1.7.3 Struktura chemiczna cholesterolu
Cholesterol zaliczany jest do steroidów ze względu na obecność trzech pierścieni sześciowę-glowych i jednego pięciowęglowego, położonych względem siebie w konformacji trans (rys. 1.4).
Grupa steroidowa jest sztywna i prawie płaska. Do niej przyłączone są dwie grupy metylowe w pozycji aksjalnej, to znaczy prostopadłej do płaszczyzny grupy steroidowej. Strona grupy steroidowej, gdzie mieszczą się grupy metylowe nazywana jest stroną β cholesterolu, a druga płaska strona nazywana jest stroną α cholesterolu (rys. 1.4). Do atomu węgla C3 grupy stero-idowej przyłączona jest grupa hydroksylowa w położeniu ekwatorialnym, czyli w płaszczyźnie grupy steroidowej. Również w położeniu ekwatorialnym, do atomu węgla C17, przyłączony jest łańcuch węglowodorowy, nazywany “ogonem” cholesterolu.
Szereg szczegółowych badań pokazał, że większość modyfikacji struktury cholesterolu pocią-ga za sobą ważne konsekwencje, takie jak pogorszenie właściwości porządkujących błonę i osła-bienie oddziaływań z otaczającymi cholesterol lipidami (Róg i inni, 2003, 2007; Rog i inni, 2008, 2009).
(a)
(b)
Rysunek 1.4: Struktura przestrzenna cząsteczki cholesterolu w reprezentacji kulkowo-kreskowej, wi-dzianej z góry (a) i z boku (b). Kolorem czarnym zaznaczono atomy węgla, czerwonym atom tlenu grupy hydroksylowej, a białym atomy wodoru.
1.8 Diagramy fazowe
Diagramy fazowe wykorzystywane są do opisu układów termodynamicznych. Błony biolo-giczne, ze względu na różnorodność i mnogość obecnych w nich lipidów, są trudnym obiektem w badaniach procesów fazowych. Dlatego też, zwykle badania przeprowadzane są na
mode-30 1. Wstęp lach znacznie uproszczonych. Na rysunku 1.5 przedstawiony został diagram fazowy adaptowany z pracy Mainaliego (Mainali i inni, 2012b), opracowanym dla mieszaniny DMPC i cholesterolu, który jest uniwersalnym opisem innych mieszanin fosfolipidów i cholesterolu, a w szczególności mieszaniny POPC i cholesterolu.
Rysunek 1.5: Diagram fazowy dwuwarstwy dwuskładnikowej dla różnej temperatury i zawartości cho-lesterolu w błonie DMPC-Cholesterol. Ilustracja jest adaptacją z pracy Mainali (Mainali i inni, 2012b).
Oznaczenia: Tt - temperatura topnienia, s0 - faza żelowa, lo - faza ciekłokrystaliczna uporządkowana, ld - faza ciekłokrystaliczna nieuporządkowana, CBD - płynna domena cholesterolowa
1.8.1 Układy o zerowej lub niskiej zawartości cholesterolu
Pierwszym rozpatrywanym układem jest najprostsza dwuwarstwa składająca się z jednego typu fosfolipidu, której odpowiada miejsce na diagramie od lewego dolnego do lewego górnego rogu. Dwuwarstwa ta, w zależności od temperatury, występuje w jednej z dwóch faz: żelowej (oznaczonej jako s0) lub płynnej (nazywanej również fazą ciekłokrystaliczną nieuporządkowaną, oznaczonej jako ld).
Faza żelowa s0 występuje w niskich temperaturach i odpowiada stanowi podobnemu do struktury krystalicznej, gdzie kąty torsyjne łańcuchów węglowodorowych są w konformacji trans.
Faza ciekłokrystaliczna nieuporządkowana ld znacznie różni się właściwościami fizycznymi od fazy żelowej, łańcuchy węglowodorowe są w niej mniej uporządkowane i obserwowana jest w nich konformacja gauche kątów torsyjnych, większa jest powierzchnia przypadająca na lipid oraz ruchliwość translacyjna i rotacyjna.
Przejście fazowe między fazą żelową s0 a ciekłokrystaliczną nieuporządkowaną ld jest prze-mianą fazową pierwszego rodzaju. To oznacza, że przejście fazowe następuje na skutek wydzie-lenia lub pochłonięcia ciepła przez układ, w temperaturze zwanej temperaturą topnienia Tt
(alternatywnie nazywanej temperaturą krzepnięcia).
Temperatura topnienia Ttzależy od rodzaju lipidu, typu głowy polarnej, długości łańcuchów węglowodorowych oraz liczby i położenia wiązań podwójnych. W skrócie, temperatura topnienia Tt jest wyższa dla lipidów z długimi i nasyconymi łańcuchami fosfolipidowymi, których głowy polarne oddziałują ze sobą niekowalencyjnie.
1.8. Diagramy fazowe 31
1.8.2 Układy z cholesterolem, poniżej progu rozpuszczalności
Wraz z pojawieniem się cholesterolu i wzrostem jego zawartości w dwuwarstwach fosfolipi-dowych pojawia się nowa faza, zwana fazą ciekłokrystaliczną uporządkowaną lo. Jak widać na ilustracji 1.5, faza ciekłokrystaliczna uporządkowana lo współistnieje z fazą żelową s0 w niskich temperaturach lub z fazą ciekłokrystaliczną nieuporządkowaną ld w temperaturach wyższych.
Współistnienie fazy loz innym typem ma miejsce w dość szerokim zakresie zawartości cholestero-lu (rys. 1.5). Pojawienie się cholesterocholestero-lu w obrębie fazy ciekłokrystalicznej nieuporządkowanej ld i fazy żelowej s0 ma odmienne następstwa. Dla pierwszej, cholesterol posiada właściwości porządkujące i kondensacyjne związane z obecnością sztywnych grup steroidowych cholestero-lu. Natomiast faza żelowa ulega upłynnieniu. Przez to zmienia się charakter przejścia fazowego w temperaturze topnienia, powodowanym większym podobieństwem faz lo i ld.
Wraz ze wzrostem zawartości cholesterolu zwiększa się udział fazy lo, a w zakresie stęże-nia 30-50% molowych dla cholesterolu obejmuje ona cały obszar dwuwarstwy. Warto zwrócić uwagę, że w tym zakresie stężenia mieści się większość ssaczych błon biologicznych. Stężenie 50% molowych odpowiada nasyceniu dwuwarstwy fosfolipidowej cholesterolem, powyżej którego w obrębie dwuwarstwy fosfolipidowej nasyconej cholesterolem, zaczynają się formować domeny cholesterolowe.
1.8.3 Układy po przekroczeniu wartości progowej dla rozpusz-czalności cholesterolu
Powyżej progu rozpuszczalności cholesterolu w błonach fosfolipidowych ma miejsce tworzenie się, oprócz fazy ciekłokrystalicznej lo, domeny cholesterolowej. Panuje zgoda odnośnie wartości progowej dla rozpuszczalności cholesterolu w dwuwarstwie fosfolipidowej, przy stosunku cho-lesterolu do fosfolipidów równym 1 (Huang i inni, 1999), natomiast struktura tworzących się domen cholesterolowych podlega nadal dyskusji, która została przybliżona poniżej.
Przez długi czas najpopularniejszą metodą otrzymywania liposomów z mieszaniny lipidów, była omówiona wcześniej (na str. 16) metoda depozycji lipidów w postaci suchego filmu lipi-dowego, który następnie rozpuszczany był w wodzie, w celu uzyskania liposomów. Otrzymane w ten sposób próbki, o wysokiej zawartości cholesterolu, przekraczającej stosunek cholesterolu do fosfolipidów równy 1, zostały zbadane za pomocą różnych metod eksperymentalnych i uzy-skano dwie sprzeczne obserwacje. Krystaliczne domeny cholesterolu CCD, zarówno jednowodne jak i bezwodne kryształy, zostały zarejestrowane technikami skaningowej kalorymetrii różnico-wej DSC (Epand, 2003), rentgenografii strukturalnej (Knoll i inni, 1985; Preston Mason i inni, 2003) oraz spektroskopii NMR (Epand, 2003). Z kolei płynne domeny cholesterolowe CBD zo-stały zarejestrowane dzięki metodzie spektroskopii EPR (Raguz i inni, 2011a; Mainali i inni, 2012a).
Wyniki te rozpoczęły dyskusję naukową, która na razie nie doprowadziła do pełnej zgodno-ści. Jednakże, sądzimy, że powstawanie kryształów cholesterolu CCD zaraz po przekroczeniu
32 1. Wstęp progu rozpuszczalności w błonie fosfolipidowej, jest artefaktem doświadczalnym i uznanie tego faktu wydaje się tylko kwestią czasu. Coraz częściej podczas przygotowania liposomów o wy-sokiej zawartości cholesterolu wykorzystywana jest metoda, w której lipidy z rozpuszczalnika organicznego trafiają bezpośrednio do środowiska wodnego i pominięty jest etap tworzenia su-chego lipidowego filmu (Buboltz i Feigenson, 1999). Dzięki zastosowaniu techniki Rapid Solvent Exchange, otrzymana została wartość progowa dla tworzenia się kryształów cholesterolu CCD, równa 2 (Huang i inni, 1999). Po zastosowaniu nowej techniki zaobserwowano jedynie jednowod-ne kryształy cholesterolu i nie stwierdzono powstawania bezwodnych kryształów cholesterolu.
W oparciu o powyższe wyniki został przedstawiony diagram fazowy (Mainali i inni, 2013), który został adaptowany z oryginalnej publikacji na rysunku 1.5. Po przekroczeniu progu roz-puszczalności cholesterolu w dwuwarstwie fosfolipidowej, równym 1, w jej obrębie powstaje do-mena CBD. Tworzenie się domen CBD zostało zaobserwowane w układach będących mieszani-ną cholesterolu i różnych fosfolipidów: fosfatydylocholin, fosfatydyloseryn, sfingomielin (Raguz i inni, 2011a,b; Mainali i inni, 2011), a także mieszaniny lipidów uzyskanych ze zwierzęcych i ludzkich soczewek oka (Raguz i inni, 2008, 2009; Subczynski i inni, 2007).
Rozróżnienie dwóch domen: fosfolipidowej nasyconej cholesterolem PCD oraz płynnej dome-ny cholesterolowej CBD, jest możliwe dzięki zastosowaniu znaczników spinowych oraz cząsteczek paramagnetycznych. Cząsteczki paramagnetyczne, zarówno hydrofobowe (tlen cząsteczkowy) jak i hydrofilowe (NiEDDA), różnie wypływają na relaksację spin-sieć znaczników spinowych w tych dwóch domenach (Subczynski i inni, 2007).
Badania przeprowadzone przy różnej zawartości cholesterolu pokazały współistnienie dwóch domen po przekroczeniu stosunku cholesterolu do fosfolipidu równego 1. Przy stężeniu cho-lesterolu przekraczającym nieznacznie 50% molowych parametr transportu tlenu różni się w niewielkim stopniu dla domeny cholesterolowej CBD i fosfolipidowej nasyconej cholesterolem PCD(Mainali i inni, 2013). Wynik ten może być skutkiem kilku czynników: szybkiej wymiany lipidów na granicy domen, szybkim procesem tworzenia sie i rozpadania domen cholesterolowych oraz/i dużym stosunkiem granicy dwóch domen do ich powierzchni. To oznacza, że powstające domeny CBD nie tworzą osobnej fazy (Almeida i inni, 2005), jedynie współistnieją z ośrodkiem nasyconym cholesterolem, co zaznaczono na diagramie fazowym w zakresie stężenia 50-66%
molowych. Badania eksperymentalne wskazują na czas wymiany lipidów między domenami na krótszy niż 10 ns (Raguz i inni, 2008).
Powyżej stężenia cholesterolu 66% molowych w mieszaninie lipidów zaczynają tworzyć się kryształy cholesterolu jako odrębna faza. Kryształy te mają strukturę wielowarstwową (Mainali i inni, 2013) i przypuszczalnie nie są związane z błoną.