M. GÓ RSK I, о. n o w o s i e l s k i
PRZY D A TN O ŚĆ GRZYBA C U N N IN G H A M E L L A E L E G A N S DO BA DA NIA PO TRZEB NAW OZOW YCH GLEB W ZGLĘDEM FO SFO RU
(Z Z ak ład u C hem ii R olnej SGGW — W arszaw a)
Poza m eto d ą połow ą n ie posiadam y takich m etod b a d a n ia potrzeb n a w ozow ych gleb, k tó re obejm ow ałyby całokształt czynników w p ły w a ją cych n a ilość fosforu, ja k ą przysw oi ro ślin a w ciągu 'w egetacji. D latego w yniki o trzy m y w an e dotychczas stosow anym i m etodam i m a ją c h a ra k te r w zlędny i a b y n a b ra ć w łaściw ego znaczenia m uszą b y ć odnoszone do dośw iadczeń polow ych i z n im i być porów nyw ane. J e s t to rów noznaczne z koniecznością opraco w an ia tzw. liczb granicznych. D otychczas dla n a szych w a ru n k ó w n ie zostały one rozpracow ane w sto su n k u do żadnej m etody. O pracow anie ich je s t bard zo uciążliw e i połączone z olbrzym im i kosztam i. Z tego w zględu p ow inno się opracow ać je przede w szystkim dla tak iej m etody, k tó ra 1) obejm ow ałaby m ożliw ie ja k n ajw ięcej czyn ników w p ływ ający ch n a p rzysw ajalność fosforu z gleby, 2) p rzed staw ia łab y w arto ść jako m eto d a w ogóle, tzn. daw ałab y w yn iki zgodne w ró w noległych oznaczeniach i b y łab y czuła n a zm iany w ilości badanego czynnika, 3) b y ła b y p ro sta w w ykonaniu, p ręd k a i n a d a ją c a się przez to do m asow ego użycia.
W p ra c y niniejszej chodziło o ustalen ie, w jak im sto p n iu m etoda C u n-
ningha m ella elegans spełnia w ym ienione w yżej w a ru n k i oraz ja k ą
p rzed staw ia w arto ść jak o m etoda b a d a n ia potrzeb naw ozow ych gleb w p o ró w n an iu d o inn y ch m etod.
L ite ra tu ra zw iązana ściśle z ty m zagadnieniem je st stosunkow o uboga. W 19Ó5 r. L e n d n e r A. (1) donosi o zid en ty fik o w an iu now ego ga tu n k u g rzyba z ro d zaju C unningham eU a — C. elegans.
W 1908 r. tenże a u to r (2) opisuje cechy b otaniczne i fizjologiczne tego g atu n k u .
W 1935 r. M e h l i c h A., F r e d Ę. B. i T r u o g E. (3) prześledzili przeszło 15 g atu n k ó w różnych grzybów pod w zględem ich sposobu r e agow ania n a zm iany w ilości fosforu dostępnego. O kazało się, iż spośród n ich C. elegans b y ł najw rażliw szy n a zm iany w zaw artości fosforu, da w a ł najszyb szy i n a jre g u la rn ie jsz y rozw ój poziom y oraz gęstą białą grzybnię. N a tej p odstaw ie a u to rz y ci opracow ali m etodę oznaczania fosforu dostępnego w glebie. O to opis tej m etody: — ,,glebę p rzesian ą
przez sito o śred n icy 2 m m n a sy ca się pożyw ką (specjalnie ułożoną d la C. elegans) do około 60% m ak sy m aln ej pojem ności w odnej. S k ład po żyw ki je st n astęp u jący:
glukoza . . 25,0 g
N H 4N 0 3 ... 2,5 g p e p t o n ... 0,5 g roztw ór soli m in eralny ch . 5,0 m l woda d e s ty lo w a n a ... 1000,0 m l
odczyn obojętny
R oztw ór soli m in eraln y ch zaw iera w 100,0 m l wody: K C 1 ... 20,0 g M gS 0 4 • 7 H 20 ... 10,0 g F e S 0 4 • 7 H 20 ... 0,2 g Z n S 0 4 • 7 H 20 ... . 0,2 g
Po w ym ieszaniu gleby z pożyw ką um ieszcza się ją w m ałych szalkach P etrieg o i w ygładza się jej pow ierzchnię łopatką. N astępnie szczepi się ją na środ ku krop elk ą bard zo gęstej, bogatej w zarodniki zaw iesiny. Szczepienia dokonuje się przy pom ocy ezy o średnicy 3 mm. W iek grzybni, z k tó re j zb ie ra się zarod n ik i do szczepienia, m usi w ynosić co n ajm n iej tydzień, ale nie m oże przekraczać 4 tygodni. Zaszczepioną glebę w staw ia się do w iększego naczy n ia o określonej w ilgotności i p rzy k ry w a się szklan ą pły tą. Całość um ieszcza się w term ostacie n a przeciąg 48 godz., w tem p e ra tu rz e od 27; do 30° (optym alna te m p e ra tu ra — 29°). W tych w arunk ach , w zależności od ilości fosforu dostępnego w ^glebie, ro zw ija się n a jej p ow ierzchni w iększy lu b m niejszy k rąż e k grzybni. Rzadko się zdarza, ab y m ik ro flo ra gleiby zagłuszyła rozw ój grzybni; zapobiega się tem u przez trzy m an ie p ró b k i gleby w około 40QC przez kilk a -dni.
C. elegans je st m ało w rażliw y na odczyn środow iska i może się roz w ijać w zakresie od pH 3,2 do pH 8,6. N atom iast jest b a rd z o w rażliw y n a obniżanie się zaw artości fo sforu rozpuszczalnego, jakie tow arzyszy w zrostow i alkaliczności. D latego też w tej m etodzie należy trak to w ać gleby o pH pow yżej 7,5 odpow iednim i ilościam i kw asu cytrynow ego w celu doprow adzenia ich rea k c ji do obojętnej lub słabo alkalicznej
(pH 6,8— 7,5).
W 1935 r. ci sami, au to rzy i(4) o głaszają pew ne po praw ki do tej m e tody. D alej m etodą tą zajm ow ali się w ro k u 1936 pracow nicy lab o ra to riu m W isconsin (5) oraz R e u s z e r H. W. (6), w ro k u 1938 M o o e r s C. A. (7) i w końcu S z i s z e ł o w a (8).
Z p rzeg lądu lite ra tu ry w ynika, iż m etoda C. elegans pozw ala przez p ro sty p om iar śred nicy otrzym ać w artości dotyczące ilości dostępnego
P rz y d atn o ść grzy b a С. elegans do b a d a ń po trzeb naw ozow ych 119
fosforu znajdującego się w glebie. T ym różni się ta m etoda od in n y ch m etod m ikrobiologicznych, k tó re alb o ocen iają ilość dostępnego fosforu w sposób jakościow y, ja k np. m eto d a A zotobaktera w w yk o n an iu W i- n o g r a d s k i e g o - Z i e m i ę c k i e j ' albo, jeśli n a w e t noszą c h a ra k te r ilościow y to są b ardziej skom plikow ane (np. m etoda A sperg illus niger w w ykonaniu S e к e r y i S c h o b e r a (12,13)).
Toteż p ostanow iliśm y zająć się tą m eto dą i to tym bardziej, iż p rz e pisy dotyczące jej w yko nan ia w yk azu ją pew ne lu ki i nieścisłości.
BADANIA WŁASNE
I. B a d a n i a n a d o r y g i n a l n ą m e t o d ą C unningham ella elegans 1. S p o s ó b o t r z y m y w a n i a z a r o d n i k ó w C. elegans. Po dokonaniu licznych bezow ocnych p ró b odszukania organizm u C. elegans w naszych glebach sprow adzono czystą jego k u ltu rę z M uzeum M ykolo- gicznego w B a a m (Holandia). Gechy m orfologiczne i fizjologiczne sp ro w adzonego grzyba odpow iadały takim że cechom podanym przez L e n d - n e r a w c h a ra k te ry sty c e tego g a tu n k u -(2).
K u ltu rę tę rozm nażano przez zaszczepianie podłoża chlebow ego za ro d n ik am i różnego w ieku od 1 do 6 m iesięcy. P rzygotow anie podłoża chlebow ego jest bardzo proste. C hleb k ro i się n a k ro m k i o grubości, około 1 cm i w yściela się n im i szalki P etrieg o . N astępnie nasyca się go wodą. K w aśn y chleb należy zneutralizow ać przez dodanie do wody odpow ied niej, ilości ługu. Po dostateczn ym n asy cen iu chleba w odą szalki p rzy k ry w a się, zaw ija się je w pap ier i ste ry liz u je przez 90 m in u t p rz y 1,5 atm osfery. W ysterylizow any chleb szczepi się k u ltu rą g rzy ba i w staw ia do te rm o sta tu o tem p e ra tu rz e 29°C.
O trzym yw ano zawsze bardzo szybki i silny rozw ój grzybni, k tó ra w y p ełniała sobą n a w e t całą objętość dużych szalek P e trie g o (20 cm średnicy i 3 cm wysokości). Szalki z g rzy b n ią m ożna potem przetrzy m y w ać ró w nież i w te m p e ra tu rz e pokojow ej, u n ik ając jed n a k zibyt silnych jej w ahań. Z aro d n iki C. elegans nie tra c ą zdolności kiełkow ania w ty ch w a ru n kach już po 2 m iesiącach przechow yw ania, ja k to p odaw ał L e n d n e r, lecz zachow ują ją n a w e t po przeszło p ó ł roku. N orm alnie do b ad ań m e todycznych pobieran o zarodniki z k u ltu r nie m łodszych od dw utygodnio w ych i nie starszych od m iesięcznych, trzy m ając się pod ty m w zględem ściśle w skazów ek a u to ró w (3) oryginalnej m etody.
P o b ieran ia zarodników dokonyw ano przez zalew anie k u ltu ry wodą destylow an ą i przep row ad zenie do n iej zarodników p rzy pom ocy pocie ran ia pow ierzchni g rzybn i bagietką. K ilk ak ro tn e potarcie sp raw ia to, że zarodniki obsypują się z głów ek zarodnikonośnych i m ieszają się z w odą
tw orząc zaw iesinę. Tę zaw iesinę jprzenoszono n a b ibułę filtra cy jn ą , gdzie p rzem yw an o ją od fosforu i in n y ch zw iązków , jak ie m ogły się tam dostać z chleba. Pozostałe n a sączku zarod n ik i przenoszono do m ały ch szalek P etrieg o i rozcieńczano w odą d esty lo w an ą do s ta n u półpłyn nej papki. M alu tk ą kro p elk ą tak iej p ap k i szczepiono gleby. P lo n zarodników z je d nej szalki p rzeciętnie w y starcza n a około 100 szczepień.
T en sposób p rodu k ow ania i p rzy rz ą d za n ia do szczepienia zarodników odbiega nieco od tego, jak i zalecają M e h l i c h i w spółautorzy. Ci bo w iem p o pierw sze: grzybnię, z k tó re j m a się otrzym ać zarodniki, h o d u ją n a brzeczce ściętej ag a re m (25 g brzeczki, 20 g a g aru i l l wody); po d ru gie; p rzy rz ą d za ją zaw iesinę zarodników w p ro st z podłoża hodow lanego przez zalan ie go w odą d esty lo w an ą i w strząsanie. Z alecany przez n ich sposób je s t w praw dzie prostszy, a le nie pozw ala uzyskać dostatecznie gęstej zaw iesiny zarodników , nie u w zględnia przem ycia ich od zanie czyszczeń i fosfo ru oraz w y d a je słabiej p lo n u ją c ą grzybnię.
2. W i e k z a r o d n i k ó w u ż y w a n y c h ł do s z c z e p i e n i a . S praw dzono także, jakim w ahaniom będzie u leg ała średnica g rzy b n i w m ia rę jak w iek zarodników b ędzie coraz b ard ziej p rze k ra cz a ł 4 tygo dnie. W ty m celu w ym ieszano dokładnie około 800 g gleby z połżywką i n ab ito nią m ałe szalki P etriego ; zaszczepiono j e papkam i zarodników o ró żn y m w iek u i w staw iono w jed n y m n a czy n iu ęlo te rm o sta tu n a 36 godzin w tem p e ra tu rz e 29°C. W yniki tego dośw iadczenia są z eb ran e w tab licy 1.
T a b l i c a 1 W pływ w iek u za rodników n a średnicę g rzy b n i C. e l e g a n s
W ie k z a r o d n ik ó w 10 d n i 4 t y g o d n i e 2 m ie s ią c e 3 m ie s ią c e 4 m i e s i ą c e ^ m i e s ię c y
średnica grzybni w m m 25—25 25—25 25—24 24—23 21—20 18—16
Liczby z a w a rte w tab licy 1 pozw alają stw ierdzić, że do szczepienia m ożna używ ać n a w e t zarodników dw um iesięcznych. Tym czasem w o ry ginalnej m etodzie nie zaleca się stosow ania zarodników starszych od 4-tygodniow ych.
W dośw iadczeniu ty m nie w zięto pod uw agę zarodników m łodszych od tygodniow ych dlatego, że jeszcze n a w e t z tygodniow ych k u ltu r tru d n o jest 'o trz y m ać w iększą ilość zarodników . G rzy b n ia n a jb a rd zie j p lo n u je w zarod nik i — w w y p a d k u ro źw oju n a chleibie — dopiero po dw óch ty godniach od chw ili zaszczepienia.
3. G ę s t o ś ć u ż y w a n e j d o s z c z e p i e n i a z a w i e s i n y z a r o d n i k ó w . Szczepienie gleb sposobem zalecan ym w o ryginalnej
P rz y d atn o ść g rzy b a С. elegans do b a d a ń potrzeb naw ozow ych 121
m etodzie n ie d aw ało d o b ry ch rezu ltató w , p rzeto w dalszych 'badaniach szukano innego, m ożliw ie najlepszego sposobu szczepienia. W ty m celu przyrządzono 5 zaw iesin zarodników o różnej gęstości i kładziono m a lu t kie ich k ro p elk i p rz y pom ocy b ard z o cienkiej, szklanej pałeczki n a p o w ierzchnię gleby. K ropelk i te często ro zlew ały się po pow ierzchni gleby, zam iast leżeć n a jej środku. S tąd spróbow ano um ieszczać je do uprzedn io zrobionych n a śro d ku gleby dołków, o śre d n ic y około 1 do 2 m m i głębo kości około 1 -mm. W yniki dośw iadczenia zostały u ję te w tablicy 2.
T a b l i c a 2 W pływ sposobu szczepienia i gęstości zaw iesiny za rodników n a zw artość i k sz tałt
k rążków g rzy b n i S t ę ż e n ie z a w i e s i n y z a r o d n ik ó w Ś r e d n ic a g r z y b n i p r z y u m ie s z c z a n i u k r o p li z a w i e s i n y z a r o d n ik ó w : n a p o w ie r z c h n i g le b y w e w g łę b ie n iu A „p a p k a ” 20X24 24X23 21X23 24X24 23X24 24X23 + + + + + + + + + + + + + + + + + + В „p ap k a” rozcień 20X25 24X24 22 X 25 24X23 23X23 24X24 czona 10 razy + + + + + + + + + + + + С „ p a p k a” rozcień 23X23 21X24 24X22 23X24 23X24 24X24 czona 100 razy + + + + + + D „p ap k a’" rozcień 20X25 24X23 21X24 ' 24X24 23X24 23X23 czona 1000 razy - - — — -
-+ -+ -+ oznacza g rzy b n ię gęstą, siln ie o d cin ają cą się od tła gleby
+ „ „ rzad k ą, k tó re j k o n tu ry zlew ają się z tłe m gleby + + „ „ rzadszą, słabiej o d cin ającą się od tła gleby — „ „ zupełnie w ą tłą , n ie n a d a ją c ą się do pom iarów .
W yniki przytoczonej tabelk i w skazu ją n a to, że zalecane w ory g in al nej m etodzie szczepienie g leb y k ro p lą zaw iesiny kładzionej n a jej po w ierzchnię d a je k rąż k i g rzy b n i n iereg u larn e, o k ształtach często m ocno w ydłużonych. N atom iast szczepienie przez um ieszczenie k ro p li „p ap k i“ zarodników w w głębieniu w y k onanym na śro d k u gleby d a je re g u la rn y rozw ój grzybni.
Z w artość i zw iązana z ty m m ożliw ość dobrego p om iaru średnicy g rzy b n i sp ad ała w m ia rę rozcieńczania zarodników i p rzy kom binacji D b y ła najsłab sza;
Gęstość zaw iesiny n ie m ia ła w p ły w u n a wielkość średnicy; ale g rzy b n ie gleb szczepionych rzadszym i zaw iesinam i b y ły w ątłe, rza d k ie i tru d n e do pom iaru. D latego też w y b ra n o sposób szczepienia, p rz y k tó ry m ,,p a p k ę “ um ieszcza się do w głębienia zn ajdującego się n a śro dk u gleby.
Z astosow anie tego sposobu szczepienia m iało bardzo duże znaczenie dla dokładności m etody i dla o trzy m y w an ia p rzy jej pom ocy zgodnych w yników m iędzy rów noległym i oznaczeniam i.
4. Z a g ł u s z a n i e r o z w o i j u g r z y b a p r z e z m i k r o f l o r ę n a t u r a l n ą g l e b y . N astęp n y m zagadnieniem , k tó re w ym agało lep szego rozw iązania niż to, jak ie m iało w m etodzie oryginalnej — by ło za gadn ienie zagłuszenia rozw o ju grzy b a przez n a tu ra ln ą m ik ro flo rę glebow ą. Początkow o po w tarzano k ilk a k ro tn ie oznaczanie fosforu trzy m ając się ściśle przepisów m etody oryginalnej, nie o trzym y w ano je d n a k zgodnych w yników m iędzy rów noległym i pow tórzeniam i, a w w ielu w ypadkach obserw ow ano zupełne zaham ow anie ro zw o ju grzybni.
W m etodzie ory g in aln ej zaleca się w tak ich razach przetrzy m y w an ie gleb p rzed an a lizą w te m p e ra tu rz e około 40°C iprzez k ilk a dni. P ow inno to zabić lu b osłabić n a tu ra ln ą m ik ro flo rę do tego stopnia, ab y nlie była‘ ona w sta n ie zagłuszać rozw oju grzyba. N iestety jed n a k zastosow anie się do tych zaleceń nie daw ało p o zy tyw ny ch rez u lta tó w i n ad al obserw o w ano zaham ow yw anie rozw oju g rzy b n i i w zw iązku z ty m b ra k zgod ności m iędzy rów noległym i oznaczeniam i.
Należy przypuszczać, iż w p row adzenie do gleby cu k ru w raz z pożyw ką m in e raln ą i łatw o dostępnym i zw iązkam i azotu n ie m oże pozostać bez znaczenia dla n a tu ra ln e j m ikro flo ry . N ajpraw dopodobniej pow oduje ono zachw ianie się n a tu ra ln e g o sto su n k u azotu do fosforu i w w a ru n k a ch optym aln ej w ilgotności i te m p e ra tu ry w yw ołu je gw ałtow ne objadanie gleby z fosforu przez n a tu ra ln ą m ikroflorę. P rz etrzy m y w a n ie gleby w te m p e ra tu rz e 40°C m oże opóźnić tro chę te n proces, ale go n ie lik w i duje. In ten sy w n iejszy jego przebieg godzi w sam ą zasadę m etody, k tó ra przecież opiera się n a zależności rozw oju g rzy ba od k on cen tracji fosforu w, glebie. Z tego w ięc w zględu n ajsłu szn iejszy m rozw iązaniem spraw y objadan ia gleby z fosforu przez n a tu ra ln ą m ik roflorę b y ło jej zniszcze nie; pozw oliłoby to badać ko n cen trację fosforu przy sw ajaln eg o w glebie, ja k a rzeczyw iście istn ieje w m om encie p o b ran ia próbki do oznaczenia. Cel ten m ożna było osiągnąć przez zastosow anie odpow iedniego a n ty se p - ty k u (zabijanie m ik ro flo ry te m p e ra tu rą odrzucono ze w zględu n a u r u cham ianie się fosforu w trak cie ogrzew ania gleby).
A n ty sep ty k iem tak im okazała się tan in a (glukozydow e połączenie k w asu gallusow ego z glukozą). J e s t to ten sam związek, k tó ry służy jako a n ty se p ty k i źródło w ęgla p rzy m etodzie A. niger S e к e r y. W prow adza się ją do gleb y w raz z pożyw ką. Ilość tan in y niezbędna dla unieszkodli w ienia m ik ro flo ry zależy po części od jej zabójczego działania, a po czę ści od składu m echanicznego gleby. Ilość tę u stalono d la gleby (o s k ła dzie m echanicznym zbliżonym do przeciętnego dla gleb polskich), to zna
P rz y d atn o ść grzyba С. elegans do b a d a ń po trzeb naw ozow ych 123
czy dla p iask u gliniastego m ocnego. P rz y u sta la n iu k o n c e n tra c ji tan in y chodziło o ta k ą daw kę, k tó ra p rzy g łu szałab y m ożliw ie ja k najm ocniej n a tu ra ln ą m ikro florę gleby, ale jeszcze nie w pły w ała u jem nie na rozw ój grzyba.
W ty m celu nastaw ion o dośw iadczenie ze w zrastający m i k o n c e n tra cjam i ta n in y *i obserw ow ano rozw ój grzybni. W yniki ty ch b adań są przed staw ione w tablicy 3.
T a b l i c a 3 W pływ k o n c e n tra c ji ta n in y n a rozwój g rzybni
I l o ś ć t a n i n y w g n a lit r p o ż y w k i Ś r e d n ic a g r z y b n i w m m m i e r z o n a p o u p ł y w i e : 28 g o d z in 36 g o d z in 1 2 3 4 5 6 7 8 10 15 0 0 ale gleba trzy m an a w 40° С przez 2 doby
niem al brak rozw oju
6, 6, 7, 6 7, 7, 7, 10 7, 7, 7, 5 7, 7, 7, 7 8, 8, 9. 9 12, 12, 12, 13 14, 14, 14, 15 brak rozwoju niem al brak rozwoju
15, 17, 18, 18 20, 21, 22, 22 22, 22, 22, 23 23, 24, 24, 25 24, 25, 26, 26 25, 26, 26, 27 29, 30, 30, 30 26, 27, 27, 28 26, 26, 27, 28 26, 26, 27, 27 13, 15, 16, 17 15, 17, 18, 18
W skazują one n a sta ły w zrost śred n icy g rzybni w m iarę ja k rośnie k o n cen tracja ta n in y — p rzy 28 godzinach rozw oju grzyba. N atom iast odczyty d okonane ipo 36 godzinach rozw o ju w ykazały, iż średnica grzyb ni rośnie w m iarę w zro stu k o n c e n trac ji ta n in y ale ty lk o do pew nego stę żenia, to jest do 7 g na litr. D alszy w zro st k o n cen tracji tan in y działa już u je m n ie n a w zrost grzybni.
S tąd k o n c e n trac ję odpow iadającą 7 g tan in y n a litr pożyw ki uznano za o p ty m a ln ą i tak ą w łaśnie k o n c e n trac ją posługiw ano się w dalszych oznaczeniach.
5. W p ł y w c u k r u w p o ż y w c e n a r o z w ó j C. elegans. W zw iązku z w p row adzeniem tan in y , k tó ra zaw iera w sobie m iędzy in
-n y m i i glukozę, trz e b a b yło -n a -now o ustalić ilość c u k ru w pożywce. W ty m celu założono dośw iadczenie kom binow ane, w k tó ry m dodaw ano w zra stające ilości cu k ru p rz y ró żnych k o n cen tracjach tan iny . Ja k o c u k ru u żyto m ieszaniny sacharozy z glukozą w sto su nk u 10 : 1 (ten rodzaj cu k ró w zastosow ano ze w zględów ekonom icznych n a podstaw ie poprzednio p rzeprow adzonych dośw iadczeń z k tó ry c h w ynikało, iż sacharoza d ziała podobnie do glukozy).
W yniki dośw iadczeń zebran o w tab licy 4. W nioskując z nich, za n a j lepszą daw kę c u k ru m ożna uznać 22-gram ow ą daw k ę p rz y 7 g ta n in y /l pożyw ki; p rz y tej k o n c e n trac ji c u k ru śred n ica g rz y b n i je s t stosunkow o n ajw iększa, a jednocześnie w yrazistość jej i czytelność odczytów je s t w y starczająco dobra.
T a b l i c a 4 W pływ k o n c e n tra c ji ta n in y i c u k ru n a rozw ój i w yrazistość grzybni
K o n c e n tr a c ja t a n in y w g /l p o ż y w k i K o n c e n t r a c ja c u k r u w g /l p o ż y w k i Ś r e d n ic a g r z y b n i w m m p o W y g lą d g r z y b n i] 26 g o d z in a c h 36 g o d z in a c h 0 15 5, 7 10, 14 bardzo w ątła 0 22 7, 9 10, 11 lekki p rze ro st 0 30 5, 9 8, 12 m ocny „ 4 15 15, 16 17, 18 lekki przerost 4 22 17, 18 20, 20 średni 4 30 22, 22 22, 22 nieczytelna 7 15 19, 20 22, 22 b ra k przerostu 7 18 20, 21 22, 23 7 22 22, 22 23, 24 »
7 26 23, 24 24, 24 silne p rze ro sty
7 30 25, 25 25, 26 nieczytelna
12 22 20, 21 21, 22 nieczytelna
P rz ero sty i słaba czytelność p rzy in n ych k o m binacjach są spowodo w ane praw dopodobnie n a d m ie rn ą ilością c u k ru w sto sunku do ilości fosforu.
6. W p ł y w p o ż y w k i n a z m i a n y o d c z y n u g l e b y . W pro w adzenie ta n in y p ow o d uje zm ianę pH pożyw ki z 6,8 n a 4,0. T rak to w an ie gleby ta k m ocno zakw aszoną pożyw ką m ogłoby spow odow ać u ru ch o m ie n ie fosforu, zw łaszcza n a glebach lekkich. A żeby tego uniknąć pożyw kę
P rz y d atn o ść grzyba С. elegans do b a d a ń potrzeb naw ozow ych 125 z ta n in ą doprow adzano do odczynu obojętnego p rzy pom ocy NaOH. L itr pożyw ki z 7 g ta n in y w y m aga do sw ego zobojętnienia około 30 m l 0,2 n NaOH.
Było teraz rzeczą in te resu jąc ą stw ie rd z en ie w jak im sto pn iu pożyw ka, lu b sam grzyb, zm ien iają odczyn glelby. W celu p rześled zen ia tego za g ad n ien ia 7 różn ych typ ó w gleb o ro zm aity m odczynie nasycano po żyw ką, w yw oływ ano n a n ich ro zm a ity rozw ój grzy b n i (przy pom ocy 4 w zrastający ch d a w e k P 2O5 w postaci K H 3PO 4) i w e w szystkich ty ch k om bin acjach m ierzono odczyn g leb y p rzed i po nasy cen iu jej pożyw ką oraz po 36 godzinach rozw o ju g rzy b n i (w ty m o sta tn im w yp ad k u m ie rzono odczyn w a rste w k i gleby z n a jd u jąc e j się tuż pod grzybnią). W yniki p om iarów zestaw iono w tablicy 5.
Przytoczone w yniki n ie p o zw alają w yciągnąć w niosków stw ierd zają cych, iż rozw ój g rzy b n i działa zakw aszająco n a glebę.
N atom iast w y raźn iejszy w pływ n a zm ianę odczynu gleby m a samo w prow adzenie pożyw ki do gleby. W yw ołuje ono początkow o siln y spa d ek pH, zwłaszcza n a glebach lżejszych (tabl. 5 — gleba n r 1, 2, 6). (Wi docznie k a tio n y soli m in eraln y ch pożyw ki m u siały tu w yprzeć w iększą ilość jonów H z kom pleksu sorpcyjnego). N atom iast gleby „cięższe (4, 5, 7) i piaski próchniczne (3) n ie zm ieniły znaczniej swego odczynu po w prow adzeniu do nich pożywki.
We w szystkich w ypadkach, p o w prow adzeniu pożyw ki, tw orzy się ńow y sta n rów now agi m iędzy kom pleksem sorpcyjnym a roztw orem gle bow ym 'i w ted y n ie obserw uje się już w iększych zm ian w odczynie gle b y bez w zględu n a rozwój) g rzybni.
7. W p ł y w s t o p n i a n a s y c e n i a g l e b y p o ż y w k ą i w i l g o t n o ś c i a t m o s f e r y i n k u b a c j i n a r o z w ó j g r z y b n i. O statnim zagadnieniem by ło prześledzenie w pływ u stop nia nasycenia g leby pożyw ką i w ilgotności a tm o sfe ry otaczającej grzybnię na jej roz wój. W ty m celu założono dośw iadczenie, w k tó ry m gleby nasycano w zra sta ją cy m i ilościam i pożyw ki (co 0 ,5 m l/1 0 0 g gleby). S erie tak ie p od d a w ano oznaczeniom n a fosfor m eto dą C. elegans, z ty m jedn ak, że um iesz czano je w k ry sta liz ato rac h , k tó ry c h d na b y ły w yścielane bibułą, n asy caną w zrastający m i ilościam i w ody od 0 do 8 m l n a k ry sta liz ato r; p rz y k ry w a n o je szk lany m i p ły ta m i i w staw ian o do term o statu .
P rz y słabym n asy cen iu gleby pożyw ką uzyskiw ano za m ałe średnice grzybni. N atom iast tak ie nasycanie, p rz y k tó ry m n a pow ierzchni gleby w ystępow ała cienka b ło n k a pożywki, w yw oływ ało n ie re g u la rn y rozw ój g rzy b n i z silnym i p rzero stam i. Zgodnie z uw agam i a u to ró w oryginalnej m eto d y ilość pożyw ki p o trzeb n a do w łaściw ego nasy cenia gleby ulega znacznym w ahaniom , k tó re zależą od skład u m echanicznego gleby.
T a b l i c a 5 W pływ pożyw ki i rozw oju grzyibni n a odczyn różnych gleb naw ożonych
w zrastają cy m i d a w k a m i P 2 O 5 >> ’S :>>
•s
O d c z y n g le b y i ś r e d n ic a g r z y b n i p o 36 g o d z in a c h r o z w o j u , p r z y w y r a s t a j ą c y c h d a w k a c h Р 80 6 (m g/100 g p le b y ) G le b a* !
£ 2 N £3 «• £ § i N ï Ё g le b a n i e n a - w ie z i o n a + 4 m g + 8 m g + 12 m g . S 5 5 ** 0 с •B “ & 2 се 0 О с o, PHH,0 w m mФ PHHto Ф w m m PHh20 w m mФ PH h,0 w m mФ 1. P iasek wodno- lodowcowy (7 % części spław ialnych) 6,2 i 5,4 5,4 19 5,4 27 5,4 28 5,4i
25 2. P iasek zw ało w y (3°/0 części spław ialnych) 7,0 5,7 6,0 17 5,7 27 5,6 27 5,5 25 3. P iasek pró ch - niczny (18% części sp ła w ialnych) 6,0 5,3 5,1 20 5,1 25 5,1 24 5,1 23. 4. P iasek g lin ia sty m ocny (17% części spław ialnych) 6,5 6,3 6,0 35 5,9 35 5,6 40 5,9 32 5. G lina spiasz- czona (23% części spła w ialnych) 6,8 6,4 6,2 65 6,0 24 6,1 25 6,0 30 6. P iasek pylasty m ocny (20% części spła w ialnych) 5,5 4,5 4,5 12 4,4 17 4,4 23 4,3 24 7. G lina lekka (28% części spław ialnych) 6,7 6,2 6,0 11 6,0 21 6,1 25 5,8 33 8. M ada m ocna (38% części spław ialnych) 6,7 6,1 5,7 14 6,0 22 6,0 25 6,2 30N aw ilgocenie b ibu ły w odą m iało w pływ n a w y razistość odczytów . N ie m oże być ono m niejsze od 2 m l (przy n o rm a ln y m k ry sta liz ato rze N eubau era) ani w iększe od 5— 6 m l, gdyż w je d n y m i d ru g im p rzy p a d k u o trzy m u je się duże p rze ro sty i n ie re g u la rn y rozw ój grzybni.
P rz y d atn o ść grzy b a С. elegans do b a d a ń po trzeb naw ozow ych 127
8. O p i s m e t o d y C. elegans p o w p r o w a d z e n i u d o n i e j p o p r a w e k . W prow adzenie w yżej opisanych popraw ek, a zw łaszcza zastosow anie tan in y, pozw oliło skrócić okres rozw oju grzy b n i z 48 godz. do 36. W praw dzie jeszcze i po 36 godz. n a stę p u je pew ne rozszerzanie się k rążka grzybni, a le o d b y w a się ono kosztem zacierania się różnic m iędzy próbk am i o różnej k o n c e n trac ji fosforu. To skrócenie okresu rozw oju g rzyb ni u łatw iło m ierzen ie jej średnicy; 'bowiem po 36 godz. sp o ty k a się 0 w iele rzadziej p rzero sty grzyb n i niż po 48-igodzinnym je j rozw oju.
P o u w zględnieniu w szystkich dokonanych tu p o p raw ek opis m etody przed staw ia się następująco : P ró b k ę p o w ietrznie suchej gleby nasyca się pożyw ką do tego stopnia, ażeby po um ieszczeniu jej i w ygładzeniu w szalce P e trie g o (o 0 50 m m ) n ie w y stą p iła n a p o w ierzchni cienka w arstew k a płyn u. Pożyw kę przyrządza się w tak i sam sposób, jak w m etodzie o ry g in aln ej (patrz str. 118) z tym , że w prow adza się do nieij! jeszcze 7 g tan in y n a 1 l itr NaOH i 30 m l 0,2 n NaOH h a 1 litr pożyw ki. Z am iast glukozy m ożna używ ać m ieszaniny sacharozy z glukozą w stosun ku 10 : 1 (w litrz e po żyw ki rozpuszcza się 22 g m ieszaniny cukrów ). G lebę um ieszcza się w szalk ach P etriego, w ygładza się jej pow ierzchnię i szczepi się ją m ałą k ro p elk ą „ p a p k i“ zarodników , k tó rą kładzie się do dołka (o w ym . 1— 2 m m 0 i 1 m m głębokości), w ykonanego w sam ym śro dk u pow ierz chni, p rz y pom ocy cien kiej pałeczki szklanej lulb drew n ian ej. Zaw iesinę zarodników u zy sk u je się w te n sposób, iż grzybnię w w iek u od 1 do 8 ty godni zalew a się w odą destylow aną, do k tó re j przep ro w ad za się zarod n ik i p rz y pom ocy bagietki. K ilk ak ro tn e po cieran ie pow ierzchni grzy bn i b ag ietk ą o d ry w a konidia od głów ek zarodnilkonośnych. N agro m ad zają się one w wodzie, tw orząc m n iej lu b w ięcej gęstą zaw iesinę. Zaw iesinę tę przenosi się n a sączek lz b ib u ły filtra c y jn e j — o dm yw a się zarodniki od zanieczyszczeń i fosforu d zbiera się je w postaci „p ap k i“ do m ałego, szkla nego naczyńka. Z b y t g ęstą „p ap k ę“ rozcieńcza się nieco k ro p lą wody 1 w tak im s ta n ie szczepi się n ią glebę. Szczepienia do k o n u je się p rz y po m ocy cien kiej pałeczki szklanej lu b d rew n ia n e j (zaostrzona zapałka). Zaszczepione p ły tk i w staw ia się do n eu b au ero w sk ich k ry stalizato ró w (około 12 cm 0 ), k tó ry c h dno «jest p o k ry te ibibułą, nasyconą kilkom a m l wody. K ry sta liz a to ry w staw ia się do te rm o sta tu (po p rzy k ry c iu ich szkla ny m i p ły tam i) n a przeciąg 36 godzin — do te m p e ra tu ry = 27— 30°C. Po ty m czasie m ie rzy się średnicę ro zw ijającej się grzy b n i p rzy pom ocy cy rk la lu b suw aka z noniuszem . Ze w zględu n a różnice w rów noległych w y n ik ach — oznaczeń do k o n u je isię w 2— 3 pow tórzeniach.
W prow adzenie w yżej w ym ienionych p opraw ek (w ynikające z prześle dzenia szczegółów technicznych m etody) przyczyniło się do uzyskiw ania p rzy pom ocy m eto dy C. elegans zgodniej szych w yników m iędzy rów no ległym i oznaczeniam i i Skróciło czas je j trw a n ia .
II. D o k ł a d n o ś ć p o p r a w i o n e j m e t o d y C. elegans D okładność m eto d y polega n a sto p n iu zgodności w yników m iędzy rów noległym i oznaczeniam i. Początkow o sp raw dzono j ą n a b ielicy lek kiej,, w y k on u jąc n a n iej 20 rów noległych oznaczeń.' W yniki ty ch ozna czeń um ieszczono w tab lic y 6. Ś red n ice g rzy bni tu p o d an e u leg a ją p e w n y m n iew ielk im w ahan iom od 22 do 25 m m . Ś re d n ia a ry tm e ty c z n a w y nosi okrągło 24 mm, a śred ni b łąd pojedynczego oznaczenia 0,8 mm.
T a b l i c a 6 W ahania w śred n ic ac h grzy b n i C. e l e g a n s ro zw ija jąc ej się p rz y jed n ak o w ej
zaw arto ści fosforu w -glebie
N asuw ało się podejrzenie, że stopień dokładności tej m etody będzie zależał od k o n c e n trac ji fosforu w glebie i od w łaściw ości sorp cy jn y ch gleb. J e d n a k p rześledzenie tej dokładności n a 140 różnych glebach nie potw ierdziło ty ch przypuszczeń. D okonyw ano tu oznaczeń w 3 pow tórze niach; n igdy różnice n ie p rzek raczały 3 m m , a przeciętnie w ynosiły 1— 2 m m . Także oznaczenie fo sforu w 3 p ow tórzeniach, w 8 ró żnych gle bach o w zrastający ch k o n cen tracjach P 20 5 nie w ykazało jak iejś w y ra ź niejszej zależności m iędzy w ielkością śred n icy g rzybni a dokładnością m etod y — tu też różnice w rów noległych oznaczeniach w ynosiły p rze ciętnie 1 do 2 m m .
Stąd m ożna przyjąć, iż obliczony błąd pojedynczego oznaczenia rów n y 0,8 m m c h a ra k te ry z u je dokładność m eto d y n a w szystkich glebach.
Św iadczy to o tym , że m eto d a ta, poddbnie ja k i inne m eto d y biolo giczne, pozw ala pracow ać z dokładnością m n iej w ięcej 10% .
III. C z u ł o ś ć m e t o d y C. elegans
W celu u zy sk an ia pełniejszego obrazu w arto ści m eto dy C. elegans prześledzono tak że jej czułość. Czułość 'każdej m eto d y polega n a jej zdol ności do w y k azyw ania m ożliw ie ja k n ajw iększych zm ian w w y nik ach pod w pływ em choćby niezn aczny ch zm ian w ilości b ad anego czynnika. W w y p ad k u m eto dy C. elegans czułość tę b adano w te n sposób, że obser w ow ano zm ian y w średnicach grzybni, w yw oływ an e przez tra k to w a n ie gleb y w zrastający m i daw k am i K H 2P 0 4 . P o stęp u jąc w te n sposób zda w ano sobie sp raw ę z tego, że w pro w ad zenie n a w e t do tej sam ej gleb y określonych, jed n ak o w y ch d aw ek K H 2P 0 4 , n ie je s t rów noznaczne
P rz y d atn o ść g rzyba С. elegans do b a d a ń potrzeb naw ozow ych 129 z w prow adzeniem tak ich sam ych — jednakow ych zm ian w zaw artości fosforu dostępnego dla grzyba. Z tego pow odu badanie czułości tej m e tody m ogło m ieć jed y n ie c h a ra k te r porów naw czy.
T utaj porów nano czułość m etody C unningham ella elegans a) z czuło ścią m eto dy Egnera, A spergillus niger w w ykonaniu S ek ery i C. elegans w m odyfikacji w agow ej n a bielicy lek k iej ze S kierniew ic oraz b) z czu łością m eto d y E gnera n a 8 ty p ach różnych gleb.
a) P rz y poró w nyw an iu czułości 4 m etod n a bielicy lekkiej, daw ki K 2H P O 4 w z ra sta ły co 1 tmg Pfa05/1 00 g gleby. W yniki tego p o ró w n an ia prized«- staw iono n a w y k resie 1, w y rażając .je w pro centach; za 100 p rzy ję to w
y--- M e to d a C. e le g a n s --- — — — M e to d a A. n ig e r S e k e r y
--- M eto d a Egnera --- M e to d a w a g o w a C. e le g a n s
W ykres 1. Czułość p o ró w n y w an y ch m etod w liczbach w zględnych.
niki oznaczeń n a glebie n a tu ra ln e j, k tó re w yniosły: 1) d la m etod y E gnera 2 m g P 2O5/IOO g gleby 2) dla m efo dy C. elegans 4 m m 0 3) dla m etody
A . niger 115 m g i 4) dla m etody C. elegans w agow ej 85 mg.
W ykres pok azuje w yraźnie, iż czułość m etody C. elegans w poró w n a n iu z innym i m etodam i jest najw ięk sza i przew yższa niem al k ilk a k ro tn ie czułość m etody E g n e r a — p rzy niższych k o n cen tracjach fosforu — zaś
P rz y d atn o ść g rzyba С. elegans do b a d a ń po trzeb naw ozow ych 131
W ykres 2. Czułość m etod C. elegans i E g n e ra n a 8 różnych glebach: 1. p ia se k silnie p ró c h n ic z n y — pH 6,5; 2. p ia sek g lin iasty m ocny, p y la sty — pH 6,5; 3. m a d a m ocna — p H 6,2; 4. g lin a le k k a p H 6,5; 5 p ia sek z w a ło w y — pH 6,5; 6. g lin a silnie spiasz- czona — pH 6,8; 7. p ia se k w odnolodow cow y — pH 5,4; 8. p ia sek g lin iasty mocny. — p H 6,5 (m ierzono pH zaw iesiny gleby w wodzie). --- m et. C. e l e g a n s ,
---m et. E gnera.
p rzy w yższych k o n cen tracjach fosforu m aleje, upo dab niając się do czuło ści in n y ch m etod. Czułość m etody A. n iger S e к e r y i C. elegans w m o dy fik acji w agow ej je s t zbliżona do czułości m etody Egnera.
Ta d u ż a czułość m eto d y C. elegans rek o m p en su je stosunkow o m ałą jej dokładność oraz pozw ala łatw o odróżnić gleby ubogie od zasobnych w fosfor.
P ozostałe m etod y biologiczne okazały się o w iele m niej czułym i i stąd zostały pom inięte w dalszych dośw iadczeniach nad czułością.
b) P rz y poró w n y w an iu czułości m eto dy C. elegans z czułością m e tody E gnera n a 8 różnych glebach, daw ki fosforu w zrastały co 4 m g P 2O5 n a 100 g gleby.
O znaczenia m etodą E gnera b y ły dokonyw ane w 2 pow tórzeniach, a m eto d a C. elegans w 3 pow tórzeniach. W yniki ty ch oznaczeń zostały zam ieszczone na w ykresie 2. B adano tu śred n ie z rów noległych oznaczeń w liczbach stosunkow ych, p rzy jm u ją c za 100 w y nik i uzy skan e w g lebach 0 n a tu ra ln e j zaw artości fosforu. W ynosiły one odpowiednio: 1) n a p iask u silnie p róchnicznym 5,7 m g P i 0 5/1 0 0 g gleby dla m etody E g n e r a 1 20 m m średnicy grzyb n i dla m etody C. elegans.
Z zam ieszczonych w yników n a w y k resie 2 m ożna w nioskow ać, iż czu łość m etody C. elegans je st ty m w iększa od czułości m etody E gnera, im niższa je st zaw artość fosforu p rzy sw ajaln eg o d la grzy b a (gleby 3, 6, 8), w m iarę zbliżania się do o p ty m aln y ch k o n c e n trac ji fosforu dla g rzyba p rzy ro sty średnicy m ale ją i po p rzek ro czen iu tej k o n c e n trac ji n a stę p u je zm niejszenie się jego średnicy. N atom iast przebieg czułości m etody Eg n e ra jako czysto chem icznej m etody, je s t (jednakowy przy w szystkich k o n cen tracjach fosforu '(gleby 1, 2, 3, 4 i 5, 6, 7, 8).
Różnice w czułości obu m etod m a ją sw oją w y raźn ą w ym owę. Ś w iad czą one o tym , że obie m eto d y oznaczają ró żny fosfor, że czułość ich po chodzi n ie od jedn akow ych fo rm fosforu. J e s t rzeczą zrozum iałą, iż dla m eto dy b ad an ia p otrzeb naw ozow ych gleb jest w ażna nie jak ako lw iek czułość, ale ty lk o ta czułość, k tó ra jest w y w ołana fosforem dostępnym dla roślin wyższych. N ależy przypuszczać, iż raczej ta form a fosforu w y w o łuje czułość m etody C. elegans. P rzem aw ia za ty m ten fakt, iż w m e todzie C. elegans czynnikiem określający m k o n c e n trac ję fosforu w glebie je s t żyw y organizm , p odlegający ipodobnie ja k i ro śliny w yższe p raw om biologicznym ; zaś w m etodzie E gn era czynnikiem tym jest zachow ujący się w e w szystkich n iem al glebach jednakow o ro ztw ó r bu fo ro w y o b a r dzo niskim pH.
IV. P o r ó w n a n i e m e t o d y C unningham ella elegans z m e t o d ą E g n e r a n a 140 g l e b a c h
W poprzedniej części p racy w ykazano, iż m etoda C. elegans może m ieć c h a ra k te r ilościow y p rzy k o n c e n trac ja ch fosforu m niejszych od op tym aln ej. S tw arza to m ożliw ość qpracow an ia liczb graniczny ch d la tej m etody; w ty m celu należało b y o trz y m an e w yniki porów nać z całą m asą dośw iadczeń polowych. W p racy tej n ie m ożna było dokonać tego p o ró w nan ia bezpośrednio z dośw iadczeniam i polow ym i i stąd dokonano go pośrednio, poprzez liczby graniczne m etody Egnera. W ty m celu oznaczono fosfor w 140 różnych glebach m etodą C. elegans i m etod ą E g nera. Oznaczeń dokonyw ano w 3 pow tórzeniach w w y p ad k u m etody C. elegans i w 2 pow tórzeniach w w y p ad k u m etod y E gnera (stosow ano tzw. p ojedynczą m etodę Egnera).
O trzym ane w yniki zestaw iono w ten sposób, iż w odpow iedniej, u s ta lonej d la liczb g raniczn y ch m eto d y E gnera k lasie sk ład u m echanicznego i pH , um ieszczano liczby u zyskan e obiem a m etodam i; cały m a te ria ł p rzy ty m został ro zbity n a trz y klasy: 1) k lasę gleb w ym agających koniecznie naw ożenia fosforow ego w edług w yceny m eto d ą E gnera, 2) klasę gleb słabo w y m agający ch naw ożenia fosforem, i 3) k lasę gleb nie w y m ag ają cych n aw ożenia fosforowego. Tablice n r 7, 8. 9 ilu s tru ją zestaw ienie i po ró w nan ie w yników obu m etod.
W idać z nich, że n a glebach, k tó re na podstaw ie m etody E g n e ra zo sta ły zaliczone do k lasy w ym agającej koniecznie naw ożenia fosforowego, średnica grzyb ni tylk o w 7-m iu w ypad k ach n a 48 przekroczyła w y m iar 13-tu m m (tych 7 w ypadków odpow iada n isk im zaw artościom P 20 5 w edług m etod y E gn era i zn ajd u je się w g ru p ie gleb lek k ich piaszczystych).
N a glebach, k tó re n a p o d staw ie m etod y E g n era zostały zaliczone do klasy słabo w ym agającej naw ożenia fosforowego, średnica g rzybn i tylko
P rz y d atn o ść grzyba С. elegans do b a d a ń potrzeb naw ozow ych 133 T a b l i c a 7 P o ró w n an ie w y ników m etody C. e l e g a n s z w y n ik am i m etody E gnera. K lasa gleb
koniecznie w ym agających naw ożenia fosforem w edług w yceny m e to d ą E gnera
L. p. G le b a р н Нао Ф g r z y b n i C. e l e g a n s w m m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 Piasek wodno-lodowcowy P iasek wodno-lodowcowy Piasek w odno-lodowcowy P iasek zwałowy P iasek zwałowy P iasek zw ałowy P iasek zwałowy P iasek zwałowy T orf niski P iasek wodno-lodowcowy P iasek zwałowy P iasek zwałowy Piasek zw ałowy Piasek zw ałowy Piasek zw ałow y Mada lekka P iasek zwałowy Piasek w odno-lodowcow y Piasek zwałowy Bielica lekka Bielica lek k a Bielica lekka Bielica lekka B ielica lekka Bielica lekka Bielica lekka Bielica średnia Bielica średnia Bielica średnia Bielica średnia Bielica lekka Bielica lekka Bielica lekka Bielica lekka B ielica średnia M ada lekka B ielica śred n ia B ielica lekka Bielica średnia a) G leby le k k ie I 5.1 5,4 5.7 6.3 6.2 6.3 6,2 6.3 6.9 7.2 7.0 6.9 7.0 6.8 6.9 8.4 6,8 6.9 7.3 b) G leby śred n ie 4.7 5.4 5.0 5.5 6.0 5.7 6,0 6,0 6,0 5.7 6,2 6,2 6,1 6,2 6,2 6,2 6,1 6.5 6.3 6.3 25 19 10 11 19 12 5 4 8 4 12 5 12 29 9 4 9 13 12 9 11 12 11 7 7 11 8 10 10 8 4 4 4 4 8 18 7 13 9 P.O5 m g n a 100 g g le b y w g m e t. E g n e r a 2,2 2,2 1.3 1,2 1,9 2,0 2,1 2,2 3.1 1.2 2,0 3.0 3.3 4.0 4.1 4.2 4.5 4.6 5.0 1.5 1.5 2.1 3.4 1,8 2,0 2.5 2.6 3.5 4.0 1.0 1,8 2,0 2,0 2,1 2.3 2.4 2.4 2.4 3,0
Ciąg dalszy tablicy 7 L. p . G le b a P H HfO (Z) g r z y b n i C . e l e g a n s w m m P.O e m g n a 100 g g le b y w g m e t. E g n e r a 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 B ielica średnia M ada le k k a B ielica lek k a B ielica lekka M ada śred n ia M ada lekka Gleba b ru n a tn a średnia M ada m ocna M ada ciężka M ada ciężka M ada ciężka Bielica ciężka M ada m ocna M ada ciężka 6.4 6,1 6.5 6.5 7.5 6.7 6.7 c) G leby ciężkie 6.4 7.3 7.3 7,0 6,6 6,7 7.5 13 13 U 16 8 12 11 14 9 5 10 15 9 7 3.0 4.0 2.0 2,0 3,4 3.6 3.6 0,8 1,1 1.5 2.6 3,1 *3,1 3,4 T a b l i c a 8 K lasa gleb słabo w y m ag ający ch naw o żen ia fosforem w edług w yceny m e to d ąE g n e ra
L. p . G le b a P H HaO J j ! ф g r z y b n i C. e l e g a n s w m m л P .O e mg n a 100 g g l e b y w g m e t. E g n e r a a) Glelby lekkie 54 M ada lekka 5,5 27 3,8 55 P ia se k zw ałow y 5,3 20 3,9 56 P iasek zw ałow y 5,0 24 4,0 57 ' P iase k zw ałow y 5,4 17 4,2 58 P ia s e k zw ałow y 6,0 18 4,2 59 P iasek zw ałow y 6,2 21 4,0 60 P iase k zw ałow y 6 , 3 4 27 5,2
61 P iasek w odno-lodow cow y 6,3 27 5,2
62 P iase k zw ałow y 6,7 14 5.3 b) G leby śred n ie 63 Bielica lekka 5,2 i 16 4,0 64 B ielica lekka 5,4 12 5,1 65 Bielica lekka 5,9 ! 22 6,2 66 M ada lekka 6,4 25 4,5 67 B ielica śred n ia 6,2 27 6,2 68 Bielica lekka 6,4 25 6,2 69 Mada lekka 6,1 27 7.2 70 i B ielica średnia 6,5 i .w 7,2
P rz y d atn o ść g rzyba С. elegans do b a d a ń potrzeb naw ozow ych 135 Ciąg dalszy tablicy 8
L. p. G le b a р н н зо Ф grzybni C. e l e g a n s w mm P .O . mg na 100 g gleby w g m etody Egnera 71 B ielica śre d n ia 6,5 24 7,2 72 Bielica lekka 6,2 22 7,4 73 Bielica średnia 6,5 24 8,0 74 Bielica lekka . 6,0 22 8,0 75 M ada lek k a 6,7 12 5,1 76 M ada lekka 6,8 29 5,4 77 M ada lekka 7,0 17 5,4 78 M ada lekka 7,0 14 5,4 79 G leba b ru n a tn a lekka 7,0 18 5,6 80 G leba b ru n a tn a lekka 6,9 25 6,7 81 G leba b ru n a tn a lekka 6,7 29 6,9 82 Gleba b ru n a tn a lekka 6,7 24 7,3 83 G leba b ru n a tn a lek k a 7,3 25 7,3 84 G leba b ru n a tn a lekka 6,7 23 7,4
85 G leba b ru n atn a śred n ia 7,2 24 7,6
86 G leba b ru n atn a śred n ia 6,8 29 7,7
87 Gleba b ru n a tn a śred n ia 7,2 23 7,8
88 Gleba b ru n a tn a śred n ia 7,3 24 7,8
89 Gleba b ru n a tn a średnia 6,9 31 8,8
90 Bielica le k k a 6,0 24 8,8
91 G leba b ru n atn a średnia 7,0 28 9.0
c) G leby ciężkie 92 B ielica ciężka 6,2 24 4,4 93 Bielica ciężka 6,5 7 5,6 94 B ielica ciężka 6,2 15 6,8 95 B ielica ciężka 6,7 12 4,8 96 M ada ciężka 6,9 22 4,8 97 M ada m ocna 7,6 4 4,0 98 Mada m ocna 6,7 14 5,4 99 M ada ciężka 7,8 4 5,9 100 M ada ciężka 7,0 11 6,4 101 M ada ciężka 7,7 15 6,5 102 M ada ciężka 6,7 17 6,8 103 M ada m ocna ' 8,4 9 7,7
104 G leba b ru n atn a ciężka 7,0 19 00 o /
105 G leba b ru n atn a ciężka 7,1 21 8,1
T a b l i c a 9 K la sa gleb n ie w y m ag a ją cy c h n aw o żen ia fosforem w edług w yceny m e to d ą E g n era
L. p. Gleba PHh,0 Ф grzybni C. E l e g a n s w mm T ,O e mgr na 100 g gleb y ^ w g m etody Egnera a) G leßy le k k ie 106 P iasek zw ałow y 4,6 5 * 8,0
Ciąg dalszy tablicy 9 L. p . G le b a P^lIjO Ф g r z y b n i C. e l e g a n s w m m P « 0 5 m g n a 100 g g le b y w g m e to d y E g n e r a b) G leby śred n ie 108 Bielica lekka 5,9 28 j 7,2 109 B ielica lekka 5,6 28 1 7,2 110 Bielica lekka 6,0 31 7,4 111 Bielica lekka 5,7 22 8,2 112 Bielica średnia 6,4 25 8,2 113 Bielica śred n ia 6,5 25 11,0 114 B ielica śre d n ia 6,3 24 12,8 115 Bielica lekka 6,5 28 13,8 116 Bielica lekka 6,4 33 15,7 117 Bielica lekka 6,4 33 29,2
118 Gleba brunatna lek k a 6,9 38 9,1
119 G leba bru n atn a lekka 6,9 29 9,7
120 Gleba b ru n atn a lekka 7,'O 25 10.6
121 G leba bru n atn a lekka 6,9 33 11,0
122 G leba b ru n a tn a lekka 7,7 12 11,0
123 Gleba b ru n a tn a średnia 7,0 27 12,4
124 Gleba bru n atn a średnia 7,0 28 13,0
125 Gleba b ru n a tn a średnia 7,6 12 18,9
126 Gleba b ru n a tn a średnia 7,6 37 19,4
127 G leba b ru n a tn a średnia 7,9 16 20,0
128 G leba b ru n atn a średnia 6,8 40 22,6
129 M ada lekka 8,0 21 35,0
130 M ada średnia 7,6 43 40,0
131 M ada średnia 7,9 39 40,0
c) G leby ciężkie
132 B ielica ciężka 5,7 34 8,0
133 B ielica pyłow a ciężka 6,4 33 11,0
134 Mada tłusta 7,6 27 8,3 135 M ada m ocna 7,4 7 9,4 136 Gleba b ru n atn a 7,8 10 9,5 137 M ada m ocna 7,0 16 11,2 138 Gleba b ru n atn a 7,2 30 12,0 139 M ada ciężka 7,5 30 14,8 140 M ada m ocna 7,0 24 15,8
141 Mada ciężka próchniczna 6,9* 15 18,0
142 M ursz ilasty 8,0 27 23,8
P rz y d atn o ść g rzyba С. elegans do b a d a ń p otrzeb naw ozow ych 137 w 5 w yp ad kach n a 51 oznaiczeń b y ła m n iejsza od 13 m m (nie biorąc pod uw agę gleb o pH pow yżej 7,6), k tó ry c h n ie trak to w an o kw asem c y try now ym jak tego w ym aga o ry gin aln a m etoda oraz w 5 w ypadkach w ięk sza od 27 mm.
Na glebach, k tó re n a podstaw ie m etody E gnera zostały zaliczone do klasy nie w ym agającej naw ożenia fosforem , średnica grzyb ni w 1 w y p ad k u na 38 oznaczeń b y ła m niejsza od 13 m m — oraz w 10 w ypad kach m niejsza od 27 m m (nie biorąc pod uw agę gleb o pH pow yżej 7,6).
Jeślib y przyjąć, że klasie gleb w ym agających koniecznie naw ożenia odpow iadają średnice g rzy b n i m niejsze od 15 m-m — klasie gleb słabo w ym agający ch naw ożenia odpow iadają średnice od 13 do 27 m m — oraz klasie gleb nie w ym ag ających n aw ożenia odpow iadają średnice grzybni p rzek raczające 27 mm, to wów czas i zgodność obu m eto d dla k lasy 1-szej w ynosi 85,3%, dla klasy 2-ej 80,4% i d la klasy} 3-ej 73,7%. Ilu s tru je to tablica 10.
Zgodność m etody C. e l e g a n s z m etodą E gnera K la s a g le b w y m a g a j ą c y c h
n a w o ż e n ia f o s f o r e m w e d łu g w y c e n y m e to d ą E g n e r a
K o n i e c z n ie W ą tp liw ie N ie w y m a g a j ą
c y c h w c a le
Zgodność obu m etod w 0 0 85,3 80,4 73,7
Ilość oznaczeń 53 52 39
Z przytoczonych tablic 7— 10 m ożna wnioskować, iż w grubszych za ry sach istn ieje zgodność m iędzy w skazaniam i u zyskanym i przy pom ocy obu m etod. Polega ona n a tym , iż w ynikom m etod y E gnera w skazującym n a coraz to w iększe potrzeb y naw ozow e odpow iadają coraz to m niejsze średnice grzyba. Zgodność ta jest n ajw ięk sza przy klasie gleb n ajb a rd zie j w ym agający ch naw ożenia i m aleje w m iarę przesuw ania się k u glebom coraz zasobniejszym w fosfor.
N ato m iast w ram ach jednej z klas fosforow ych n ie w idać bliższej za leżności m iędzy w ielkością średnicy grzybni, a ilościam i mg P 2O 5, jakie w yk azu je m etoda Egnera. A w w y p a d k u gleb silnie alkalicznych o pH pow yżej 7,6 średnice grzyb n i są niem al w połowie w ypadków n iep ro p o r cjo naln ie m ałe w sto su n k u do w yników u zyskanych p rzy pom ocy m e tody E gnera.
P rzyczyn b ra k u bliższej zgodności m iędzy w y nik am i obu m etod w ram a ch klas fosforow ych n ależy szukać zarów no w sam ych zasadach n a jakich o p ierają się te m etody, ja k i w błędach popełnianych w czasie w y k o n y w an ia oznaczeń. M ożna sądzić, iż ze w zględu n a b ran ie pod u w ag ę w iększej ilości czynników w pły w ających n a dostępność fosforu dla roślin wyższych, m etoda C. elegans daje lepszą ocenę p o trzeb n a
w ozow ych gleb. J e d n a k pew ność co do tego m ożna uzyskać jed y n ie poprzez po ró w nan ie w yników ty ch m eto d z dużą liczbą w yników z do św iadczeń polow ych.
O znaczenie fo sforu w przeszło 140 glebaich pozw ala n akreślić w b a r dzo dużym p rzy b liżen iu dw ie liczby graniczne dla m etody C. elegans w oparciu o liczby g raniczne m eto d y E gnera. P ierw szą z n ich je s t ś re d nica grzy bn i leżąca w okolicy 13 m m ; dzieliłaby ona gleby na koniecznie p o trzeb u jące naw ożenia fosforow ego i n a pozostałe. D rug ą zaś je st śre d nica leżąca w okolicy 27 m m ; dzieliłaby ona te pozostałe glefoy n a słabo p o trzeb u jące naw ożenia i n a n iap o trzeb u jące go zupełnie.
V. S p r a w d z e n i e z a p r o p o n o w a n y c h l i c z b g r a n i c z n y c h d l a m e t o d y C unningham ella elegans n a g l e b a c h p o c h o d z ą
c y c h z t r w a ł y c h p a s ó w s k i e r n i e w i c k i c h
Celem p o tw ierdzen ia słuszności n a k re ślen ia d w u liczb granicznych dla m etody C. elegans: 1-ej w okolicy 13 m m i 2-ej w okolicy 27 m m — dokonano oznaczeń fosforu m eto dą C. elegans i m etod ą E g n era w gle bach pochodzących z trw ały c h pasów skierniew ick ich z kom binacji: C aPN K 1 CaNK.
K om binacja C aN PK o trzy m u je rocznie około 30 kg P 20 5 n a h a i p ra w dopodobnie n ie reagow ałaby znaczniejszym i zw yżkam i plonów n a n aw o żenie fosforow e; n ato m iast kom b inacja CaNK od w ielu la t jest n ie naw o żona fosforem i p ow inna daw ać zw yżki plonów pod w pływ em naw ożenia tym składnikiem . Oprócz tego oznaczono fosfor w glebach z obu k o m b i n acji po u p rzed n im ipotraktow aniu ich K H ^ P 0 4 w ilości odpow iadającej 5-ciu m g P 2O5 n a 100 g gleby. O znaczeń d o k onyw ano w 3 pow tórzeniach jeśli chodzi o rtietodę C. elegans i w 2 pow tórzeniach, jeśli chodzi o m etodę E gnera. W yniki są zam ieszczone w tab licy 11.
W idać z nichr, że na w szystkich p o letkach w y czerpanych z fosforu śred n ice g rzy b n i b yły ' m niejsze od 13 m m (z w y ją tk ie m jednego w y padku); te sam e p o letk a p rz y pom ocy m eto d y E g n era są zaliczane do gleb koniecznie w ym agających naw ożenia fosforem . N atom iast p o letk a od w ielu la t naw ożone fosforem dały średnice grzy b n i o przeciętn ej w a r tości w ynoszącej 26,1 m m ; p rzy pom ocy m etod y E gn era należy je zaliczyć do gleb stojących n a g ran icy słabo w ym ag ający ch naw ożenia fosforem i nie w ym agających go zuipełnie.
N a tej po dstaw ie m ożna wnioskow ać, iż p rzy n a jm n ie j dla bielicy le k kiej ze S kierniew ic je s t słuszne w y b ra n ie śred n icy rów nej 13 mim jak o liczby g ranicznej, dzielącej w p rzy b liżen iu gleby n a w ym agające koniecz nie naw ożenia fosforem i w y m ag ające go w ątp liw ie — podobnie ja k je st słuszne w y b ran ie średnicy odpow iadającej 27-m iu mm, jako liczby g
ra-P rz y d atn o ść g rzyba С. elegans do b a d a ń p otrzeb naw ozow ych 139 T a b l i c a 11 P o tw ierd zen ie słuszności n a k re śle n ia liczib granicznylch d la m etody C. e l e g a n s
w okolicy śred n icy g rzybni = 13 i 27 m m —n a g le b ie pochodzącej z trw a ły c h pasów dem onstraicyjnydh ze S k ierniew ic
G le b a z p a s ó w C a N K G le b a z p a s ó w C a N P K N a w ie z io n a N a w ie z io n a N ie n a w ie z i o n a 5 m g P 80 6 N ie n a w ie z i o n a 5 m g P ,O e n a 100 g g le b y n a lOo g g le b y P H l l 20 E g n e r m g Р ,О ъ n a 100 g g le b y ś r e d n ic a g r z y b n i C. e l e g a n s w m m 1 p H Heo 1 E g n e r m g P , 0 5 n a 100 g g le b y ś r e d n ic a g r z y b n i C. e l e g a n s w m m 5,9 2,0 4 25 6,4 6 ,2 28 38 6 ,1 2 ,1 4 26 6 ,0 7,4 32 40 6 ,1 2 ,0 4 34 6,5 7,2 27 36 5,7 2 ,0 ! 6 26 6,7 1 1 ,0 26 38 6 ,0 1 ,8 ' 7 30 6,3 1 0 ,8 25 40 4,7 ! 8 33 7,0 9,8 25 37 *5,4 1,5 10 27 5,7 8 ,2 25 38 5,9 2 ,0 U 25 6 ,2 7,4 28 37 6 ,0 2 ,1 I 12 24 6 ,8 8,9 24 39 4,9 2,5 1 12 30 7,0 7,9 24 36 5,0 2,4 13 33 6 ,8 6 ,2 23 35 6,9 4.0 1 15 25 6 Д 7.1 27 38
nicznej, dzielącej w przybliżen iu g leb y n a w ym agające w ątpliw ie i nie w ym agające zupełn ie n aw ożenia fosforem .
M etoda C. elegans p rzy obecnym rozpraco w aniu nie p o tra fi określić, jak ich ilości fosforu w ym aga gleba -dla w y dania pożądanych plonów . P o siada ona je d n a k cechy w y ró żn iające ją spośród in n y ch m etod, ja k np. a) to, że je s t m eto d ą biologiczną, przy pom ocy k tó rej m ożna oznaczać
fosfor w glebie pozostającej niem al że w stan ie n a tu ra ln y m ; b) to, że m etoda ta p o siad a tak dużą czułość, iż p rzy ro sty g rzybni pod w pływ em n orm aln ego naw ożenia fosforem (30 kg P 20 5/h a = 1 m g P^Os/lOO g gleby) leżą poza gran icam i błędu. D zięki ty m cechom m etoda ta n a d a je się do p rzep ro w ad zan ia m ikrodośw iadczeń naw ozow o-fosforow ych z C.
elegans.
N ależy przypuszczać, iż zastosow anie tak ich m ikrodośw iadczeń po zwoli uzyskiw ać lepszą ocenę p o trzeb naw ozow ych gleb w po ró w nan iu z dotychczas stosow anym i m etodam i.
S tąd dalsze b a d a n ia n a d sposobam i oceny potrzeb naw ozow ych g leb pow in n y iść w k ie ru n k u m ikrodośw iadczeń naw ozow ych, opieraljących się n a w y n ik ach dośw iadczeń polowych.
VI. M o d y f i k a c j a w a g o w a m e t o d y C unningham ella elegans. 1. C e c h y g r z y b a C. elegans u m o ż l i w i a j ą c e w a g o w ą
' m o d y f i k a c j ę m e t o d y o r y g i n a l n e j
B adania botaniczne A. L e n d n e r a (2) w ykazały, iż C. elegans może rozw ijać się n a podłożach płynnych. N asunęło to m yśl, ażeby zastosow ać go w sposób analogiczny ja k A spergillus niger do bad ania p o trzeb naw o zowych gleb.
Początkow o zakażano pożyw kę p ły n n ą d la C. elegans jego zaro d n i kam i i w staw iano do inkubacji. Po dwóch dobach otrzym yw ano bardzo ładną, b iałą grzybnię, pok ry w ającą całą pow ierzchnię pożywki. Od spodu grzy bnia m a c h a ra k te r zbitej, tw ard ej, śliskiej „podeszw y“ . Podeszw a ta daje się o w iele łatw iej odm yć z ziem i i części organicznych w p o ró w n aniu z g rzy bn ią A. n ig er. W części pow ietrznej g rzyb nia zbudow ana jest z białych cienkich nitek, zakończonych p rzew ażnie konidioforam i. W y sokość jeij p rzeciętn ie w ynosi około 1 cm (rys. 1). Poniew aż grzyb ow ocuje
.Rys. 1. F ra g m e n t ow ocującej części g rzybni C. elegans (pow iększe nie około 900 X); a — laseczka za rodnikonośna, b — głów ka duża,
с — k o n id ia duże, d — głów ki m ałe, e — k o n id ia m ałe.
silnie dopiero po up ływ ie tygodnia rozw oju, więc w czasie przem y w an ia go nie n a stę p u je obsypyw anie się zarodników — ja k to m a m iejsce u A. niger.
B adania p róbn e w ykazały dość w yraźn ą czułość i dokładność k u ltu r pły n n y ch C. elegans w w y k ry w a n iu dodaw anego fosforu. P rzy stąpion o więc do opracow yw ania m odyfikacji w agow ej o ryginalnej m etody C. elegans.
P rz y d atn o ść g rzyba С. elegans do b a d a ń potrzeb naw ozow ych 141
2. U s t a l e n i e s p o s o b u s z c z e p i e n i a d l a w a g -о w e j m e t o d y C. elegans
M odyfikację m etody rozpoczęto od opracow ania sposobu p rzy rządza n ia zarodników do szczepienia. Do chw ili p rzen iesien ia zarodników n a sączek sposób ten jest tak i sam jak w popraw ionej m etodzie ory ginalnej C. elegans (patrz. str. 127). Zaś w dalszym ciągu p rzem y te na sączku zarodn ik i pozostaw ia się do całkow itego obeschnięcia, przenosi d o m ałego m oździerza, dodaje się ró w n ą co do objętości ilość ta lk u (ch. cz.), d eli k a tn ie rozciera się z nim zaro d n ik i i um ieszcza w probów eczce (fiolce). Z niej rozsiew a się je n a pow ierzchnię pożywki, k tó rą zalana jest gleba.
T en siposób szczepienia p rzy ję to ipo u p rzednim p rzeb ad an iu różnych inn y ch m ożliw ości szczepienia g rzybkiem pożyw ki. Początkow o n asu w ały się n a stę p u jąc e m ożliwości:
a) szczepienie k ro p lą odpow iednio gęstej zaw iesiny zarodników , b) szczepienie strzępk iem g rzyb n i o bfitującej w zarodniki,
c) szczepienie proszkiem sporządzonym ze zm ieszania zarodników z talkiem ; przy czym należało tu w ypróbow ać czy celem przy rządzan ia p roszku m ieszać ta lk z suchym i, czy też z w ilgotnym i zarod nik am i (świeżo zeb ranym i z sączka), oraz jak i pow inien być sto su n ek ta lk u do zarodników w proszku.
W yniki p rzeb ad an ia tych m ożliwości są zam ieszczone w tab licy 12. M ówią one nam że:
T a b l i c a 12 W aga g rzybni w m g /k ry s ta liz a to r przy różnyich sposobach szczepienia poży w ki
Pow tórzenia Sposoby szczepienia A в c ! D F G H ! i I 327 266 292 326 372 100 371 363 369 II 217 238 279 396 381 100 350 365 361 III 334 277 305 382 390 98 398 366 364 IV 369 248 287 334 340 110 , 387 369 354 średnio 311 257 289 363 370 102 371 365 362
A) szczepienie strzępkiem grzy b ni daje duże różnice w rów noległych próbkach. N aw et m akroskopow o m ożna było zaobserw ow ać m iejsce gdzie p a d ł strzęp ek grzybni. W m iejscu tym grzyibnia była w yższa i bu jn iejsza w p orów n aniu z otoczeniem . Św iadczy to o n ieró w n o m iern y m ro zprow a dzeniu zarodników w pożywce.
B) C) D) E) szczepienie k ro p lą zaw iesiny o różnych stężeniach daje w y nik i b ard ziej w yrów nane, przy czym są one tym większe, im jest w ię k sze stężenie zarodników . Ale ju ż p rzy w p row adzeniu około 100 m ilionów zarodników w k ro p li dalśze zw iększanie ich ilości nie w pływ a na w zrost
w agi grzybni. Św iadczą o ty m podobne plony g rzybni przy trz y k ro tn y m i dziesięciokrotnym stężeniu zaw iesiny.
F) szczepienie proszkiem , gdzie ta lk b y ł m ieszany z zaro d n ik am i w il gotnym i i dopiero w te d y suszony, d aje w y niki rów noległych oznaczeń dosyć w y ró w n an e ale stosunkow o niskie. P rzy czy n ą n isk ich plonów m ogły tu być pew ne n iek o rzy stn e d la zarodników procesy zachodzące w czasie sty k a n ia się ich z w ilg otn y m talkiem .
G) szczepienie proszkiem sporządzonym z sam ych zarodników d a je w yniki dość w y ró w n an e i w ysokie; zużyw a się jed n a k p rz y ty m dużo zarodników .
H) J) szczepienie proszkiem sporządzonym z ta ik u zm ieszanego z za ro dnik am i suchym i w sto su n k u 1 : 1 i 2,5 : 1 d a je w yniki n a jb a rd zie j w y ró w n a n e i wysokie. S tąd też te n rodzaj szczepienia zastosow ano d o d a l szych oznaczeń, uży w ając p rzy ty m proszku o sto su n k u ta lk u do zarod n ików jak 1 : 1, a to w celu unikn ięcia zw iększania ciężaru g rzy bn i przez w p row adzanie w iększej ilości ta lk u n a pow ierzchnię pożywki.
P om ysł szczepienia pożyw ki zarodnikam i zm ieszanym i z talk iem po chodzi o d S e к e r y i S c h o b e r a (11 i 12). T en sposób pozw ala na rów nom ierne rozp ro w adzenie zarodników n a c a łą pow ierzchnię pożyw ki ze w zględu n a h ydrofobow e w łaściw ości ta lk u oraz stw arza m ożliw ość dłuższego przechow yw ania zarodników bez uszczerbku dla ich energii życiow ej. C echy te m a ją zasadnicze znaczenie* d la dokładności m etody. P rócz tego p rzy pom ocy tego sposobu u zy sk u je się grzybnię zw artą, śliską od stro n y pożyw ki (korzystne działanie talku). D zięki tem u n ie n a b ie ra o na n a sw ą po w ierzchn ię żad n ych zanieczyszczeń ani też cząstek gleby i d aje się bardzo łatw o przem yć.
3. Z a g ł u s z a n i e r o z w o j u g r z y b a
Mimo zastosow ania w yżej opisanego sposobu szczepienia, nie o trz y m yw ano n a glebie zgodnych w yników m iędzy rów noległym i oznacze niam i fosforu w glebie. P rzy czy n ą tego było zagłuszanie rozw oju grzybni przez n a tu ra ln ą m ikroflorę. U n ik n ięto tego tu w sposób analogiczny ja k w pop raw ionej o ry ginalnej m etodzie C. elegans, to znaczy p rzy pom ocy taniny . W ty m celu prześledzono w p ły w w zra sta ją c y c h daw ek ta n in y n a zaham ow anie rozw oju n a tu ra ln e j m ik ro flo ry g leby oraz n a zw iązaną z ty m zgodność w yników m iędzy rów noległym i oznaczeniam i zak ład ając n astęp u jące dośw iadczenie: — N aw ażano pd 10 g gleby do k ry sta liz a to - rów 0 0 7 cm. Glebę tę zalew ano pożyw ką d la C. elegans w ilości 30 m ! (skład pożyw ki ja k n a str. 118) ze w z ra sta ją c y m i d aw kam i ta n in y od 0 do 7 g/l pożyw ki. Poniew aż jed n a k dodatek ta n in y pow odow ał silne za k w aszanie pożyw ki, p rzeto w tej se rii doprow adzano jej odczyn do pH 6.5
