Organizacja lipidów w obrębie układów domenowych

W modelu organizacji lipidów Umbrella (Huang i Feigenson, 1999), opisanym w podrozdziale 1.9, głowy polarne fosfolipidów osłaniają cząsteczki cholesterolu przed kontaktem z polarnymi cząsteczkami wody. To oznacza, że kąt nachylenia θP N (definicja w podrozdziale 2.3) dla głów fosfolipidowych POPC w pobliżu cholesterolu powinien być większy, niż dla cząsteczek POPC w otoczeniu innych fosfolipidów. Dodatkowo, nachylenie głów polarnych fosfolipidów graniczą-cych z cząsteczkami cholesterolu powinno być ukierunkowane i mierzalne w oparciu o wartość kąta azymutalnego φP N (definicja w podrozdziale 2.3).

Dwa układy symulacyjne POPC_POPC-Chol50 i CBD_POPC-Chol50 zostały wyko-rzystane w celu weryfikacji modelu Umbrella. Przeanalizowano zmiany w czasie kąta θP N oraz kąta azymutalnego φP N dla głów polarnych POPC w tych układach. Na ilustracjach 3.33b oraz 3.34b przedstawione zostały dwuwarstwy CBD_POPC-Chol50 i POPC_POPC-Chol50, których powierzchnia została podzielona na komórki Woronoja. Komórki wielościenne odpowia-dające cząsteczkom POPC pokolorowane zostały w odcieniach zieleni. Intensywność zabarwienia pojedynczego kafelka odzwierciedla średnią wartość kąta nachylenia θP N głowy polarnej POPC w czasie 100 ps symulacji (140-140,1 ns). Zgodnie z obecnie przyjętym modelem Umbrella, czą-steczki POPC w pobliżu cząsteczek cholesterolu powinny mieć ciemniejszy kolor, wynikający z większego nachylenia. Szczególnie ciekawa pod tym kątem jest dwuwarstwa POPC_POPC-Chol50, gdzie możliwe jest porównanie domeny PCD z domeną czysto fosfolipidową. Na otrzy-manej ilustracji nie jest możliwe stwierdzenie nachylenia głów polarnych POPC graniczących z cząsteczkami lipidów.

Dodatkowo przeprowadzono analizę ilościową wartości kąta nachylenia θP N POPC w dwu-warstwach POPC i POPC-Chol50 (przedstawionych wcześniej w podrozdziale 3.2). Na pod-stawie analizy 5 ns fragmentów symulacji (100-105 ns i 150-155 ns symulacji dynamiki mo-lekularnej, przy kroku czasowym 20 ps) dla powyższych układów symulacyjnych otrzymano wartości kąta nachylenia θP N równe: 67,12 ± 17,00 i 67,12 ± 17,54 dla dwuwarstwy POPC

108 3. Wyniki

(a) POPC_POPC-Chol50 (b) θP N (140–140,1 ns)

(c) φP N (140–140,1 ns) (d) δφP N(140 − 140, 1 ns)

Rysunek 3.33: Widok z góry na dwuwarstwę POPC_POPC-Chol50 w 140 ns symulacji (a). Na płaszczyźnie podzielonej na komórki Woronoja przedstawiono uśrednione w czasie wartości kąta nachy-lenia θP N (b), kąta azymutalnego φP N (c) oraz odchylenia standardowego dla kąta azymutalnego φP N

(d) w przedziale od 140 do 140,1 ns symulacji dynamiki molekularnej. Na ilustracji (a) kolorem zielonym i żółtym rozróżniono cząsteczki POPC i cholesterolu. Atomy tlenu, azotu, fosforu i wodoru wyróżniono kolorami: czerwonym, niebieskim, pomarańczowym i białym. Atomy fosforu i azotu zostały wyróżnione za pomocą sfer, a wektor ÐÐ→P N za pomocą czarnych odcinków. Cząsteczki wody oraz niepolarne atomy wodoru zostały ukryte w celu zwiększenia przejrzystości ilustracji. Na ilustracjach (b), (c) i (d) oznacze-nie skali kolorów przypisanych do wartości uśrednionej obrazowanej wielkości mieści się z prawej strony każdego z nich. Szary prostokąt w tle wyznacza obszar pudełka symulacyjnego.

3.5. Dwuwarstwy domenowe 109

(a) CBD_POPC-Chol50 (b) θP N (140 - 140,1 ns) (c) φP N + δφP N(140 − 140, 1 ns)

Rysunek 3.34:Widok z góry na dwuwarstwę CBD_POPC-Chol50 w 140 ns symulacji (a). Na płasz-czyźnie podzielonej na komórki Woronoja przedstawiono uśrednione wartości kąta nachylenia θP N (b) oraz kąta azymutalnego φP N (c) w przedziale od 140 do 140,1 ns symulacji. Na ilustracji (a) kolorem zielonym i żółtym rozróżniono cząsteczki POPC i cholesterolu. Atomy tlenu, azotu, fosforu i wodoru wyróżniono kolorami: czerwonym, niebieskim, pomarańczowym i białym. Atomy fosforu i azotu zostały wyróżnione za pomocą sfer, a wektor ÐÐ→P N za pomocą czarnych odcinków. Cząsteczki wody oraz niepo-larne atomy wodoru zostały ukryte w celu zwiększenia przejrzystości ilustracji. Na ilustracjach (b) i (c) oznaczenie skali kolorów przypisanych do wartości uśrednionej odpowiedniego kąta mieści się z prawej strony każdego rysunku. Na ilustracji (c) przedstawiono na miniaturze wartość odchylenia standardowego dla kąta azymutalnego φP N. Szary prostokąt w tle wyznacza obszar pudełka symulacyjnego.

oraz 67,11± 16,92 i 67,33 ± 17,94 dla POPC-Chol50. Te wyniki oznaczają brak statystycznej różnicy w kącie nachylenia θP N dla dwuwarstwy fosfolipidowej bez cholesterolu i tej nasyconej cholesterolem.

Na ilustracji 3.33c i 3.34c przedstawiono uśrednione wartości kąta azymutalnego φP N w cza-sie 100 ps. Na rysunkach tych kolor komórki wielościennej odpowiada wartości uśrednionego kąta φP N, skala mieści się z prawej strony ilustracji. Na wartość średnią kąta azymutalnego φP N

wpływają dwa typy ruchów głów polarnych: rotacja równoległa i prostopadła (opisane w pod-rozdziale 2.3). Im bliższa zeru wartość kąta θP N tym rotacja prostopadła może mieć większe znaczenie podczas mierzenia wartości średniej kąta φP N. Na rysunku 3.33d przedstawiona zo-stała wartość odchylenia standardowego dla wartości uśrednionego kąta φP N. Dla ponad połowy cząsteczek POPC odchylenie standardowe dla kąta φP N jest nie większe niż 20^○ w dwuwarstwie POPC_POPC-Chol50oraz nie większe 30^○ w dwuwarstwie CBD_POPC-Chol50, w

cza-110 3. Wyniki sie analizowanych 100 ps. Na podstawie otrzymanych analiz nie można stwierdzić tendencji głów polarnych POPC do nakrywania obszarów dwuwarstwy zajmowanych przez cholesterol.

Kolejną wykonaną analizą było wyznaczenie funkcji rozkładu radialnego RDF dla atomów azotu i fosforu POPC względem tlenu grupy hydroksylowej cholesterolu w czasie 50 ns symulacji dynamiki molekularnej (100-150 ns). Otrzymane krzywe RDF dla dwuwarstwy POPC_POPC-Chol50 i CBD_POPC-Chol50 zostały przedstawione na panelu ilustracji 3.35. Zarówno dla atomów fosforu, jak i azotu, wyznaczono krzywe RDF w przestrzeni trójwymiarowej oraz w płaszczyźnie XY.

W przypadku krzywych RDF trójwymiarowych dla atomów azotu i fosforu widoczne są pierwsze pojedyncze wysokie maksima w odległości 3,8 Å od atomu tlenu grupy hydroksylowej, z których w przypadku atomu azotu pik jest znacznie szerszy. Dla atomu fosforu POPC widocz-ne są kolejwidocz-ne dwa szerokie maksima w odległości 5,5 i 7,5 Å od atomu tlenu O3 (rys. 3.35a). Dla atomu azotu dwa kolejne niewielkie piki mieszczą się w odległości 8,0 i 8,7 Å od atomu tlenu O3 grupy hydroksylowej (rys. 3.35b). Przedstawione funkcje trójwymiarowe rozkładu radialnego pokazują ukierunkowanie głów fosfolipidowych w pobliżu cholesterolu, przy którym zarówno ato-my fosforu jak i azotu mieszczą się blisko atomu tlenu grupy hydroksylowej. Przebieg krzywych RDF jest dla obu układów symulacyjnych prawie identyczny.

Na dwuwymiarowych krzywych RDF pierwsze maksima dla atomu fosforu i azotu mieszczą się w odległości 3,5 i 3 Å od atomu tlenu cholesterolu (rys. 3.35c i 3.35d) i podobnie jak w przypadku krzywych trójwymiarowych RDF, gdzie szerokość maksimum dla atomu azotu jest większa. Dla atomu fosforu, w porównaniu z atomem azotu, widoczne jest głębsze minimum zakresie od 0 do 2 Å. Położenie kolejnych dwóch maksimów dla atomu fosforu, 5,5 i 7,5 Å od atomu tlenu O3 jest porównywalne do położenia dla krzywych RDF trójwymiarowych.

Krzywe RDF PP OP C – O3Choli NP OP C – O3Chol nakładają się na siebie począwszy od 10 Å, zarówno dla układu POPC_POPC-Chol50, jak i CBD_POPC-Chol50 (rys. 3.35f i 3.35e).

Jeżeli popatrzymy na otoczenie każdej cząsteczki cholesterolu jak na układ koncentrycznych pierścieni lipidów, to brak maksimów po 10 Å możemy uznać za wyznacznik braku organizacji między lipidami mieszczącymi się poza pierwszym pierścieniem.