DIE NATURWISSENSCHAFTEN
Elfter Jahrgang. 24. August 1928. H eft 34.
Ist die Hydrolyse der Eiweißkörper Pepsin und Trypsin als homogene Reaktion aufzufassen*)?
V o n J o h n H . N o r th r o p , N e w Yorlc.
(A us d e n L a b o ra to rie n des R o ck e f eller - I n s t itu t s f ü r m edizinische U n te rs u c h u n g e n .) D as S tu d iu m d e r E n zy m e im allg em ein e n u n d
der p ro te o ly tisc h e n E n zy m e im b eso n d eren h a t zu E rg e b n isse n g e f ü h r t, w elche m e h r oder w en ig er von den R e s u lta te n abw eichen, d ie f ü r ein e ideale, k a ta ly tisc h e , m onom olekulare R e a k tio n zu e rw a rte n sind. D ie U n s tim m ig k e ite n im F a lle des P e p sin s u n d T ry p s in s k ö n n e n fo lg e n d e r
m aßen zu sam m en g efa ß t w e rd e n :
F ü r id ea l m o n o m o leku la reE x p e r im e n te lle R e s u lta te . R e a k tio n i n G egenw art
eines K a ta ly s a to r s zu e r w a rte n d e R e s u lta te .
A . B ei k o n s ta n te r S u b s tr a tk o n z e n tr a tio n . 1. D ie z u r S p a ltu n g e in er
g e g eb e n en Substanzm enge n o tw e n d ig e Z eit is t um ge
k e h r t p ro p o rtio n a l d e r K o n z e n tra tio n des K a ta ly sa to rs . 2. D ie M enge des in e in e r gegebenen Z eit g e sp alten en S u b s tra ts is t d e r K o n zen tra tio n des K a ta ly s a to rs p ro p o rtio n a l1).
3. D ie z u r S p altu n g eines be stim m te n p ro z e n tu a le n A n te ils des S u b s tra ts n o t
w en d ig e Z eit is t u n ab h än g ig von d e r S u b s tra tk o n ze n tra tio n .
4. D ie M enge des in e in e r g eg eb en en Z eit g e
sp a lte n e n S u b stra ts ist d irek t p ro p o rtio n a l d e r S u b s tra t
k o n z e n tra tio n .
5. D as e rre ic h te E nd- G leich g ew ich t w ird d u rch die G eg en w art des K a taly sa to rs n ic h t beeinflußt.
6. E in e u n e n d lic h k lein e M enge d es K a ta ly sa to rs k an n ein e u n e n d lic h g roße M enge des S u b strats spalten.
1. D ie n o tw e n d ig e Z eit is t in einem F a lle d e r K o n z e n tra tio n d es E n zy m s u m g e k e h rt p ro p o rtio n a l, in einem a n d e re n F a lle nich t.
2. D ie M enge des ge
s p a lte n e n S u b s tra ts is t d e r K o n z e n tra tio n des E n zy m s n ic h t p ro p o rtio n a l. In ge
w issen F ä lle n is t die M enge des g e sp a lte n e n S u b s tra ts d e r Q u a d ra tw u rz e l d e r E n zym m enge p ro p o rtio n a l.
B . B ei k o n s ta n te m E n z y m .
3. D ie n o tw e n d ig e Z eit is t n ic h t u n ab h än g ig von d e r S u b s tra tk o n z e n tra tio n u n d kan n u n te r b estim m ten U m stän d en d e r S u b s tra t
k o n z e n tra tio n p ro p o rtio n a l sein.
4. D ie g e sp a lte n e M enge is t n ic h t d ire k t p ro p o rtio n a l d e r S u b s tra tk o n z e n tra tio n u n d kan n vo n ih r u n a b h än g ig sein.
5. D ie se r P u n k t ist e x p e rim e n te ll n ic h t g ek lärt.
6. E in e b e g re n z te M enge des E n zy m s k an n n u r eine b e g re n z te M enge des S ub
stra ts sp a lte n . D e r U m fang d e r R e a k tio n ist m erk lich von d e r W as sers to ffio n e n k o n z e n tra tio n d e r L ösung abhängig.
*) D ie S c h riftle itu n g v e r d a n k t d ie Ü b e rse tz u n g aus dem O rig in a l H e r r n P ro f. D r. M a r tin J a c o ly , B e rlin , K ra n k e n h a u s M oabit.
*) D a s is t n u r zu tre ffen d , w en n d e r p ro z e n tu a le A n te il des g e sp a lte n e n S u b s tr a ts k le in ist.
D ie T ab elle zeiigt, d aß d ie K in e tik d er P e p sin - u n d T ry p s in v e rd a u u n g m it den R e s u lta te n , die n a c h d er k la ssisc h e n T h e o rie d e r hom ogenen K a ta ly se zu e rw a rte n sin d , in k e in e r W eise p r a k tis c h ü b e re in stim m t. S olche R e s u lta te h ab en m anche F o rsc h e r zu dem S chluß g e fü h rt, daß E n z y m re a k tio n e n n ic h t hom ogen sind, so n d e rn hetero g en , u n d daß d ie g e le g e n tlic h e Ü b e re in stim m u n g m it den G esetzen d e r h om ogenen R e a k tio n e n a u f Z u fa ll b e ru h t. D iesen S ta n d p u n k t h a t B a yliss (16) k la r v e r tre te n . O hne Z w eifel be
ste h en A nalo g ien zw ischen E ig e n tü m lic h k e ite n von E n z y m re a k tio n e n u n d R e a k tio n e n v o n u n z w e ife lh a ft h etero g en e m C h a ra k te r, w ie z. B.
B r e d ig u n d A r m s t r o n g g ez eig t haben. A r r h e n i u s (1 ), Michaelis (2), E u le r (3) u n d T a m m a n n (4) h ab en a n d e re rs e its angenom m en, daß die E n z y m re a k tio n e n hom ogen siind, w ä h re n d d ie U n s tim m ig k e ite n d u rc h v ersc h ied e n e s e k u n d ä re R e a k tio n en v e ru rs a c h t w erd en , w elche n ic h t a u f R e ch n u n g d er e in fa c h e n m o n o m o lek u laren F o rm e l zu setzen sin d u n d daß bei B e rü c k s ic h tig u n g d ieser R e a k tio n e n die E x p e rim e n te d e m M a ssen w ir
k u n g sg e setz folgen. D iese A u ffa s s u n g i s t e n t
schieden in s o fe rn von V o rte il, als m a n so zu e in e r H y p o th ese m it e in e r b e stim m te n , m a th e m a tis c h e n F o rm e l a u f e in e r e in fa c h e n th e o re tis c h e n B asis g elan g e n k an n . D ie S c h w ie rig k e ite n e n t
ste h e n d ad u rc h , daß die g ew öhnlich a n g e w an d te n G leich u n g e n m e h re re K o n s ta n te n e n th a lte n , so daß d ie Ü b erein stim m u n g zw ischen d en b ere ch n e te n u n d den b eobachteten R e s u lta te n se h r an W e rt v e rlie r t. D as h ä n g t d a m it zusam m en, daß die m e iste n A rb e ite n sich m it d e r K in e tik der R e a k tio n b esch äftig en . B e k a n n tlic h b e re ite n die k in e tisc h e n R e a k tio n e n ex p e rim en tell d ie g rö ß te n S ch w ierig k e ite n . Z u m B e isp ie l is t d ie T h eo rie der K in e tik d er Z u ck erh y d ro ly se, tro tz d e m sie la n g e J a h r e d u rc h za h lreic h e F o rs c h e r s tu d ie r t w o rd e n ist, noch ganz unvollkom m en. M an w ird d a h e r besser an das P ro b le m herainkom m en, w en n m an d ie R e a k tio n des E n zy m s m it S u b stan z en s tu d ie r t, w elche von ih m n ic h t g e sp alten w erden.
S ch o n la n g e is t es b e k a n n t, d aß e in e E iw e iß lö su n g , welche d u rc h P e p sin o der T ry p s in h y d ro ly s ie r t w o rd en ist, S u b sta n z e n e n th ä lt, w elche die W irk u n g e n des E nzym s hem m en. W a h rsc h e in lic h v e rb in d e n sic h die H e m m u n g ssu b sta n z e n m it dem E nzym . E s w u rd e d a h e r die R e a k tio n zw ischen d e r H e m m u n g ssu b sta n z u n d dem E n z y m s tu d ie rt.
D ie V ersu ch e zeigten, daß, w enn d as E n zy m u n d
Nw. 1923 92
714 Northrop: Ist dieHydrol. der Eiweißk.Pepsin u.Trypsin als homog.Reaktion aufzufassen? f Die Natur-
L w is s e n s c h a fte »
die E iw eiß lö su n g so rg fä ltig g e r e in ig t w aren , d is Z eit, w elche notw en d ig ist, um k le in e Ä n d e ru n gen d er V isk o sitä t oder der L e itfä h ig k e it des E iw e iß k ö rp e rs d u rc h d ie E in w irk u n g des E nzym s h e rb e iz u fü h re n , u m g e k e h rt p ro p o rtio n a l der K o n z e n tr a tio n des E nzym s ist. D as is t e in e re in ex p e rim en telle T atsach e. E s k a n n d a h e r die Q u a n titä t des v o rh an d e n en a k tiv e n E n zy m s als u m g e k e h rt p ro p o rtio n a l der Z e it an g e se h en w e r
den, w elche n o tw en d ig ist, u m ein e w illk ü rlic h g e rin g e Ä n d e ru n g in der L e itfä h ig k e it oder V is
k o s itä t e in e r G ela tin e lö su n g u n te r k o n s ta n te n B e
d in g u n g e n (T e m p e ra tu r, pn usw .) heribeizufüh- ren . E s w u rd e n k o n z e n trie rte L ö su n g e n der H e m m u n g ssu b sta n z o der von S u b stan z en , w elche d u rc h E nzym hydrolyse e in e r E iw eiß lö su n g ge
w on n en w aren , h e rg e ste llt. D ie S u b sta n z is t le ic h t d ialysabel u n d es b e s te h t d a h e r k ein G ru n d zu der A nnahm e, daß sie sich n ic h t in w a h re r L ö su n g b e fin d e t. A u ch Trypsiin g e h t d u rc h eine C o llodium m em hran m it b e trä c h tlic h e r G esc h w in d ig k e it, so daß es sich a u c h ebenso w ie d ie H e m m u n g ssu b stan z wie eine e c h t lö slich e S u b sta n z v e rh ä lt.
E i n f l u ß der R e i h e n fo lg e der M ischung. B ew eis der R e v e r s ib ilitä t der R ea k tio n .
W e n n m an die R e a k tio n als ein e hom ogene M assengleichgew ieht'sreaktion a u ffa sse n w ill, is t es notw en d ig , zu zeigen, daß s ie schnell u n d voll
s tä n d ig rev e rsib el ist. H e te ro g e n e R e a k tio n e n sin d dagegen g ew öhnlich n ic h t ohne w eite re s reversibel. T abelle I v e rg le ic h t d ie R e s u lta te , die m a n e rh ä lt, w en n m an d ie H e m m u n g ssu b sta n z m it T ry p s in in einem k lein en V o lu m en W asser m isch t u n d d a n n v e rd ü n n t, m it den R e s u lta te n ,
T a b e lle I.
E in flu ß der A r t d er Z u fü g u n g der IIe m m u n g s s u b s ta n z
N otw endige Z eit fü r 1%
H y d ro ly se
%
d e r In a k tiv ie ru n g T ry p sin allein (K o n tro lle).1) 25 ccm G elatin e -|- 1 ccm T r y p s i n ...
2) (25 ccm G elatin e -f- 1 ccm H em m ungssubstanz) -J- 1 ccm T r y p s i n ...
3) 25 ccm G elatin e -j- 2 ccm (M ischung 1 ccm T rypsin -{- 1 ccm H em m ungssubstanz)
K o h le.
1) (10 ccm G e latin e -|- 1 ccm W asser) -f- 0,2 ccm T ry p sin —K o n tro lle ...
2) (10 ccm G elatine -j- 1 ccm K o h lesu sp en sio n ) -f- 0,2 ccm T ry p s in ...
3) 10 ccm G elatin e -f- (1 ccm K o h le su sp e n sio n -j- 0,2 ccm T ry p sin ) ...
0,16
0,21 0,22
0,22 0,22
0,41
0,40
3,00
0
26
28
die m an erz ie lt, w enn m an das T ry p sin in v e r d ü n n te r L ö su n g m it d e r H e m m u n g ssu b sta n z m ischt.
D ie V ersu ch e zeigen, daß bei A n w en d u n g d e r aus E iw eiß k ö rp e rn d a rg e s te llte n H em m u n g s
su b stan z das E n d re s u lta t im m er dasselbe ist.
D ie R e a k tio n zw ischen den zwei S u b sta n z e n muß d ah er rev e rsib el sein, w eil, w ie w ir u n te n sehen w erden, d ie M enge des g eb u n d e n en T ry p s in s d eu t-
2,8 2,6 2, ¥
, 2,2
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Einheiten der zugefügten Hemmungssubstanzfccmffemmungssubsfanzx 10)
— b e re c h n e t
• ° b e o b a c h te t
F ig . 1. W ir k u n g der Ziufiigung s te ig e n d e r M engen von TIeirirriungissubßtanz zu T ry p sin lö s u n g e n v e rsch ie d en e r S tä rk e . D ie a u fg ezo g en en K u rv e n s in d b e rec h n ete W e rte u n d die P u n k te s te lle n die b e o b ach teten E i n
h e ite n von anw esendem , w irk s a m e n T r y p s in d a r.
87
° b e o b a c h te t
—— b e re c h n e t
F ig . 2. D er E in flu ß der G esam tm en g e des T ry p s in s a u f die In a k tiv ie r u n g , die d u rc h 5 H em n iu n g sein - h e ite n b e w ir k t w ird . S te ig e n d e M engen T ry p s in s w e r den zu R eih en von R ö h rch en h in zu g e fü g t, von d en en jedes 25 ecm G e latin elö su n g u n d 5 H e m m u n g e ein - h e ite n e n th ä lt. G leich zeitig w ird u n te r d en selb en V er- su ch sb e d in g u n g en ein e R eihe o h n e H em im u n g ssu b stan z
an g esetzt.
lieh d u rc h Ä n d eru n g des V o lu m e n s g e ä n d e rt
w ird. D ie m it K ohle e r h a lte n e n R e s u lta te sin d
davon g an z v erschieden. H ie r i s t diie V e rb in d u n g
sehr viel v o lls tä n d ig e r, w e n n d ie K o h le zu k o n
z e n trie rte n T ry p s in lö su n g e n h in z u g e f ü g t w ird ,
w ie H e d i n (5) g e fu n d e n h a t. D ie V e rb in d u n g
m it K o h le is t d a h e r n ic h t le ic h t rev e rsib el. D ie
obigen E x p e rim e n te zeigen d a h e r n ach m e in er
Northrop: Ist die Hydrol.der Eiweißk. Pepsinu.T rypsin als homog. Reaktion aufzufassen? 715 Heft 3i. 1
24. 8. 1923J
M e in u n g k la r, daß d ie R e ak tio n zw ischen dem E n zy m u n d d e r H em m ungs su'bs ta n z e in e hom o
gene G leic h g e w ic h tsre a k tio n ist.
F ig . 1, 2 u n d 3 zeigen die R e su lta te , w elche m a n e r k ä lt, w enn m an die M enge d e r H e m m u n g s
su b sta n z o der die K o n z e n tra tio n des Enzym s ä n d e rt u n d w enn main ein e M isch u n g des E nzym s un d der H em m u n g ssu b sta n z v e r d ü n n t ( 6). D ie aü»gezogenen K u rv e n sin d in jedem F a lle aus d e n P u n k te n igebildet, die aus dem M assen w irk u n g sg ese tz zu b erechnen sin d u n te r A n w en d u n g der fo lg en d en F o rm e l:
Enz y m -j- Hem m ungssubstanz E nzym — Hem m ungssubst
F e r n e r is t anzunehm en, daß n u r das fre ie E n z y m w irk sam ist.
800 WO 200 100 V.
0,031 0,062 0,125 > 0,25
Zu 25cc/n Ge/afine zugefügte Trypsin/ösung in ccm A R eines Trypsin, verdünnt mit W asser.
B Trypsin-Hem m ungssubstanz, verdünnt mit W asser.
<3 Trypsin-Hemmungssubstanz, verdünnt mit L ösung von Hemmungssubstanz.
V = "V olumen der Lösung, die 1 ccm Trypsin "enthält.
—— berechnete W erte.
° )
| beobachtete W erte.F ig . 3. D er E in flu ß d er G e g e n w a rt vo n H em m ungs- s>ubstaniz a u f die K on zen t r a t io n s - W i r k s a m k e its -K u r ve des1 T ry p s in s . O urve A ; „ re in e s “ T r y p s in v e rd ü n n t m it W asser. K u rv e B , M ischung! von ‘ T ry p s in u n d H e m m u n g ssu b stan z, v e r d ü n n t m it W as se r. D as V er
h ä ltn is von T ry p s in z u r H em m ung« su b s ta n z i s t d a h er k o n s ta n t. K u rv e C, M isch u n g v o n T r y p s in u n d Hem - rn u n g ssu b stan z, v e r d ü n n t m it e in e r L ö su n g von H em - m u n g ssu b s ta n z von d erselben ‘K o n z e n tra tio n , w ie s ie in d e r T ry p s in lö s u n g v o rh a n d en w a r. D ie K o n z e n tra tio n d e r H em m u n g ssu b sta n z i s t d a h e r in diesem V ersuch
k o n s ta n t.
E s is t e rsic h tlic h , daß in jed em F a lle die ex p e rim e n te lle n R e s u lta te m it d e n b ere ch n eten W e rte n bis a u f 5 % ü b e re in stim m e n . D ie A b
w eich u n g is t n ic h t g rö ß e r als d e r V ersu c h sfe h le r.
D iese V ersu ch e w u rd e n w ie d e rh o lt m it P ep sin .und T ry p sin u n d dem „ A n titr y p s in “ des n o r
m alen S eru m s. Im m e r w u rd e n d ieselben R e su l
ta te e rh a lte n . W e ite rh in w u rd e g e fu n d e n , daß die d u r c h d ie oben w ied erg eg eb en e F o rm e l v e r
la n g te B eziehung die einzige ist, w elche f ü r alle V ersu ch e anw endbar ist. D er zu m eist a u s
g e f ü h r te V ersuch, in dem a lle in d ie K o n z e n tra tion d e r H e m m u n g ssu b sta n z v a r ii e r t w ird (F ig . 1), g ib t k ein e en tsch e id en d e n R e su lta te . Z um B e i
sp ie l w u rd e g e fu n d e n , daß d ie K u rv e m:it gleich er
G e n a u ig k e it in E in k la n g g e b ra c h t w erd en k a n n m it der A d so rp tio n sfo rm el, e in e r b im o le k u la re n F o rm e l, wie m it d er oben a n g e w a n d te n F o rm el.
B e rü c k s ic h tig t m an jed o ch alle V ersu ch e , so is t
das n ic h t der F a ll. ' :
D iese V ersu ch e zeigen, daß d ie ex p e rim e n te lle n T atsac h en , die m an beim S tu d iu m d er R e a k tio n zw ischen Trypsiin oder P ep sin u n d den H em m u n g ssu b sta n z e n e rh ä lt, vollkom m en n ach dem M a ssen w irk u n g sg e setz e r k lä rt w erd en k ö n nen. D ie T atsac h e, daß d ie F o rm e l zw ei K o n s ta n te n e n th ä lt, b e e in trä c h tig t (n atü rlic h die S ic h e rh e it des B ew eises. B e rü c k s ic h tig t m an jedoch die V o llkom m enheit d er Ü b e re in stim m u n g u n d den b re ite n U m fa n g d er ex p e rim en tellen B e d in g u n g e n , so e r s c h e in t es n ic h t b e re c h tig t, die Ü b erein stim m u n g als z u fä llig anzusehen. E u le r (3) h a t denselben S chluß (beim S tu d iu m d e r In - vertasewii rikung gezogen.
D ie obige E rk lä r u n g k a n n je tz t a u f d ie K in e tik der R e a k tio n a n g e w a n d t w erd en , u n d es is t ü b errasc h en d , w ieviele der U n s tim m ig k e ite n m it der A n n ah m e d e r m o n o m o lek u laren F o rm e l v o r
au sg esa g t u n d b ere ch n et w erd en k ö n n e n 2). W ie oben d a rg e le g t w u rd e , w ird die H e m m u n g s
su b stan z aus dem E iw eiß k ö rp e r d u rc h d ie W ir k u n g des E nzym s gebildet. W e n n m an also n ic h t so rg sam sowohl die E iw eiß lö su n g w ie die E nzym - lösunjg re in ig t, k ö n n e n beide schon H e m m u n g s
su b stan z e n th a lte n . W enn die E n zy m lö su n g die S u b stan z e n th ä lt, f in d e t nxan, daß d er G ra d d e r V e rd a u u n g w en ig e r sc h n e ll als d ie E nzym konzen- tratioin zu n im m t. D as is t v e r w irk lic h t in F ig . 3, K u rv e B . D a ra u s fo lg t, daß, je k o n z e n trie rte r die L ö su n g is t, desto w en ig e r fre ie s u n d in fo lg e dessen w irk sam es E n zy m v o rh a n d e n ist. W enn dagegen die E iw eiß lö su n g H e m m u n g ssu b sta n z e n th a lte n sollte, sin d d ie R e s u lta te g erade u m g e k e h rt, uind m an f in d e t, daß der G ra d d er V e r
d a u u n g viel sch n eller a ls die E n z y m k o n z e n tra tio n
2) D ie th eo re tis ch e F o rm e l f ü r die R e a k tio n zw ischen je zw ei M olekülen i s t d S /d t — K E S , w en n E die E n z y m k o n z e n tra tio n u n d S die S u b s tr a tk o n z e n tra tio n b ed eu te t. W en n das E n z y m a ls ein id e a le r K a ta ly s a to r a u fg e fa ß t w ird , i s t E k o n s ta n t u n d die G leich u n g w a n d e lt sic h in die ein fach e m onom o’le k u la re F o rm e l um . M an k a n n jedoch zeigen, daß E in zwei F ä lle n n ic h t k o n s ta n t ist, so n d e rn w ä h re n d d e r R e a k tio n a b n im m t:1. w enn das E n zy m sich s t ä n d ig m it den P ro d u k te n der R e a k tio n v e rb in d e t u n d 2. w en n s p o n ta n e Ver
s e tz u n g des E n zy m s e in t r i tt . E i s t d a n n k e in e K o n s ta n te , so n d ern m uß d a n n a ls ein e F u n k tio n sow ohl von E wiie von X b e ze ic h n e t w erd en . D ie B ezieh u n g von E zu X , 'den P r o d u k te n d er H y d ro ly se , i s t a u s den eben b esch rieb en en V ersu c h en b e k a n n t. W en n d ie V er- suchsibedingunigen so g e w ä h lt s in d , daß m an die Spon- ta n in a k tiv ie r u n g v e rn a c h lä ss ig e n k a n n , s o i s t es m ög
lich, w ie w ir oben g e z e ig t hab en , fü r den E in flu ß d e r R e aik tio n sp ro d u k te zu e in e r Ü b e re in s tim m u n g zw ischen den V ersu ch en u n d den V o ra u ss e tz u n g e n d er T h eo rie zu g elan g en . R ic h te t m an a n d e re rs e its die Versuclus- bedingiungen so ein, daß die p ro z e n tu a le I n a k tiv ie r u n g dies Ecnizyms d urch die P r o d u k te g e r in g is t, d a n n k a n n E a ls ein e F u n k tio n von T a u s g e d rü c k t w erd en , u n d die V e rsu ch e s tim m e n w ieder m it d er T h eo rie ü b e rein , o b w ohl die R e su lta te g ä n zlich v e rsch ied en sin d , d ie u n te r den obigen B ed in g u n g en e rh a lte n Avorden s in d .
716 Northrop: Ist die Hydrol. der Eiweißk. Pepsin u. Trypsin als homog.Keaktion aufzufassen? r Die Natur- Lwissenschaften
z u n im m t. D as fo lg t aus den R e s u lta te n , d ie in
F ig . 2 u n d K u rv e G der F ig . 3 w ied erg eg eb en s in d , w elche zeigen, daß, je k le in e r d ie M enge des E n zy m s, desto g rö ß er d e r p ro z e n tu a le A n te il des in a k tiv ie rte n E nzym s. M it a n d e re n W o rte n , w en n die K o n z e n tra tio n d e r H e m m u n g ssu b sta n z k o n s ta n t ist, aber die to ta le K o n z e n tra tio n des E n zy m s sich ä n d e rt, etw a von 4 zu 1, so f in d e t m an, daß d ie K o n z e n tra tio n des fre ie n E nzym s u n d d a m it im Z u sam m en h a n g d e r G ra d d er V e r
d a u u n g m eh r als v ie rm a l so viel b e trä g t. D a s sin d e in ig e d e r k le in en U n stim m ig k e ite n , w elch e a u f dem selben W ege e rw a rte t u n d v o rau s b e re c h n e t w erd en können.
D ie V e rsu c h e k ö n n en au ch als eine e x p e rim en te lle B e s tä tig u n g d e r A rrh e n iu sso h e n A b le itu n g d er S ohützsohen R e g el angesehen w erden.
A r r h e n i u s f ü h r te aus, daß, w en n m an a n n im m t, d aß d u rc h die W irk u n g d es E nzym s S u b stan z en g e b ild e t w erden, w elche sich m it dem E n zy m u n te r E n ts te h u n g e in e r in a k tiv e n V e rb in d u n g
Ton
600§
! wo
^ 300
I5 $
^ ZOO 100
0 1 2 3 V 5 6 7 8 9 10 11 12 13 n 15 16 17 18 19 20
V T
F ig . 4. K u rv e n , w elch e den G ra d d er V e rd a u u n g von E ie re iw e iß zeigen.
v erb in d e n , sobald d ie S u b stan z in großem Ü berschuß anw esend ist, d ie M enge des fre ie n E n zy m s d ire k t p ro p o rtio n a l d e m A n w ach sen d e r R e a k tio n sp ro d u k te ab n im m t. D er G ra d d er R e a k tio n w ird dlaher u m g e k e h rt p ro p o rtio n a l sein zu d e r M enge der g e b ild eten P ro d u k te u n d in fo lg e dessen d ie M enge der g e b ild eten P r o d u k te p ro p o r
tio n a l d er Q u a d ra tw u rz e l d er v e rflo sse n e n Z e it sein. D ie A b le itu n g k a n n m a th e m a tisc h fo lg e n d e r
m aßen a u s g e d rü c k t w erd en : d x k 1
— = — oder in te g rie rt x — k y 1 d t x
W en n diese A b le itu n g r ic h tig ist, fo lg t d a ra u s, daß die S chütz«che R egel n ic h t beim B e g in n d er R e a k tio n g ilt, w en n die H e m m u n g ssu b sta n z noch n ic h t im Ü berschuß v o rh a n d e n is t, n o ch am E n d e d e r R e ak tio n , w enn d ie R e a k tio n a llm ä h lic h zu r ü c k g e h t beim A bnehm en d er S u b s tra tk o n z e n tra tio n . D ie se r F a ll is t in F ig . 4 v e r w irk lic h t (7).
W e n n d ie R e a k tio n w ie gew ö h n lich m it einem se h r g ro ß en S u b stra tü b e rsc h u ß in G a n g g eb ra ch t Avird, f in d e t m an, daß die S ch ü tz sch e R eg el G el
tu n g h a t, (bis d ie R e a k tio n p ra k tis c h b eendet is t.
D a ra u s fo lg t, daß u n te r diesen B e d in g u n g e n d ie R e a k tio n laufhört, w eil alles E nzym in a k tiv ie rt ist, obgleich n u r ein k le in e r P ro z e n ts a tz des S ub
s tr a ts a u fg e b ra u c h t ist.
D as G leich g e w ich t zw ischen dem E n zy m un d d e r H em m u n g ssu b sta n z w ird au ch v e ra n tw o rtlic h se in f ü r d ie A n o m alien , d ie iin dem G ra d e d er I n a k tiv ie r u n g d e r E n zy m lö su n g en b e o b a c h te t w o rd e n sin d (8). G ew öhnlich f in d e t m an zum B eispiel, daß, je k o n z e n trie rte r ein e E n zy m lö su n g is t, desto sta b ile r s ie a u c h is t, u n d f e rn e r, daß die I n a k tiv ie r u n g d a n n la n g sa m e r f o r t sc h re ite t, a ls n a c h d e r m o n o m o le k u la re n F o rm e l zu e rw a rte n ist. E s is t ex p e rim e n te ll gezeigt w orden, daß d ie Z u fü g u n g von H e m m u n g s su b stan z d a s E n zy m v ie l s ta b ile r m a ch t. D as f r e ie E n zy m w ird d a h e r sc h n eller in a k tiv ie r t als d ie E n zy m -H e m m u n g ssu b sta n z -V e rb in d u n g . N u n is t schon g ez eig t w orden, daß, je k o n z e n tr ie rte r die L ö su n g ist, desto g rö ß e r d ie M en g e des ge
b u n d e n e n E nzym s. E s fo lg t d a h e r d a ra u s , daß, w en n das g eb u n d e n e E n zy m s ta b ile r is t, je k o n z e n tr ie r te r die L ö su n g ist, sie desto sta b ile r sein w ird , w ie das auch ex p e rim e n te ll fe s tg e s te llt ist.
E s is t au ch g ez eig t w orden, daß, je k le in e r d ie M enge des E nzym s ist, das g le ic h z e itig m it e in e r k o n s ta n te n M enge H em m u n g ssu b sta n z v o rh a n d e n ist, desto grö ß er d e r A n te il des E n zy m s is t, d e r g ebunden u n d d a m it s ta b ile r w ird . D a ra u s fo lg t d an n auch, daß, w en n a k tiv e s E n z y m z e r s tö r t w ird , e in m e h r o d er w e n ig e r g ro ß er A n te il des v e rb le ib en d e n E n zy m s i n g e b u n d e n e u n d d a m it sta b ile F o rm ü b e rg e h t. D e r G ra d d e r I n a k tiv ie r u n g w ird d ah e r im m e r la n g sa m e r w erd en , w as a u c h e x p e rim e n te ll fe s tg e s te llt w o rd e n ist.
Dlie b is h e rig e n E rö r te ru n g e n zeigen, daß s e h r vieles ex p e rim en tell f ü r die H y p o th e se s p ric h t, daß d ie R e a k tio n zw ischen dem E n zy m u n d den H em m ungss'ubstanzen m it d em M a sse n w irk u n g s
gesetz in E in k la n g s te h t u n d daß diese H y p o th e se es au ch erm ö g lic h t, q u a n tita tiv alle A n o m alien v o rh erzu sa g en , w elche m a n f in d e t, w e n n die
E n z y m k o n z e n tra tio n v a r iie r t w ird .
N u n m e h r m uß je d o ch n o ch dem E in flu ß der W a sse rsto ffio n e n k o n z e n tra tio n u n d d e r S u b s tr a t
k o n z e n tra tio n R e c h n u n g g e tra g e n w erden.
D e r E i n f l u ß vo n p # .
M an h a t schon sehr f r ü h g efu n d e n , daß der Säuregriad d er L ösung e in e n se h r m e rk lic h e n E in flu ß a u f den U m fan g d er E n z y m w irk u n g h a t, u n d S ö re n se n k o n n te zeigen, daß es s ic h h ie r in e r s te r L in ie u m eine F u n k tio n d er W a sse rsto ff- io n e n k o n z e n tra tio n h a n d e lt. D ie se S c h lu ß fo lg e r u n g i s t f ü r a n d e re E n zy m e g an z allg e m e in a n genom m en w orden, aber es w ir d im m er noch von ein ig e n F o rs c h e rn a n g e n o m m e n , daß d ie W irk sa m k eit der p ro te o ly tisc h e n E n zy m e von den a n d ere n Io n e n u n d von dem p h y sik a lisc h e n V e r
h a lte n d er S u b s tra te a b h ä n g ig is t. U n te r ex
tre m e n B e d in g u n g e n m ag das w a h r sein, aber zu
H e ft 31. 1
24. 8. 1923J Northrop: Ist die Hydrol. der Eiweißk. Pepsin u Trypsin als homog. Reaktion aufzufassen ? 717
n ä c h st i s t
p ren tsch e id en d , w ie aus F ig . 5 zu e rse h e n is t, in w elcher der U m fa n g der V e r
d a u u n g von G e la tin e u n d von C asein in G egen
w a r t vo n N a- und von Ba-, von S O4- u n d von C l-Io n e n v erglichen w ird (9).
Loeb (10) h a t gezeigt, daß die p h y sik a lisc h e n E ig e n sc h a fte n der L ö su n g en se h r v e rsc h ied e n sin d in G eg en w art von m o n o v a len ten Io n e n im V ergleich m it d iv a le n te n Ionein, aber, w ie die A bbildung zeigt, is t d er U m fa n g d er V e rd a u u n g in b eiden F ä lle n gleich. E s is t d a h e r m it S ic h e r
h e it zu schließen, daß es sich in e r s te r L in ie um e in e W irk u n g d e r W asser sto ffio n e n k o n z e n tra tio n
u n d um eine chem ische W irk u n g h a n d e lt.
W e n n die R e a k tio n n ach d em gew öhnlichen G esetz d er L ö sungen aibläuft, m uß je d e S te ig e ru n g des G rades der R e a k tio n zw ischen dem E nzym u n d dem E iw eiß k ö rp e r zu eiiner Z u n ah m e
^ ccm
ff
IS
<\j
0 -Ge
X- lafineHCl
” HZ S04 pH 2 .£
pH 2,5 -t-Pepsit1
r|
Y
0v H n Z : C asein +Tbut1*7 tp H 7.
'pH 7,\
o s/n 3-6,2
-6,2
--- -
Y
X =Ja G e/at,Ba ”
n o tp H t pHb
8-6,2 6-6,2 + Tnytos/n
S tunden 0;Z5 0,50 0,75 1,00 Zerf
F ig . 5.
d e r „a k tiv e n “ K o n z e n tra tio n eiiner d e r beiden S u b stan z en f ü h re n . Michaelis (2) h a t gezeigt, daß die K u rv e , d ie m an von dem E in f lu ß von p tj a u f die W irk sa m k e it des E n zy m s e n tw e rfe n kann, m it d er D isso z iatio n sk u rv e sch w ach er B asen oder S ä u re n id e n tisc h ist. D a ra u s sc h lie ß t er, daß der E in flu ß d e r S ä u re d a rin b e ste h t, das E nzym zu io n is ie re n (oder eine V e rb in d u n g des E nzym s m it dem S u b s tra t) u n d d aß e n tw e d e r das Io n oder das u n d iss o z iie rte M olekül f ü r d ie R e a k tio n v e r
a n tw o rtlic h w ar. D a ra u s w ü rd e jed o ch folgen, daß d er E in flu ß von
p \\bei ein em b estim m ten E nzym g eg e n ü b er v e rsc h ied e n en S u b s tr a te n d e r selbe sein m ü ß te . E s w u rd e aber g ezeig t, daß im F a lle des P e p sin s u n d T ry p s in s d a s n ic h t d er F a ll ist, so n d e rn daß das z>n-Optimum m it dem E iw eiß k ö rp e r w echselt. M an m ü ß te fo lg lic h a n n eh m en , daß es f ü r je d en E iw e iß k ö rp e r ein b e
so n d e re s E n zy m g ib t; aber diese A n n ah m e is t n ic h t g e re c h tf e r tig t, d a d a f ü r je d e r B ew eis fe h lt.
PH h a t d a h e r v ie lm e h r E in flu ß a u f das S u b s tr a t
als a u f das E nzym . D as h ab e n a u c h A r r h e n i u s (1 ), E u le r ( 1 ) un d au c h R in g e r (12) angenom m en.
B e k a n n tlic h w ir k t P e p s in n u r i n s a u re r L ösung, T ry p s in dagegen n u r in schw ach a lk a lisch e r L ösung. A us d en A rb e ite n Loebs u n d a n d e re r i s t -auch b e k a n n t, daß die E iw eiß k ö rp e r in siaurer L ö su n g als sa u re Salze, in alk a lisc h e r L ösung als alk alisch e Salze v o rh a n d e n sind. E s is t k la r, daß m an u n te r d e r A n n a h m e , daß P e p sin m ehr oder w en ig e r sc h n ell m it p o sitiv e n P r o te in ion en u n d T ry p s in sc h n eller m it n e g a tiv e n P r o te in io n en re a g ie rt, q u a lita tiv d en b eo b a ch tete n T a t sachen g e re c h t w erd en k a n n . W e n n diese A n n ah m e w irk lic h r ic h tig ist, m uß je d o ch d e r U m fa n g der V e rd a u u n g eines E iw eiß k ö rp e rs in se in er A b h ä n g ig k e it vo n p\\ q u a n tita tiv m it der ebenso z u sta n d e gekom m enen K o n z e n tra tio n d er E iw e iß ionen ü b ere in stim m en . I n d er G egend zw ischen
H aem oglobin.
— - ... = T itra tio n sk u rv e . P u n k te rz G rad d e r H y d ro ly se .
G elatine.
11 — R elativ e K o n z e n tra tio n d e r io n is ie rten G elatin e salze.
P u n k te = G rad d e r H y d ro ly se . K asein.
= T itra tio n sk u rv e . P u n k te — G rad d e r H y d ro ly se .
Fig . 6.
dem iso elek trisch en P u n k t u n d dem P u n k t der g rö ß te n B in d u n g ze ig t die T itn a tio n s k u rv e d ir e k t die M enge des g eb ild eten E iw eißsalzes u n d k an n d ah er dazu v e rw a n d t w erd en , die M enge d e r P ro te in io n e n zu d e m o n strie re n . F ig . 6 (9) g ib t einen V erg le ich des a u f d ie sem W ege e rh a lte n e n io n is ie rte n E iw eiß k ö rp e rs m it dem U m fan g d er H y d ro ly se e in ig e r E iw eiß k ö rp e r d u rc h P e p sin .
D ie F ig . 6 zeigt, daß das p n -O p tim u m f ü r die v ersc h ied e n en E iw eiß k ö rp e r v ersc h ied e n is t u n d au sg ez eic h n et m it dem P u n k t d er m ax im alen S alz
b ild u n g ü b e re in stim m t. D ie F ig u r z e ig t au c h , daß d er G ra d der V e rd a u u n g e in M in im u m beim iso e le k trisö h en P u n k t d er E iw e iß k ö rp e r besitzt.
D ie Ü b erein stim m u n g zw ischen d e n K u rv e n is t b eim O asein h erv o rra g en d , b e i a n d e re n E iw eiß k ö rp e rn n u r a n n ä h e rn d . M e th o d isc h s in d jedoch m anche F e h le rq u e lle n v o rh a n d e n , u n d es is t
Nw. 1923.
93
718 Northrop: Ist die Hydrol.der Eiweißk.Pepsin u.Trypsin als homog.Reaktion aufzufassen? I D ie N a tu r- l W issen sch aften ,
le ich t m öglich, daß d ie U n stim m ig k e ite n n u r aut’
V e rsu c h s fe h le rn b eru h en . J e d e n fa lls zeigen die V ersu ch e, daß u n z w e ife lh a ft eilne fe s te B ezieh u n g zw ischen d er K o n z e n tra tio n d er E iw e iß io n e n und dem G ra d d er V e rd a u u n g der E iw eiß k ö rp e r be
ste h t. D ieses R e s u lta t is t d u rc h a u s zu e rw a rte n , da im allg em ein en d er G ra d der R e a k tio n ein es Io n s von dem G ra d e d er R e a k tio n ein es u n io n i- sie rte n M oleküls v e rsc h ied e n ist. Zu erw äh n en is t noch, daß d ie H y d ro ly se der G e la tin e d u rc h S ä u re n u n d A lk alien e rk e n n e n lä ß t, daß die un- io n is ie rte n M oleküle le ic h te r d u rc h d iese A gen- tie n a n g e g riffe n w erd en als d ie io n is ie rte n (15).
E i n f l u ß der Ä n d e r u n g der Substrailconzentration.
E s w ar zu e rw a rte n , daß d ie A n n ah m e , die E iw eiß k ö rp e r w ü rd e n d u rc h Io n is ie ru n g a n g r e if bar f ü r die E nzym e, d azu dien en k ö n n te , abnorm e W irk u n g e n der S u b s tra tk o n z e n tra tio n zu d e u ten , u n d das is t w en ig sten s zum T e il w a h r im F a lle des P e p sin s und: des E ie ra lb u m in s. E s w u rd e g efu n d e n , daß die Z u n ah m e im G ra d e d er V e r
d a u u n g m it zu n e h m e n d er E iw e iß k o n z e n tra tio n a n n ä h e rn d g le ich w ar m it d er Z u n ah m e d er P ro te in io n e n , w ie sie d u rc h L e itfä h ig k e its b e s tim m un g en e r m itte lt w urde, u n d daß diese Ü b e re in s tim m u n g besser w ar als d ie je n ig e m it d e r to ta le n E iw e iß k o n z e n tra tio n . B ei T ry p s in u n d G e la tin e (14) stim m t das n ic h t, u n d die A n o m alie is t h ie r n u r teilw eise ausgeglichen. D er G ra d der V e r
d a u u n g w äc h st viel la n g sam er als d ie G e la tin e k o n z e n tra tio n u n d is t von 3 % an f a s t u n a b h ä n g ig von ih r. D ieses V e rh a lte n w ird 'bei versch ied en en E n zy m en g e fu n d e n u n d w ird im allg em ein e n als
„ S ä ttig u n g “ des E nzym s m it dem S u b s tr a t au f- g efa ß t. H e n r i , Michaelis u n d va n SlyTce h ab en , au sg eh e n d vom M a ssen w irk u n g sg e setz , G lei
c h u n g e n ab g e le ite t, w elche m it den R e s u lta te n u n te r d er A n n ah m e ein er V e rb in d u n g zw ischen E n zy m u n d S u b s tra t ü b e re in stim m e n . E s sc h e in t jed o ch k ein d ire k te r B ew eis f ü r eine solche V e rb in d u n g v o rzu lieg en , uind es g ib t, so w eit ic h sehe, bei d er hom ogenen K a ta ly s e k e in e n Bew eis f ü r das V o rh a n d e n se in e in e r n ac h w eis
b a re n M enge e in e r solchen in te r m e d iä re n V e r b in d u n g . I n m anchen F ä lle n v o n W a s s e rs to ff
io n e n k a ta ly se is t es je d e n fa lls b ek a n n t, daß k ein e m eßbaren Q u a n titä te n von W a sse rsto ffio n e n irg e n d w a n n g ebunden w erden, obgleich d e r E in flu ß d er Z u n ah m e d er S u b s tra tk o n z e n tra tio n ab
no rm e R e s u lta te ta ts ä c h lic h b ei allen k a ta ly ti
schen R e a k tio n e n v e ru rs a c h t. E s is t ä u ß e rst w a h rsc h e in lic h , daß e in ig e T ypen in te r m e d iä r e r V e rb in d u n g e n bei allen 1 'k ata ly tisch e n R e a k tio n e n ex istie re n , w ie Falle (13) b e h a u p te t h a t. I n diesem F a lle is t n ic h t die F ra g e , ob e in e solche V e rb in d u n g e x is tie rt o der n ic h t, so n d e rn ob sie in g e n ü g e n d er M enge e x is tie rt, um f ü r die K in e tik d e r R e ak tio n als e n tsc h e id e n d e r F a k to r in F ra g e zu kom m en. E s is t h ä u f ig fe s tg e s te llt w o rd en , daß das S u b s tr a t das E n zy m vor Z e r
se tzu n g sc h ü tz t un d sich d a n n m it ih m v erb in d e t.
S obald m an jedoch das E nzym zum S u b s tra t z u fü g t, w ird das S u b s tr a t u n te r B ild u n g von S u b stan zen gespalten, w elche u n z w e ife lh a ft das Enzym schützen, un d d er beobachtete E in f lu ß b e ru h t nach m ein er A n sic h t a u f d iesen P ro d u k te n und n ic h t a u f dem S u b s tra t. D as w ird aus d e r T a t
sache entnom m en, daß G e la tin e p ra k tis c h in den e rste n zwei oder d re i M in u te n k e in e S ohutz- w irk u n g a u f T ry p s in a u s ü b t (8). D ie S c h u tz w irk u n g n im m t d a n n schnell zu. D as is t zu e r wartein, w enn die W irk u n g a u f den R e a k tio n s p ro d u k te n b e ru h t, w äh re n d die W irk u n g m it der Z e it im m er m ehr ab n eh m en m ü ß te, w enn es sich um ein e W irk u n g des S u b s tra te s se lb st h an d e ln w ürde.
Im e rste n T eile d ieser A rb e it w u rd e gezeigt,, daß die E x iste n z ein er V e rb in d u n g zw ischen dem E n zy m u n d d en H e m m u n g ssu b sta n z e n sehr g u t bew iesen ist. W enn das E nzym sich auch m it dem S u b s tr a t v e rb in d e n w ü rd e , m ü ß te das G le ic h g ew ich t zw ischen dem E n zy m u n d der P lem m ungs- sü b stan z d u rc h Z u n ah m e d e r S u 'b stra tk o n z e n tra - tio n b e e in flu ß t w erden. D as is t aus d e r fo lg e n d en G leich u n g e rm itte lt, w elche a n n im m t, daß das E nzym sich sowohl m it dem S u b s tr a t als auch m it d er H e m m u n g ssu b sta n z v e rb in d e t:
t -f- S u b s tra t E n zy m — S u b s tra t E nzym | Q--- >
l -f- H em m u n g ssu b st.^ i E nzym — H e m m u n g ssu b st.
B ei Z u n ah m e d er S ü b s tra tk o n z e n tra tio n m üßte das G leich g ew ich t sich in d er R ic h tu n g des großen P fe ile s v ersc h ieb e n , d. h. der E in f lu ß d er H e m m u n g ssu b sta n z m ü ß te g e rin g e r w erden.
D as is t je d o ch n ic h t d e r F a ll (14). D ie p ro ze n tu a le I n a k tiv ie r u n g e in e r k o n s ta n te n M enge T ry p s in bei e in e r k o n s ta n te n M enge H e m m u n g s
su b stan z w u rd e u n a b h ä n g ig von d e r S u b s tr a t
k o n z e n tra tio n b efu n d en .
D ie A n n ah m e e in e r E m izym -S ubstrat-V erbin- d u n g k a n n auch a u f an d e re m W ege bew iesen w e r
den. W en n das T ry p s in m it G e la tin e in e in e r g rö ß e re n K o n z e n tra tio n als 3 % g e s ä ttig t ist, k a n n es n ic h t zu derselben Z e it ein a n d e re s P ro te in h y d ro ly sie re n . Je d o c h w e n n C asein zu solch e in e r L ö su n g h in z u g e fü g t w ird , f in d e t m an, daß das C asein im g le ich e n G ra d e h y d ro ly s ie rt w ird , als w en n d ie G e la tin e n ic h t v o rh a n d e n w äre. M it a n d e re n W o rte n , d er G ra d d er H y d ro ly se e in e r L ö su n g von C asein u n d G ela tin e s c h re ite t im selben M aße vor, w enn beide R e a k tio n e n g e tr e n n t a u s g e fü h rt w erd en oder im gleichen G efäß e . D ieses R e s u lta t w ird in F ig . 7 u n d T a b e lle I I e r lä u te r t (14).
M an m uß n a tü rlic h die Z e ite n v e rg le ic h e n , w elche z u r S p a ltu n g e in e r g eg e b en e n M enge E iw eiß n o tw en d ig sind, u n d n ic h t d ie M engen, w elche in ein er gegebenen Z e it g e sp a lte n w erden, da sonst die M enge d e r g e b ild e te n H e m m u n g s
substanz in dem e in e n F alle g rö ß e r is t als in dem
ä n d e rn u n d in fo lg e d esse n d e r E in f lu ß a u f das
E nzym e in v e rsc h ie d e n e r ist. D ie obige M ethode
des B ew eises ein er K a ta ly s a to rv e rb in d u n g w u rd e
H eft 34. 1
24. 8. 1923J Northrop: Ist die Hydrol.der Eiweißk. Pepsin u. Trypsin als homog. Reaktion aufzufassen? 719
von H e n r i angewandt-, w elcher jed o ch v ersä u m te , zw ischen dem G ra d u n d dem U m fa n g der H y d ro lyse z u u n te rsc h e id e n .
0,4
'1 §4?
I?
^
/
Kn sein— — ---npJntine---
r'
0,5 1,0Z erf in Stunden
1,5
F ig . 7. V e rd a.u u n g sk u rv en fü r 4 % C a sein , 3 % G ela
t in e u n d e i n e r , M ischung, w elche sow ohl 3 % G e latin e w ie 4 % C asein bei d erselb en T ry p e in k o n z e n tra tio n
e n th ä lt.
T ab elle II.
G rad der H y d ro ly se v o n C asein, G ela tin e u n d einer M isch u n g vo n C asein u n d G ela tin e.
4 ccm d ia ly sie rte s T ry p sin w erd en zu je d e r L ö su n g b e i 34° C zugetan. 5 ccm P ro b e n w erd en n ach 0,10, 0,25, 0,50, 1,50 und 3 S tu n d en h erau sg e n o m m en u n d in 25 ccm W asser, w elche 10 ccm 0,20 n H C l e n th a lte n , getan.
2 ccm d iese r L ö su n g (äquivalent zu 0,33 ccm O rig in a l
lösung) w erd en au f Am ino-N n a ch v a n S ly k e a n aly siert.
Z unahm e Z eit, die n o tw en d ig ist, um eine Z unahm e des Am ino-X in d e r u n te r a an g eg eb en en
M enge zn b ew irk en
(a) C asein
lö su n g
G e latin e
lö su n g C asein -)- G elatin e
ccm Stunden Stunden Stunden
0,1 0,15 0,20 0,09
0,15 0,27 0,40 0,16
0,20 0,48 0,72 0,28
G rad d e r H y d ro ly se in 1
S tufe d er T S tu n d e n
neu R e ak tio n
C asein lö su n g
(b)
G e latin e lö su n g
(c)
C a sein -j- G elatine In
M isch u n g
G e tren n t (b + c)
0 - 0 ,1 0 6,7 5,0 11,1 11,7
0 - 0 ,1 5 3,7 2,5 6,2 6,2
0 —0,20 2,1 , 1,4 3,6 3,5
C asein lö su n g 4 g C asein in 100 ccm P h o sp h atp u ffer, M /10 e in g e ste llt au f p a 7,5. G e latin elö su n g 3,5 g G elatine in 100 ccm P h o sp h atp u ffer, p n 7,5. G elatine-C asein- L ösung 4 g C assin -f- 3,5 g G elatin e in 100 ccm P h o s p h a t
puffer wie oben, p n 7,5.
D er eben b eschriebene V ersuch z e ig t -schlüssig, d aß das E nzym sich n u r m it dem S u b s tr a t v e r
b i n d e t , w e n n m a n e in e z w e i t e A n n a h m e m a c h t , n ä m l i c h , d a ß z w e i E n z y m e v o r h a n d e n s i n d , j e e i n s f ü r j e d e s P r o t e i n , u n d d a ß d i e d u r c h je d e s E n z y m g e b il d e te n P r o d u k t e b e id e E n z y m e h e m m e n . B e i e i n e r s o r g f ä l t i g e n U n t e r s u c h u n g , d i e ü b e r d ie s e n P u n k t .a n g e s t e l l t w u r d e , k o n n t e n i c h t s g e f u n d e n w e r d e n , w a s d a f ü r s p r a c h , d a ß d i e L ö s u n g m e h r a ls e i n E n z y m e n t h ä l t . N a c h m e i n e r A n s i c h t b e s t e h t d a h e r k e in e V e r b i n d u n g z w is c h e n E n z y m u n d S u b s t r a t , u n d d a s a b n o r m e V e r h a l t e n b e i Z u n a h m e d e r S u b s t r a t k o n z e n t r a t i o n m u ß a u f e i n e E i g e n s c h a f t d e s S u b s t r a t e s s e lb s t z u r ü c k g e f ü h r t w e r d e n .
D e r M e c h a n i s m u s d e r P e p s i n - u n d T r y p s i n h y d r o l y s e , w ie e r h i e r e n t w i c k e l t w o r d e n i s t , f ü h r t z u d e m S c h l u ß , d a ß 'd ie R e a k t i o n d u r c h a u s n i c h t i m S i n n e d e r k l a s s i s c h e n D e f i n i t i o n k a t a l y t i s c h i s t , d a e in T e i l d e s E n z y m s n i c h t w i e d e r f r e i w i r d , s o n d e r n m i t e i n i g e n P r o d u k t e n v e r b u n d e n b le ib t. D i e R e a k t i o n k a n n f o l g e n d e r m a ß e n b e s c h r i e b e n w e r d e n :
E nzym -(- P ro te in -|- H 20 [E n zy m —P ro te in ]
E nzym —P e p to n E n zy m -f- P e p to n . P e p t o n w i r d e i n f a c h a n g e w a n d t a ls e i n a l l g e m e i n e r A u s d r u c k f ü r d ie P r o d u k t e d e r H y d r o ly s e d e s E iw e iß . W e n n d i e E n z y m - P e p t o n - V e r b i n d u n g v o l l s t ä n d i g u n d i s s o z i i e r t w ä r e , w ü r d e d ie R e a k t i o n e i n e e i n f a c h e b i m o l e k u l a r e s e in , d a f ü r j e d e s M o le k ü l d e s g e s p a l t e n e n S u b s t r a t s e in E n z y m m o le k ü l v e r s c h w in d e n w ü r d e . W e n n d ie V e r b i n d u n g v o l l s t ä n d i g d i s s o z i i e r t w ä r e , w ü r d e d ie R e a k t i o n m o n o m o l e k u la r s e in , d a d i e K o n z e n t r a t i o n d e s E n z y m s s i c h n i c h t ä n d e r n w ü r d e . I n W i r k l i c h k e i t l i e g t d ie R e a k t i o n i n d e r M i t t e u n d s t i m m t d a h e r w e d e r m i t d e r m o n o m o l e k u la r e n n o c h m i t d e r b i m o l e k u l a r e n F o r m e l ü b e r e i n . D a d a s E n z y m z u m m i n d e s t e n e in e V e r b i n d u n g m it e i n i g e n P r o d u k t e n b i l d e t , so m u ß d e r G l e ic h g e w i c h t s p u n k t d e r R e a k t i o n d a v o n b e e i n f l u ß t w e r d e n .
( ü b e r s e t z t v o n M a r t i n -Jacoby ( B e r l i n ) . L ite r a tu r .
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720 Stoll: Uber Mutterkorn. [ Die Natur- Lwissenschafteß
Über Mutterkorn.
Von A. Stoll, Basel.
(Schluß.)
f*) D ie pharm akologische U n te r s u c h u n g des
E rg o ta m in s.
N ac h d em das E rg o ta m in in r e in e r F o rm , als w ohl d e f in ie r te r k r is ta llis ie r te r K ö rp e r vorlag, w ar n a tü rlic h d ie e rs te u n d w ic h tig ste F ra g e , ob ih m in k le in e n D osen d ie f ü r M u tte r k o rn c h a ra k te ris tis c h e k r ä f tig e u n d la n g a n h a lte n d e k o n tr a h ie re n d e W irk u n g a u f den U te ru s u n d d ie a n d e re n p h arm ak o lo g isch en M erkm ale zu k o m m e n ; des w eite re n , ob bei V e ra b re ic h u n g g rö ß e re r D osen bei d e n V e rs u c h s tie re n die to x isch e n E r sc h e in u n g e n a u f tr e te n , d ie bei M u tte r k e r n v e r g if tu n g e n b eo b a ch tet w erden. D ie p h arm a k o lo g isc h e W irikung des E rg o ta m in s w u rd e z u e rs t von K . S p ir o 30), d a n n h a u p tsä c h lic h von E . B o t h l i n 31) u n d von H . H . Dale u n d K . S p ir o 32) in g r ü n d lic h e n A rb e ite n s tu d ie rt. E s zeig te sich z u n ä c h s t bei den V ersu ch e n am is o lie rte n U te ru s, d aß dem E rg o ta m in ein e a u ß e ro rd e n tlic h sta rk e p h arm a k o - dy n a m ische W irk u n g zukom m t.
Z u r P r ü f u n g u te ru s e rre g e n d e r M itte l, soge
n a n n te r W e h e n m itte l am ü b erleb en d en iso lie rte n O rg a n n a c h d e r M ethode von M a g n u s - K e h r e r w ird b e k a n n tlic h e in U te ru s s tü c k au s dem n a r k o tis ie r te n T ie r, g ew öhnlich ein em M eerschw einchen, h e ra u s g e s c h n itte n u n d in R in g e rsc h e r oder T y ro d e sc h er N ä h rlö su n g von 3 8 ° zw ischen zwei H ä k c h e n d e r a r t e in g esp a n n t, daß e in E n d e des O rg a n s f e s t bleibt, w äh ren d d a s f re ie - E n d e d u rc h das zw eite H ä k c h e n m it einem H eb e l w erk in V e r
b in d u n g s te h t, das jed e V e rk ü rz u n g oder V e r
lä n g e ru n g des M u sk e lstre ife n s a u f ein er la n g sam ro tie re n d e n b e ru ß te n T ro m m el a u fz e ic h n e t. D ie z u u n te rs u c h e n d e S u b stan z s e tz t m an d er N ä h r lö su n g , in d er das O rg a n bei S a u e r s to f fz u f u h r stu n d e n la n g w eiterleb t, zu, D a d as. V olu m en des B ades b e k a n n t ist, so k a n n m an le ic h t d ie V e r d ü n n u n g fe stste lle n , in d er d er zu g e se tzte S to ff g era d e noch w irk t. D iese m axim ale n o ch eben w irk sam e V e rd ü n n u n g b e trä g t f ü r w e in sa u re s E rg o ta m in bei V e rw en d u n g ein es e m p fin d lic h e n M e ersch w e in ch e n u teru s, w ie H . H . D ale u n d K . S p iro u n d a u c h E. B o t h l i n k ü rz lic h .gefunden haben, b is 1 : 125 M illionen. D ie p h y siologische R e a k tio n is t viel e m p fin d lic h e r als irg e n d e in e chem ische R e a k tio n des E rg o ta m in s.
D as A lk alo id z e ig t au ch die f ü r M u tte rk o rn c h a ra k te ris tis c h e la n g e D a u e r d er W irk u n g . D ie
1) D ie w irk s a m e n B e s ta n d te ile des M u tte rk o rn e , a) Ä lte re A rb e ite n , b) D ie n e u ere n A rb e ite n (E rg o tin in , E rg o to x in , T y ra m in , H is ta m in ), c) D ie Is o lie r u n g d es E rg o ta m in e , d) D ie E ig e n s c h a fte n des E r g o ta m in e . e) V orkom m en d er M u tte r k o r n alk alo id e.
30) K . S p iro , Schweiz. Med. W o ch en sch r. 1921, N r. 32, S. 737, s. auch ebenda 1921, N r. 23, S. 525.
31) E . R o th lin , Schweiz. M ed. W o ch e n sch r. 1922, N r. 40, S . 978— 981, fe rn e r K lin . W o ch en sch r. 1922, N r. 46 u . 47, S. 2294; A rch. i n te r n a t. de P h a rm ac o - d y n a m ie e t de T h e ra p ie 27, 459, 1923.
32) H. H. D ale u. K . S p iro , A rc h . f. exp. P a th . u.
P h a rm a k o l. 95, 337, 1922.
Z ah l d er a u f d en iso lie rte n U te ru s k o n tra h ie re n d w irk e n d e n S to ffe i s t b e k a n n tlic h se h r groß. Das,, w ie e rw ä h n t, in M u tte rk o rn e x tra k te n n a c h g ew ie
sene H is ta m in w ir k t ebenfalls! i n se h r g ro ß e r V e r
d ü n n u n g , u n d doch h a t K . S p ir o g ezeigt, daß g era d e dieser S to ff m it d e r e ig e n tlic h e n M u tte r- k o rn w irk u n g n ic h ts zu tu n h a t. H is ta m in w ir k t rasc h e r, aber viel k ü rz e r als E rg o ta m in u n d e r z e u g t auCh in k lin isc h e n D osen K ra m p f d e r g la tte n M u sk u la tu r, d. h. es h e b t d ie norm ale- W e h e n tä tig k e it, die in abw echselnder S p a n n u n g u n d E rs c h la ffu n g des U te ru sm u s k e ls b este h t, au f.
E rg o ta m in w irk t lan g sam er, in k le in e n D osen m an ch m al e r s t n ach e in ig e n M in u te n , h a t aber die W irk u n g ein m al ein g ese tzt, so h ä l t sie au c h nach dem E n tf e r n e n des A lk alo id es d u rc h w ie d e r
h o ltes W echseln der N ä h rlö su n g o f t s tu n d e n la n g an, die rh y th m isc h e n K o n tra k tio n e n k e h re n im m er w ieder. E r s t stä rk e re D osen erz eu g en so g e n a n n te D a u e rk o n tra k tio n e n ( T e ta n u s u te ri).
72 73 7H- 75 -76 77 70 20 27 22 23 2V 25
iiiiillH ll]lllliiiiiiililliii!iliiliiiiilill]iiiiiiiiilim iiiiiliiiiiiiii[iiiii! iiiliin i!iiiliiiiiiiiim iiim iliiii]iiii]n n iiiiiii
F ig . 2. Zum V erg leich der W ir k u n g von H is ta m in ( - - - - ) u n d von E rigotaanin (--- ) a u f d en is o lie rte n
M eer sch w ei n chen u t e r u s .
I n d er F ig . 2 sind zwei K u rv e n , w ie sie ein ü b erle b en d e r iso lie rte r M e er.se hw ein chen u te r u b gesch rieb e n h a t, so a u fe in a n d e r g e le g t, daß die Z e itp u n k te des Z usatzes von H is ta m in bzw.
E rg o ta m in
Z u s a m m e n tr e f f e n .I n W irk lic h k e it w u rd e e rs t d ie H is ta m in k u r v e u n d in einem sp ä te
re n Z e itin te rv a ll d ie E rg o ta m in k u rv e a u fg e n o m m en. D ie ste ile p u n k tie r te K u rv e s te llt die "W ir
k u n g von H is ta m in d a r. A u f Z u satz d es H is ta m in s bei o e rfo lg te au g en b lic k lic h e K o n tr a k tio n , b e i
aw u rd e die N ä h rlö su n g gew echselt, w as s o fo r
tig e s A b fa lle n des M uskeltonus a u f d ie f r ü h e re S p a n n u n g zu r F olge h a tte . D ie ausgezogene K u rv e s te llt ein e typische U te ru s k u rv e n a c h E r g o t
a m in z u sa tz dar. B ei o se tz te m a n E r g o ta m in zu.
N ac h e in ig er Z eit (die S tr ic h e d er Z e itsk a la be
d eu ten je f ü n f S e k u n d e n ) b e g in n t ein e allm ä h lic h k r ä f tig e r w erd en d e T o n u s s te ig e ru n g , die bald in rh y th m isc h sich w ied e rh o len d e K o n tr a k tio n e n ü b e rg e h t, bei bx u n d b2 w u rd e w ie d e rh o lt au sg e
w asc h en ; die W irk u n g a u f d e n U te ru s h ie lt in
diesem V e rsu c h (in der F ig u r n ic h t m e h r d a r
g e s te llt) tro tz d e m stu n d e n la n g a n ; e r s t e in Z u
H e ft 34. 1
.24. 8. 1923J Stoll: Uber Mutterkorn. 721
Fig. 3. W irkung von E rgotam in auf den graviden Uterus in situ (obere K uive) und den K arotk - Blutdruck» (untere Kurve) beim Kaninchen.
satz von P a p a v e rin v erm o c h te die K o n tra k tio n aufzuheben.
Ä hn lich e U te ru s k o n tra k tio n e n b e w irk t das E rg o ta m in in F o rm seines w asserlö slich en , w ein-
F ig . 4 a. S te ig e r u n g d as K a ro ti s-B lu t-d r u ckes beim H u n d m it A d re n a lin v o r d e r I n je k tio n von E rg o ta m in .
s a u re n Salzes, des G ynergens, bei d e r A n w en d u n g am ganzen T ie r. F ig . 3 s te llt e in K u rv e n d ia g ra m m diar, das e in e r A rb e it von E. R o t h l i n 33) en tn o m m en ist. E in e m g ra v id e n m itte lg ro ß e n K a n in c h e n in U re th a n n a rk o s e w u rd e n 0,5 m g E r g o t a m i n ta r tr a t in tra v e n ö s in jiz ie rt. D ie T e il
stric h e d er u n te n an g e b ra c h te n Z e itsk a la b edeu
te n S ek u n d en . I n d er oberen K u rv e sind die B e
w eg u n g e n des g ra v id e n U te r u s in s itu r e g is tr ie r t:
N ach e in e r L a te n z z e it von 16 S e k u n d en n ach der bei f e rfo lg te n I n je k tio n b e g in n t d e r U te ru s eine k r ä ftig e u n d a n h a lte n d e W e h e n tä tig k e it. D ie d a r u n te r lie g en d e K u rv e z e ig t den K a ro tis b lu t- d ru ck , d er so fo rt n ach der I n je k tio n schw ach a n s te ig t und a u f dem e rre ic h te n N iv ea u lä n g ere Z e it v e rh a rrt.
F ig . 4 b. S e n k u n g des K a ro tis -B lu td ru c k e s beim H u n d m it A d re n a lin nach d er I n je k tio n von E rg o ta m in .
N ach d em diese w ic h tig s te physiologische R e a k tio n des E rg o ta m in s, d ie k rä f tig e W irk u n g k le in ste r D osen a u f den tie ris c h e n J J t e r u s fe s tg e s te llt w ar, h a t E. R o t h l i n 34) u n te rs u c n t, in w ie w e it dem E rg o ta m in auch die a n d e re n dem M u tte r k o rn ge
le g e n tlic h zugeschriebenen p h a rm a k o lo g isc h en u n d toxikologischen E ig e n s c h a fte n innew ohnen.
D ie A n w en d u n g so g e n a n n te r physiologischer D osen, d. h. k le in er M en g en von E rg o ta m in ,
33) Loc. cit. S4) Loc. cit.
722 Stoll: Uber Mutterkorn. T D ie N a tu r - L w issen sc lia fte n
erg ab au c h bei a n d e re n n a rk o tis ie rte n T ie re n wie H u n d u n d K a tz e in D osen von 0,1 b is 0,5 mg p ro K ilo g ra m m reg elm äß ig eine erh e b lic h e B l u t
d ru c k s te ig e ru n g . P u lsv e rla n g sa m u n g t r i t t bei K a n in c h e n , H u n d u n d K atze bei g rö ß e re n D osen e in , doch b le ib t d er P u ls auch n a c h 1,0 bis 1,5 mg p ro K ilo g ra m m T ie r regelm äßig, d er B lu td ru c k a u f se in er a n fä n g lic h e n H ö h e. D ie A tm u n g w ird d u rc h k le in e M engen E rg o ta m in k a u m b e e in flu ß t.
D agegen zeigt E rg o ta m in die von I I. I I. Dale b eim E rg o to x in en td ec k te S y m p a th ic u slä h m u n g m it n ac h fo lg en d e r sog. A d re n a lin u m k e h r. D ie F ig . 4 a zeigt die S te ig e r u n g des K a ro tis b lu t- d ru ck s beim H u n d n a c h der In je k tio n von 0,05 mg A d re n a lin vor der I n je k tio n von E rg o ta m in , die F ig . 4 b z e ig td ie 131 u 1 d ru e k s e n k u n g d u rc h dieselbe A d re n alin m en g e nach e rfo lg te r E r g o ta m in in je k tio n .
A u ch die bei M u tte rk o rn v e rg iftu n g e n , z. B.
bei M u tte rk o rn e p id e m ie n , am M enschen beob
a c h te te n toxischen E rs c h e in u n g e n , w ie K rä m p fe
F ig . 5. G a n g rä n des H ahnen,kam m eg n a ch V e ra b re ic h u n g von E rg o ta m in (nach D ale u n d S p iro ).
u n d G a n g rä n , k o n n te E. B o t h l i n w en ig sten s an gew issen T ie re n beobachten, w enn g ro ß e D osen, z. B. das 360fache der f ü r ein e p h y siologische W irk u n g e rfo rd e rlic h e n M enge a n g e w an d t w u r den. T oxische E rg o ta m in d o se n b ew irken sowohl
•bei d er w eißen R a tte w ie beim K a n in c h e n , d er K a tz e un d dem M eerschw einchen K o n tra k tio n e n d e r E x tre m itä te n , die n a m e n tlic h bei le tz te re m le ic h t in allgem eine K rä m p fe ü b erg eh en . B eim H a h n b ew irken schon ein ig e m g E rg o ta m in pro kg, p a re n te r a l v e ra b re ic h t, neben a n d e re n to x i
schen E rs c h e in u n g e n Cyanose des K am m es u n d d er B a rtla p p e n m it n a c h fo lg e n d e r G a n g rä n d er K am m zacken. D ie F ig u r 5 ze ig t ein e von H . H . Dale a u f genom m ene P h o to g ra p h ie 35), a u f d er d ie G a n g rä n der K am m zacken d u rc h d u n k le re F ä r b u n g d e u tlic h in E rs c h e in u n g t r i t t . Bei d e r R a tte k a n n d u rc h E rg o ta m in G a n g rä n und A b lösung des Schw änzendes b ew irk t w erden.
35) H. H. Dale u. K . S p iro , A rch. f. exp. P a tli. u.
P h a rm . 95, 348, 1923.
E n tg e g e n d er bis in die n eu e ste Z eit h in e in v e rb re ite te n A n sic h t, daß die versch ied en en W i r k u n g en des M u tte rk o rn s, w ie U te ru s k o n tra k tio n , B lu td ru c k ste ig e ru n g , g a n g rä n ö se r u n d k o n v u l
siver E rg o tism u s, v erschiedenen in d e r D roge e n t
h a lte n e n S ubstanzen zu zu sch reib en seien, k o n n te also tie re x p e rim e n te ll m it E rg o ta m in gezeigt w erden, daß ein e ein zig e schön k ris ta llis ie r e n d e S u b stan z alle diese S ym ptom e h e rv o rz u b rin g e n verm ag.
D en T oxikologen d ü r fte noch in te re ssie re n , daß d ie v ersch ied en en T ie r a r te n g eg e n ü b er E r g o t
am in sehr v ersch ied en re s is te n t sind. W ä h re n d n ach V ersu ch en von E. B o t h l i n 36) beim F ro sc h 0,033 mg pro g su b e u tan , beim K a n in c h e n 7 mg pro kg in tra v e n ö s un d beim H a h n 4 m g p ro kg in tra m u s k u lä r le ta l w irk en , bleiben R a tte n n a c h 100 mg E rg o ta m in pro kg, su b e u ta n v e ra b re ic h t, M eerschw einchen n ach 36 mg pro kg in tra v e n ö s am Lehen.
M anche B e obachtung, d ie K: Sp iro u n d sp ä ter E. B o t h l i n bei der ph arm o k o lo g isch en U n te r su c h u n g des E rg o ta m in s m a ch te n , h a tte I I. II.
D ale37), w enn au ch — der abw eichenden ä lte re n V e rsu c'h sa n o rd n u n g en tsp re ch e n d — in etw as a n d erer F o rm b e re its bei d er U n te rs u c h u n g des E rg o to x in s gem acht. I n n e u e ste r Z e it haben n u n I I. I I. Dale u n d K . S p i r o 38) E rg o to x in u n d E r g o t
am in d ire k t m ite in a n d e r v e rg lic h e n un d bei d er W irk u n g am T ie r so w eitg eh e n d e Ü b e re in s tim m ung g efu n d e n , daß d ie beid en A u to re n E rg o to x in u n d E rg o ta m in in ih re r W irk u n g q u a lita tiv u n d q u a n tita tiv f ü r id e n tisc h h a lte n , obsclion die beiden A lkaloide chem isch u n d p h y sik alisch zw eifellos v ersc h ied e n sind. W en n n u n a u c h d er p harm ak o lo g isch e u n d toxik o lo g isch e V erg le ich zw ischen E rg o to x in u n d E rg o ta m in n ic h t e r schöpfend d u r c h g e fü h r t ist, so d ü r f te doch d ie w eitg eh en d e Ü b ere in stim m u n g in d er W irk u n g der b eiden M u tte rk o rn b a se n am T ie r, die von E. B o t h l i n in e in e r noch u n v e rö ffe n tlic h te n U n te rs u c h u n g b e s tä tig t w u rd e, es w a h rsc h e in lic h m achen, daß E rg o to x in u n d E rg o ta m in au c h im k lin isc h e n V ersuch am M enschen ä h n lic h w irken w ü rd e n . P ra k tis c h ist- dieser k lin isch e V erg le ich 'bis h e u te noch n ic h t d u rc h g e fü h rt.
W ä h re n d K r a f t , w ie oben e rw ä h n t, vor d er V erw endung von A lk alo id en wie E rg o to x in u n d E rg o ta m in d rin g e n d w arn te , so schrieben C
t. B ä r get- u n d H . I I. Dale dem E rg o to x in in ih re n f rü h e re n A rb e ite n ein e gewisse B e d e u tu n g bei d er M u tte rk o rn w irk u n g zu, ohne jedoch die F r a g e zu stellen , ob dem E rg o to x in die E ig e n s c h a fte n inne- w ohnen, d ie es als B ein su b sta n z b e fä h ig e n , alle die th e ra p e u tisc h e n W irk u n g e n h e rv o rz u b rin g e n , die d e r A rz t k lin isch von g u te r M u tte r k o rn w ir k u n g zu sehen gew ohnt is t. E s f e h lt beim E rg o toxin a u c h der q u a n tita tiv e V erg le ic h zw ischen
38) E. R o th lin , Schw eiz. Med. W oehenöchr. 1922, N r. 40.. S. 978 u. ff.
37) Loc. eit.
3S) II. II. Dale u. K. S p iro , A rch . f. exp. P a th . u.
P h a rm a k o l. 95, 337, 1923.
