(a) 4CinP (b) 4CinP
Rysunek 2.10: Widok z boku na układ CinP zaraz po zbudowaniu (a) oraz po zrównoważeniu (b).
Cząsteczki POPC i cholesterolu wyróżniono kolorem zielonym i żółtym. Atomy tlenu, azotu, fosforu i wodoru wyróżniono kolorami: czerwonym, niebieskim, pomarańczowym i białym. Cząsteczki wody oraz niepolarne atomy wodoru zostały ukryte w celu zwiększenia przejrzystości ilustracji.
8 zewnętrznych segmentów zawiera mieszaninę POPC i cholesterolu w stosunku 1:1, natomiast środkowy segment domenę czysto cholesterolową CBD.
Dwuwarstwa 4CinP została skonstruowana poprzez rozmieszczenie czterech domen CBD w płaszczyźnie i rozdzielenie ich jednolitą mieszaniną POPC i cholesterolu w stosunku 1:1.
Cztery domeny CBD otrzymano poprzez odseparowanie 24 lipidów z dwuwarstwy Chol2, na-tomiast otaczającą je domenę POPC-Chol50 zbudowano z pojedynczych cząsteczek lipidów rozmieszczonych w płaszczyźnie. Łącznie dwuwarstwa 4CinP zawiera 480 lipidów: 288 cząste-czek cholesterolu i 192 cząsteczki POPC.
2.3 Definicja parametrów błonowych wyznaczanych w pracy
Średnie pole powierzchni przypadające na lipid AL jest parametrem strukturalnym, któ-ry w przypadku dwuwarstw jednoskładnikowych wyznaczany jest przez podzielenie po-wierzchni pudełka symulacyjnego w płaszczyźnie dwuwarstwy przez liczbę lipidów miesz-czących się w pojedynczym listku dwuwarstwy. Dla dwuwarstwy zbudowanej z różnych lipidów wyznaczenie AL dla danego typu lipidu jest trudne (Edholm i Nagle, 2005). W przypadku dwuwarstw zbudowanych z jednego typu fosfolipidu i cholesterolu często sto-sowanym podejściem jest założenie stałej powierzchni przypadającej na cząsteczkę cho-lesterolu w dwuwarstwie (Pasenkiewicz-Gierula i inni, 2000; Róg i Pasenkiewicz-Gierula, 2001). Takie podejście ma uzasadnienie w sztywnej strukturze cholesterolu i zostało
wy-48 2. Materiały i metody korzystane w przedstawianej pracy.
Wartość parametru ALcharakteryzuje dwuwarstwę i zależy od jej składu cząsteczkowego, uwodnienia, temperatury i ciśnienia. Zauważono, że wartość AL jest skorelowana z prze-puszczalnością błony (Nagle i inni, 2008). Większe AL oznacza większą dynamikę lipidów i większe prawdopodobieństwo powstawania wolnych przestrzeni dostępnych dla dyfundu-jących cząsteczek.
Oprócz parametru AL, w pracy wykorzystywany jest również parametr Abox, który oznacza uśrednione pole powierzchni dwuwarstwy w pudełku symulacyjnym.
Grubość dwuwarstwy d również zależy od jej składu lipidowego. Wpływa na nią długość i stopień nasycenia łańcuchów węglowodorowych oraz wielkość głowy polarnej lipidu. Im bardziej uporządkowane są łańcuchy fosfolipidowe, tym grubość dwuwarstwy jest większa.
Odstępstwem jest faza żelowa, w której grubość może być zmniejszona gdy lipidy nie są ustawione prostopadle do płaszczyzny błony lecz nachylone, tak jak w przypadku bezwod-nego kryształu cholesterolu (Shieh i inni, 1977). Grubość dwuwarstwy można zdefiniować na wiele sposobów, biorąc pod uwagę odległość między średnim położeniem danego typu atomu w pierwszym i drugim listku dwuwarstwy. W tej pracy brane są pod uwagę dwa rodzaje atomów przy określaniu grubości dwuwarstw. Są to atomy: fosforu reszty kwasu fosforowego dla POPC (oznaczane jako dP P) oraz węgla C3 przy grupie hydroksylowej cholesterolu (oznaczane jako dCC).
Profile gęstości masy opisują uśrednioną wartość gęstości danego typu atomu lub grupy ato-mów w funkcji położenia. W układach błon lipidowych profile gęstości wyznaczane są w osi Z, prostopadłej do płaszczyzny błony.
Kąt nachylenia cząsteczki lub jej fragmentu definiowany jest jako kąt między wektorem normalnymÐ→
N do dwuwarstwy a wektorem Ð→ABłączącym dwa wybrane atomy w cząsteczce (A i B). W przedstawianej pracy wykorzystano grupę kątów nachylenia, przedstawionych na rysunku 2.11.
Nachylenie łańcuchów węglowodorowych POPC opisywane jest przez 4 różne kąty na-chylenia. Pierwsze dwa, to kąty nachylenia θ - między wektorem Ð→
N a wektorem między trzecim (C23, C33) i ostatnim atomem węgla (C218, C316) w łańcuchach węglowodorowych POPC. Są to kąty: θOLE dla łańcucha OLE POPC (∡Ð→
NÐÐÐÐ→C23C218) oraz θP ALdla łańcucha PAL POPC (∡Ð→
NÐÐÐÐ→
C33C316). W przypadku łańcucha OLE POPC, w pracy uwzględniono również nachylenie górnego (kąt θOLEδ,∡Ð→
NÐÐÐÐ→C23C29) i dolnego (kąt θOLEω,∡Ð→
NÐÐÐÐÐ→C210C218) fragmentu łańcucha (powyżej i poniżej wiązania podwójnego) względem normalnej dwu-warstwy.
Kolejnym kątem nachylania dla cząsteczki POPC jest kąt nachylenia głowy fosfolipidu θP N, który odpowiada kątowi między wektoremÐ→
N a wektorem między atomem fosforu P i azotu N POPC.
2.3. Definicja parametrów błonowych wyznaczanych w pracy 49
(a) Cholesterol (b) POPC
Rysunek 2.11:Definicja kątów nachylenia dla cząsteczki cholesterolu (a) i POPC (b), które wykorzysta-no w pracy. Wektor wykorzysta-normalny do dwuwarstwyÐ→
N przedstawiony jest na ilustracjach za pomocą czarnego wektora. Atomy węgla, azotu, potasu i węgla przedstawiono za pomocą czarnych, niebieskich, poma-rańczowych i czarnych sfer. Większość atomów wodoru została ukryta w calu zwiększenia przejrzystości ilustracji, wyjątkiem jest pojedynczy atom wodoru grupy hydroksylowej cholesterolu.
50 2. Materiały i metody Dla cząsteczki cholesterolu brano pod uwagę dwa kąty nachylenia, opisujące nachylenie grupy steroidowej - θChol1 (∡Ð→
NÐÐÐ→C3C17) i łańcucha węglowodorowego cholesterolu - θChol2
(∡Ð→
NÐÐÐÐ→C17C25) względem normalnej dwuwarstwy (rys. 2.11a). Wszystkie wspomniane kąty opisują uporządkowanie dwuwarstw lipidowych, zwykle im większa jest ich wartość, tym mniejsze jest uporządkowanie. Wyjątkiem jest faza żelowa, w której lipidy dwuwarstwy mogą posiadać wypadkowy kąt nachylenia różny od zera.
Kąt azymutalny został wykorzystany w pracy do opisu orientacji cząsteczek cholesterolu lub głowy polarnej POPC w płaszczyźnie dwuwarstwy fosfolipidowej.
Kąt azymutalny dla cholesterolu φChol wyznaczany jest w oparciu o rzut wektora ÐÐÐÐ→C13C18 na płaszczyznę XY, liczony względem osi X (rys. 2.12b). Wektor ÐÐÐÐ→C13C18 łączy atom wę-gla C13 grupy steroidowej i atom węwę-gla C18 grupy metylowej i jest on prostopadły do płaszczyzny grupy steroidowej. Z kolei kąt azymutalny dla głowy polarnej POPC φP N
wyznaczany jest w oparciu o rzut wektora ÐÐ→P N, łączącego atom fosforu P i azotu N, na płaszczyznę XY, jest on liczony względem osi X.
Molekularny parametr uporządkowania Smol jest parametrem mówiącym o lokalnym upo-rządkowaniu łańcuchów węglowodorowych. Opisuje on odchylenie od stanu, gdy łańcuchy węglowodorowe są uporządkowane (w konformacji trans) i prostopadłe do powierzchni błony. Parametr Smol jest wielkością charakteryzującą błonę, którą można wyznaczyć na podstawie analizy symulacji dynamiki molekularnej i porównać z wynikami ekspe-rymentalnymi. Dlatego też, parametr ten jest często wykorzystywany podczas walidacji i kalibracji symulacji dynamiki molekularnej (Vermeer i inni, 2007). Eksperymentalnie wartość parametru Smol uzyskiwana jest z eksperymentów spektroskopii rezonansu ma-gnetycznego H2NMR oraz spektroskopii EPR znaczników spinowych.
Parametr Smol opisany jest równaniem
Smol= 1
2 < 3cos2θi− 1 >t,mol, (2.6) gdzie kąt θ, w przypadku atomów węgla o hybrydyzacji sp3, oznacza kąt między nor-malną błony a wektorem normalnym płaszczyzny wyznaczonej przez dwa wektory C-H (rys. 2.12a). W przypadku hybrydyzacji sp2 atomów węgla tworzących wiązania podwój-ne, kąt θ jest kątem między wektorem normalnym błony i wektorem normalnym do wek-tora C-H, leżącego w płaszczyźnie definiowanej przez wiązanie podwójne i atom wodoru związany z rozpatrywanym atomem węgla (rys. 2.12a) (Pearce i Harvey, 1993). Wyzna-czona wartość parametru Smol dla segmentu i średniowana jest po czasie t i cząsteczkach mol.
Parametr średniej szorstkości RP (ang. roughness parameter) powierzchni błony
charak-2.3. Definicja parametrów błonowych wyznaczanych w pracy 51
(a) Definicja kątów θ na podstawie których wyzna-czany jest parametr Smol
(b) Kąt azymutalny φChol (c) Kąty opisujące rotację prosto-padłą θ i kąt φC3C17 cholesterolu
Rysunek 2.12: (a) Definicja kątów θ wykorzystanych do obliczenia parametru Smol zgodnie z równa-niem 2.6 przy hybrydyzacji atomów węgla sp3 i sp2. (b) Definicja kąta azymutalnego φChol(α) opisującego rotację równoległą cholesterolu. (c) Definicja kąta θ opisującego rotację prostopadłą oraz kąta φC3C17, który opisuje precesję wektora ÐÐÐ→C3C17w płaszczyźnie błony.
teryzuje gładkość tej powierzchni. Jest on definiowany przez wzór:
RP = 1 n
n i=1∑
∣zi− ¯z∣, (2.7)
gdzie zi jest współrzędną Z i-tego atomu ze zbioru atomów definiujących powierzchnię błony, a ¯z - średnią po wszystkich atomach w zbiorze. (Gadelmawla i inni, 2002)
Izomeryzacja trans-gauche obserwowana jest w łańcuchach węglowodorowych dla pojedyn-czych wiązań między atomami węgla. W wyniku obrotu wokół tych wiązań zachodzą przejścia między stanami trans i gauche, gdzie wartości kąta torsyjnego są równe odpo-wiednio: 180○ i ±60○. Ze względu na istniejące zawady przestrzenne, konformacje trans i gauchenie są tak samo korzystne energetycznie.
Średnie przesunięcie kwadratowe MSD określa na jaką średnią odległość przesunie się cząsteczka błądząca przypadkowo w czasie t. Parametr MSD definiowany jest przez wzór:
M SD(t) =< ∣r(t0) − r(t0+ t)∣2>t0,mol, (2.8)
52 2. Materiały i metody gdzie r(t0) i r(t0+ t) są położeniem wyjściowym i położeniem po czasie t. Na podstawie rozkładu pojedynczych krzywych MSD wyznaczany jest błąd oszacowania, równy szero-kości rozkładu tych krzywych, zgodnie z pracą Knellera (Kneller i inni, 2011)
Współczynnik dyfuzji dla cząsteczek tlenu D wyznaczany jest w oparciu o regresję linio-wą krzywej MSD zgodnie z jednym z poniższych wzorów:
M SD(t) = 4DXYt+ 2σ2, (2.9)
M SD(t) = 6DXY Zt+ 2σ2, (2.10) gdzie DXY jest współczynnikiem dyfuzji (Martin i inni, 2002). W celu oszacowania błędu estymacji współczynnika dyfuzji D wykorzystano w pracy metodę polegającą na podzie-leniu krzywej MSD na dwie równe części i wyznaczeniu współczynnika dyfuzji dla nich.
Różnica w wartości uzyskanej dla pierwszej i drugiej połówki traktowana jest jako błąd oszacowania (Spoel i inni, 2006)
Funkcja autokorelacji rotacyjnej RAF opisująca zmiany orientacyjne cząsteczek, definio-wana jest przez poniższy wzór:
RAF(t) = < ∣v(t0)v(t0+ t)∣ >t0,mol
< ∣v(t0)∣∣v(t0+ t)∣ >t0,mol
, (2.11)
gdzie v(t0) odpowiada zwrotowi wektora w czasie początkowym t0, a v(t0+ t) zwrotowi wektora po czasie t. Funkcja autokorelacji rotacyjnej w tej pracy wykorzystywana jest do opisu rotacyjnej mobilności cząsteczek cholesterolu. Brane są pod uwagę ruchy trzech wektorów.
Pierwszym obserwowanym ruchem jest rotacja równoległa, która oznacza obrót wokół długiej osi cząsteczki cholesterolu, definiowanej przez wektor ÐÐÐÐ→C13C18. Ta rotacja zmienia wartość kąta azymutalnego φChol, oznaczanego również jako kąt α (definicja mieści się na ilustracji 2.12b).
Z kolei rotacja prostopadła, wokół wektora prostopadłego do długiej osi zmienia war-tość kąta θ (definicja na rys. 2.12c). W przeciwieństwie do rotacji równoległej, ze względu na gęste środowisko dwuwarstwy lipidowej, rotacja prostopadła ograniczana jest do stożka.
Trzeci rodzaj rotacji opisuje procesję rzutu wektora ÐÐÐ→C3C17 na płaszczyznę XY, jest on wypadkową dwóch poprzednich ruchów (kąt φ na rys. 2.12c).
Liczba wiązań wodorowych obliczana jest w pracy na podstawie poniższego kryterium geo-metrycznego. Odległość między donorem (D) i akceptorem (A) ≤ 0,35 nm, a kąt między wektorami ÐÐÐ→D− A a ÐÐÐÐÐÐÐ→D− atom H ≤ 30 ○.