5,0 \ig. J eśli ozna cza się m angan dostępny, od czy n p ożyw k i n a leży doprow adzić do p H 7,5 [4, 5, 7] stosu jąc w przypadku gleb p olskich od w ażk i 100— 150 m ilig ra m ow e. D o ozn aczeń m anganu w w yciągach gleb o w y ch lub roślin ie sto su je się p ożyw k ę kw aśną (pH 2— 5). O znaczenia n ależy w yk on yw ać w szk le p erex o w y m lub jenajskim .
P ożyw k a sporządzona z sacharozy M erck-U SA oraz z soli firm y B aker (analitical reagant) i w od y red estylow an ej w szk le nie w ym aga o czy sz czania. M ożna także nie oczyszczać -pożywki sporządzonej z sacharozy k rajow ej i so li d.a1. (G liw ice), w ów czas jednak krzyw a w zorcow a rozpo
czyna się od plonu około 100— 200 mg.
Jeśli pożyw ka zaw iera w ięk sze ilości m anganu, n ależy go usunąć. Można tego dokonać m etodą N ich olasa-F ield in ga w sposób następujący: do 500 m l 10-krotnie stężon ej p ożyw k i dodaje się 10 g СаСОз + 5 g
Oznaczanie m ikroelem entów metodą A. niger 150
Na(HCC>3) + 5 g СаС12 i gotu je w au tok law ie w ciągu 45 m in u t przy
ciśn ien iu 1,5 atm; po ostudzeniu i odstaniu p łyn sączy się przez gęsty sączek (W athm an nr 42 lub 50).
D okładność oznaczeń m anganu dostęp n ego w g leb ie tą m etodą n ie została .dotąd ustalona, stw ierdzono natom iast, że w y n ik i jej w odnie sien iu do różnych w y c ią g ó w p okryw ają się z w y n ik am i in n y ch m etod
[5, 6, 9, 10].
OZNAC ZENIE M IEDZI I M OLIBDENU
M iedź oznacza się m etodą A niger w ilościach od 0,02 do 2,0 fig, m olib d en — w ilościach od 0,0001 do 0,5 fig. O dw ażki gleb polsk ich przy ozna
czaniu dostępnej m ied zi p o w in n y w y n o sić 100— 200 mg, p rzy oznaczaniu
m olib denu d ostępnego 100— 500 mg.
P o ży w k i do oznaczania m ied zi m ożna nie oczyszczać, jeśli sporządza się ją ze sk ład n ików o czy sto ści opisanej na str. 7.
N ajn iższy p lon su ch ej m asy grzybni, jak i zdołano osiągnąć w tej pra c y przy zastosow aniu n ajczystszy ch so li (B aker’s an alitical reagant), w od y red estylow an ej w w ysok iej k olu m n ie w ęgla ak tyw ow an ego, a na stęp n ie w k olu m n ie jon itow ej (am berlit M B-1) oraz szkła P y r e x w y n iósł około 400 m g przy p lon ie m ak sym aln ym 1200 m g. Pod obn y naj n iższy p lon osiągnięto przy p ożyw ce z m niej czysty ch składników , ale oczyszczonej (patrz niżej).
M iedź p rzyp u szczaln ie je st potrzebna n ie w początkow ym , lecz w póź n iejszy m ok resie w zrostu A . n ig e r. S tężen ie m ied zi w p ożyw ce d ecy d u je b ow iem o ilości i k olorze zarodników i d la teg o oznacza się ją w oparciu o tę zależność. P rzy odpow iednim w zorcu m ożna tą m etodą oznaczyć n ie tylk o m iedź dostępną w glebie, ale także ilościow o zaw artość m ie dzi w m ateriale roślin nym i w yciągach (prace M uldera N icholasa i in n ych [2] ).
Ilości m olibdenu, jakie m ożna ozn aczyć tą m etodą, są n iezw y k le m ałe. P ożyw k a sporządzona z sacharozy k rajow ej (G liw ice), w od y p odw ójnie d estylo w a n ej w szk le oraz so li B ak er’s analitical reagant lub so li k rajo w ych d.a. nie w ym aga oczyszczania; p lon suchej m asy grzy b n i w p ierw
szy m przypadku w y n o si w k om b in acji zerow ej około 100 m g, w dru
gim — 150 m g. W celu zaham ow ania w zrostu obcej m ik roflory dodaje się 10 g kw asu tan inow ego (G liw ice) na 1 1 pożyw ki.
J eśli zachodzi k onieczn ość oczyszczania, w ów czas m ożna stosow ać m e todę N ich olasa-F ield in ga; oczyszcza się nią jedn ocześn ie p ożyw k ę z m ie
dzi. W ty m celu do 500 m l 10-k rotn ie stężon ej m ik rop ożyw k i dodaje się
5 m l 20% roztw oru siarczanu m ied ziow ego, doprowadza się jej od czyn do
pH 2— 3 za pom ocą stężon ego kw asu soln ego i następ n ie p rzepłu ku je się
160 O. N ow osielski
w ciągu 15 m inut; tw orzy się w ów czas k o loid aln y siarczek M0S2, k tóry
w ytrąca się w obecności siarczanu m ied zi jako kolektora. P oży w k ę od staw ia się na 15 m inut, po czym sączy przez g ę sty sączek (W athm an — nr 15 lub 42). N adm iar siarkow odoru u su w a się przez p odgrzew anie i ciągłe m ieszanie.
DO K ŁA D N O ŚĆ METODY
Różnice m ięd zy p lon am i su ch ej m asy grzyb n i z ró w n oległych oznaczeń nie przekraczają 30 m g. R óżnice takie odczytane z k rzyw ych w zorcow ych
w częściach p odnoszących się (rys. 1— 5) odpow iadają w artościom :
± 0,5 у Fe (rys. 1) + 0,2 у Cu (rys. 4)
+ 0,2 у Zn (rys. 2) ± 0,0002 y Mo (rys. 5)
± 0,2 y M n (rys. 3)
Podane w artości ok reślają dokładność, z jaką oznacza się p oszczególne m ik roelem en ty, je śli stosu je się 50 m l pożyw ki. D okładność ta w yrażona w p rocęntach w y n o si około 5%. D la lep szego jej zilustrow ania podano
w ta b licy 1 w y n ik i oznaczeń cyn k u tą m etodą:
a) w prost w gleb ie (Zn dostępny),
b) w stopionej gleb ie z m ieszanin ą w ęg la n ó w sodu i potasu (Zn ogó łem ) i
c) w sp opielon ej roślin ie. Z liczb zam ieszczonych w ostatn iej k o lu m nie tej tab licy w yn ik a, że m etodą tą od najdu je się takie ilo ści składnika, jakie się doda do próbki, tj. do p ożyw k i (z dokładnością 5%). Na tej podstaw ie m ożna też przypuszczać, że inne sk ład n iki w prow adzane do pożyw k i wraz z b adanym i pierw iastkam i n ie m ają w ięk szego w p ływ u na w y n ik i oznaczeń. W p ływ taki m oże się jednak zaznaczyć, jeśli ilość bra nej do oznaczenia próbki jest na ty le duża, że m oże zm ienić odczyn po ży w k i lub jej skład w p ow ażn iejszym stopniu; n a leży w ów czas dopro w ad zić odczyn p ożyw k i do odczynu p ożyw k i w zorca w zględ n ie zm n iej szyć w ielk ość próbki.
S zczegółow e dane d otyczące dokładności m etody, jak rów nież w y n i ków p oróvrnania jej z m etodam i chem icznym i, zostaną ogłoszone w na
stępnej pracy.
WNIOSKI
1. Tego sam ego szczepu m ożna używ ać do oznaczania różnych m i kroelem en tów .
2. S zczep ień m ożna dokonać zarodnikam i, k tóre po p rzem yciu wodą
redestylow an ą m ożna p rzech ow yw ać w stanie p o w ietrzn ie su ch ym przez d łu g i ok res czasu (naw et parę lat).
Oznaczanie m ikroelem entów metodą A. niger 101
3. Z am iast sterylizow ać pożyw kę z badaną substancją w autoklaw ie dla dobrego w zrostu A. n iger w y starczy zakw asić ją do pH 2— 3 oraz hodow ać k u ltu rę w w yższej tem p eratu rze i w krótszym czasie.
4. M ożna dobrać sole i sacharozę o tak iej czysto ści oraz tak o czyścić wodę, że sporządzona z nich pożyw ka m oże nadaw ać się do oznaczania żelaza, cyn k u, m anganu, m ied zi i n aw et m olibdenu bez uprzedniego oczyszczania.
5. U proszczoną m etodą m ożna oznaczać dostępne dla A . niger m i k roelem en ty w prost w odw ażkach g leb o w ych oraz p rzyp u szczaln ie także ogólną zaw artość m ik roelem en tów w gleb ie, w yciągach g leb ow y ch i m a teriale roślinnym .
STRESZCZENIE
Zajęto się u proszczeniem m etod yk i oznaczania m ik roelem en tów za pom ocą A. niger ze w zględ u na liczn e jej zalety. S tw ierdzono, że:
1. Zarodniki jedn ego szczepu nadają się do oznaczania różnych m i k roelem en tów oraz że m ożna uprościć sposób szczepienia używ ając do tego zarodników p rzem ytych w odą red estylow an ą i n astęp n ie w y su szo nych. Zarodniki w tym stan ie m ożna p rzech ow yw ać n a w et kilka lat.
2. Dla d ostateczn ego a n aw et dobrego w zrostu A. niger i zm niejszenia konk u ren cji ze stron y inn ych m ikroorganizm ów podczas inkubacji, w y starczy zakw aszenie p ożyw k i do pH 2— 3, p odniesienie tem p eratu ry in kubacji do 33— 35 °C oraz skrócenie czasu jej trw ania do 2— 3 dni w m iejsce sterylizacji p ożyw k i z badaną substancją w autoklaw ie.
3. S tosując w odę d estylow an ą w k olu m n ie jonitow ej — am berlit MB-1 — lub podw ójnie redestylow an ą w szkle, sacharozę M erck-U SA oraz sole B aker’s-anal. reagant (lub też sacharozę i sole krajow e d. a. z G liw ic w przypadku oznaczania Fe, Zn i Mo), m ożna sporządzić po żyw kę nadającą się do oznaczania m ik roelem en tów bez uprzedniego oczyszczania.
W prow adzenie tych zm ian czy n i m etod ę znacznie prostszą, bardziej nadającą się do m asow ych oznaczeń oraz do oznaczania d ostęp n ych form m ik roelem en tów .
LITERATURA
[1] D a v i d D. J.: Determ ination of Zinc and other elem ents in plants by atomic absorption spectroscopy. The Analyst, 83, 1958, s. 655—661.
[2] H e n r i k s e n A., J e n s e n H. L.: Chemical and microbiological determina tions of copper in soil. Acta Agric. Scand., 8, 1958, s. 442—469.
[3] J e n s e n H. L., H e n r i k s e n A.: M icrobiological and chem ical determination of m agnesium in soil. Acta Agric. Scand., 5, 1955, s. 98—112.
162 O. Nowosielski
[4] N i c h o l a s D. J. D., F i e l d i n g A. H.: The use of Aspregillus niger (M) for determination of magnesium, zinc, copper, and m olybdenum available in soil to crop plants. J. Hort. Sei, 26, 1951, s. 125—147.
[5] N i с h o 1 a s D. J. D. : The use of fungi for determ ining trace m etals in biolo gical materials. The Analyst, 77, 1952, s. 629—642.
[6] N o w o s i e l s k i О.: Oznaczenia magnezu za pomocą uproszczonej metody Aspergillus niger. Roczn. Glebozn., t. IX, z. 1, 1960.
[7] N o w o s i e l s k i O., S e w e r y n T.: Oznaczanie manganu dostępnego za po mocą Aspergillus niger. Roczn. Glebozn., t. 7, s. 65— 95.
[8] N o w o s i e l s k i O., T r u o g E.: The use of sim pliefied Aspergillus niger method for determining trace elem ents in soil. Soil Sei. Soc. Amer. Proc. (w druku).
[9] S c h e f f e r F., K l o k e A., H ü n e r h o f f F.: Untersuchungen des Bodens auf Mangan Bedürftigkeit nach der m ikrobiologischen Testmethode m ittels Aspregillus niger. II Teil. Landw. Forsch. 10, 1957, s. 207—214.
[10] S t a p p C., W e t t e r C.: Beiträge zum quantitativen mikrobiologischen Nachw eis von Magnesium, Zinc, Eisen, Molybdän und Kupfer im Boden. Landw. Forsch., 5, 1953, s. 167—180. О. Н О В О С Е Л Ь С К И УПРОЩ ЕННАЯ М ЕТОДИКА О П РЕД Е Л ЕН И Я М ИКРОЭЛЕМ ЕНТОВ ПОСРЕДСТВОМ ASPERGILLUS NIGER К аф едра Агрохимии Главной Сельскохозяйственной Школы, Варш ава Заведую щ ий — проф. др. М. Гурски Р е з ю м е Ввиду многих достоинств методики определения микроэлементов при помощи A n ig e r признана было желательной модификация ее. Установ лено, что: 1. Споры одного штамма пригодны для определения различных микро элементов; возможно упрощение метора прививки при использовании с этой целью спор, перемытых вторично дистиллированной водой и затем высушенных. Споры сохраняются в этом состоянии даж е несколько лет. 2. Для удовлетворительного и даж е хорошего роста A. n ig e r и ослаб ления конкуренции других микроорганизмов в продолжение инкубации, достаточно подкислить питательную среду до pH = 2— 3, повысить темпе ратуру инкубации до 33— 35 °Ц и свести её продолжительность к 2— 3 дням вместо стерилизации питательной среды с последуемым веществом в автоклаве. 3. Путем применения дистиллированной воды в ионитной колонне — амберлит MB 12 — или после двойной редистилляции, в стекле сахарозы
Oznaczanie m ikroelem entów metodą A. niger 1 6 3 Мерка — США и соли Бакера — анал. реагента (или сахарозы и местных солей д. а. из Гливиц в случае определения Fe, Zn и M o) можно изгото вить питательную среду, пригодную для определения микроэлементов без предварительной их очистки. Введение этих изменений значительно упро щает метод, способствует увеличению его пригодности для массовых оп ределений и для определения доступных форм микроэлементов. О. NOWOSIELSKI
A SIM PL IFIED METHOD OF DETERM INING TRACE ELEM ENTS B Y M EA N S OF A S P E R G I L L U S N IG E R
Dep. of Agricultural Chemistry, Central School of Agricultur Head — prof. dr M. Górski
S u m m a r y
A sim p lified procedure for d eterm in in g trace elem en ts by m eans of
A . n iger w as d evelop ed and its ad vantages w ere tested . It w as found
that:
1. conidia o f on e stock o f A. n iger are u sefu l for d eterm in a tion of d ifferen t trace elem en ts and th at th e m anner o f inoculation can be sim p lified by u sin g instead of fresh conidia dried ones, p reviou sly washed w ith red istilled w ater, w h ich can be stored for a num ber of years;
2. th a t for th e effe c tiv e su pp ression of the grow th of oth er m icroorga
nism s com p etin g w ith A. niger d urin g th e grow ing period it is s u ffi cien t — instead o f sterilizin g th e n u trien t solu tio n in steam under pres sure — to acid ify th e n utrien t solu tion to pH 2— 3, to increase the tem perature of grow th to 33— 35 °C and to reduce th e tim e of grow th to 2,5 days;
3. a n u trien t solu tio n su itab le for d eterm in in g trace elem en ts w ith ou t
its p u rification can be prepared b y u sin g w ater d istilled in the ionic exchan ger A m b erlite M B-1 resin or w ater tw ice d istilled in glass, sucrose (M erck-U SA ) and salts o f B aker an alytical reagent, also sucrose and salts produced in G liw ice (Poland) for Fe, Mo and Zn determ ination. Owing to th e ch an ges introduced, th is m ethod is m uch sim p ler, m ore u sefu l for serial d eterm in ation and th e d eterm in ation o f trace elem en ts available to plants in soil.
