α-krystalina należy do grupy “białek opiekuńczych”, inaczej zwanych “białkami szoku ciepl-nego”, których funkcja polega na wiązaniu zdenaturowanych białek. To zapobiega ich niepożą-danej agregacji i częściowo umożliwia im odzyskanie prawidłowej struktury przestrzennej. W soczewce oka α-krystalina jest białkiem oligomerycznym (Jehle i inni, 2010), największym i wy-stępującym w najwyższym stężeniu w cytoplazmie komórek włókien soczewki oka. Funkcjonalna struktura α-krystaliny nie jest znana, wiadomo jednak, że jest zbudowana z około 40 łańcuchów polipeptydowych. W skład struktury oligomerycznej wchodzą podjednostki αA i αB-krystaliny oraz związane przez nie białka o nieprawidłowej strukturze (Bloemendal i inni, 2004).
β i γ-krystaliny charakteryzują się podobną strukturą i są one białkami wywodzącymi się z mikrobowych białek stresu (Wistow, 1990). Są to białka dwudomenowe, w których podobne domeny połączone są krótkimi łącznikiem. Białka β i γ-krystaliny mają strukturę drugorzędową składającą się głównie z rozmieszczonych antyrównolegle nici β, o topologi motywu klucza grec-kiego. Proces fałdowania motywu klucza greckiego należy do prostych, dzięki czemu nawet białka o nieprawidłowej strukturze mogą łatwo odzyskać strukturę natywną w obrębie kompleksu α-krystaliny. Stabilność β i γ-krystaliny zwiększona jest dzięki wiązanym kationom wapnia Ca2+. Różnicą między β i γ-krystaliną jest występowanie tej pierwszej w formie oligomeru, a drugiej w formie monomeru.
Zgodnie z obecnym stanem wiedzy, pozostałe białka cytoplazmatyczne nie są specyficzne dla komórek soczewki oka.
1.5 Zaćma i zmiany w soczewce oka związane z wiekiem
W przypadku wielu zmian zachodzących w starzejących się soczewkach oka trudne jest rozstrzygnięcie, czy są one też związane z rozwojem zaćmy. Dlatego też zmiany te zostały opisane we wspólnym podrozdziale.
1.5.1 Zaćma soczewki oka
Zaćma soczewki oka, inaczej nazywana kataraktą, jest chorobą prowadzącą do zmętnienia soczewki, a przez to do pogorszenia widzenia, aż do utraty wzroku. Występuje ona głównie po 60 roku życia, kiedy to nazywana jest zaćmą nabytą, ale jej pojawienie możliwe jest jeszcze przed narodzinami, nazywana jest wtedy zaćmą wrodzoną. Zaćma o podłożu genetycznym, czyli zaćma wrodzona, związana jest często z mutacjami w obrębie genów kodujących grupę białek:
krystaliny, białka cytoszkieletu lub białka błonowe (Graw, 2004), lecz również z zaburzeniami metabolizmu cholesterolu (Mori i inni, 2006)
Przyczyną powstawania katarakty nabytej może być konkretna choroba (np. zaćma cukrzy-ca), stosowane leki (np. zaćma kortyzonowa przy stosowaniu sterydów), przebywanie w otoczeniu o wysokiej zawartości tlenu (np. zaćma dzieci przedwcześnie urodzonych przebywających w
in-22 1. Wstęp kubatorze) lub urazy penetrujące gałkę oczną (zaćma elektryczna, hutnicza lub popromienna).
Dostępność do metod leczenia polegających na operacyjnym wszczepieniu nowej soczewki jest oczywiście uzależniona od regionu świata. Dlatego też, większość osób cierpiących na ślepotę i niepełnosprawność z niej wynikającą zamieszkuje kraje słabo rozwinięte. Rozległe badania epidemiologiczne nad tą chorobą podają wiek jako główny czynnik ryzyka (Truscott, 2000), cho-ciaż wymieniane są też takie czynniki jak: palenie papierosów, spożycie alkoholu, narażenie na promieniowanie UV oraz czynniki genetyczne (Congdon i inni, 2004).
Transparentna, prawie bezbarwna zdrowa soczewka oka wraz z rozwojem zaćmy jądra so-czewki, staje się mętna i zmienia swój kolor do różnych odcieni koloru żółtego, brązowego, a nawet czarnego. Zmiany barwnikowe są zawsze najsilniejsze w obszarze jądra soczewki i wią-zane są z modyfikacjami białek, które jednak nie zostały poznane na poziomie molekularnym.
W przypadku zaćmy korowej, zmętnienie ma kolor biały i wiązane jest z lokalnym zaburzeniem regulacji osmotycznej.
W zaćmie obejmującej jądro soczewki oka, takiej jak zaćma starcza, obserwowane jest utle-nianie reszt cysteiny i metioniny w białkach, które ma charakter postępujący aż do utlenienia
>90% reszt cysteiny i połowy reszt metioniny w najbardziej zaawansowanych stadiach rozwoju katarakty (Truscott, 2005). Proces utleniania białek skorelowany jest ze spadkiem poziomu glu-tationu, który częściowo może być tłumaczony przez tworzenie mostków disiarczkowych między glutationem i białkiem. W zdrowej soczewce takie połączenia mają charakter tymczasowy i są one zrywane poprzez działanie enzymu tioltransferazy występującego w cytoplazmie (Löfgren i inni, 2008). Ograniczenie w przypływie formy utlenionej i zredukowanej glutationu w obrębie soczewki, bądź zaburzenie pracy peroksydazy glutationowej w nabłonku soczewki, prowadzi do tworzenia się trwałych agregatów, a przez to do rozwoju zaćmy (Reddan i inni, 1999).
Starzenie się organizmu związane jest z degeneracją białek o długim czasie życia. Nagro-madzenie się zmodyfikowanych białek w soczewce oka mogłoby tłumaczyć zmianę optycznych i fizycznych właściwości soczewki. Pod tym kątem zbadano metodami proteomicznymi zależny od wieku proces modyfikacji białek soczewki oka. Pokazano, że niektóre zmiany zależne od wie-ku, jak racemizacja reszt seryny γS-krystaliny (Hooi i inni, 2013) i asparginianu αA-krystaliny (Hooi i inni, 2012b) jest nasilona w zaćmie, a część, jak na przykład deamidacja reszt glutami-ny (Gln-92 i Gln-170) białka γS-krystaliglutami-ny nie ma z nią związku (Hooi i inni, 2012a). Wyniki tych badań nie odpowiadają jednak na pytanie, czy modyfikacja białek jest skutkiem czy też przyczyną zaćmy.
Glutation, jak wiele innych przeciwutleniaczy, w określonych warunkach sam staje się utle-niaczem. Dla glutationu, takim warunkiem jest spadek stężenia poniżej 1 mM. Spadek stężenia glutationu we wnętrzu soczewki związany jest z pojawieniem się ograniczenia dla jego dyfuzji o nie znanym pochodzeniu (Reddan i inni, 1999). Wraz ze spadkiem stężenia glutationu, również cząsteczki filtrów UV, obecne w soczewkach naczelnych, oraz kwasu askorbinowego mogą stać się utleniaczami, czemu sprzyja pojawienie się bariery dyfuzji dla nich i cząsteczek glutatio-nu. W soczewkach osób po 50-tym roku życia zawartość kompleksów białek i filtrów UV jest znacząco wyższa, zwłaszcza w obrębie jądra soczewki (Korlimbinis i inni, 2007)
1.5. Zaćma i zmiany w soczewce oka związane z wiekiem 23 Kolejną zmianą obserwowaną w soczewce oka wraz z rozwojem zaćmy, jest utrata rozpusz-czalności białek cytoplazmatycznych soczewki oka. Białka pochodzące ze zdrowej soczewki są rozpuszczalne w roztworze mocznika, natomiast, wraz z rozwojem zaćmy tracą one tę właściwość.
Częściowo są one rozpuszczalne po dodaniu czynnika redukującego, co świadczy o istnieniu mię-dzyłańcuchowych mostków disiarczkowych w białkach. Jednakże część agregatów pomimo jego dodania nadal nie jest rozpuszczalna. Otrzymywane wyniki doświadczeń wskazują, że powsta-jące agregaty w soczewce oka są amorficzne (Truscott, 2007). Ciekawe są wyniki otrzymane dla soczewek we wczesnych stadiach rozwoju choroby, w których możliwe jest rozróżnienie frakcji rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej w roztworze mocznika, gdzie tylko druga frakcja jest zabar-wiona (Truscott, 2005). Badania chromatograficzne potwierdzają tworzenie się agregatów białek, w których istnieją połączenia między łańcuchowe nie-siarczkowe, takie w których reszty amino-kwasów połączone są ze sobą wiązaniami kowalencyjnymi (Kanayama i inni, 1987). Ze zdrowych soczewek oka za pomocą detergentów uzyskuje się frakcje błony oporne na działanie detergentu, w których stosunek cholesterolu do fosfolipidów jest wyjątkowo wysoki, dochodzący do warto-ści 7. Frakcja ta nie jest możliwa do uzyskania z błon komórek włókienkowych objętych zaćmą.
Wraz z pojawianiem się tlenu we wnętrzu soczewki oka, znaczenie zyskują obecne w niej jony metali, takie jak żelazo i miedź, które mogą być katalizatorami w procesie przekształcania nadtlenku wodoru, w którym powstaje wysoce reaktywny rodnik hydroksylowy. W zaawansowa-nych stadiach zaćmy obecne są reaktywne formy żelaza Fe2+ w soczewkach oraz podwyższony poziom rodników kwasu askorbinowego (Garner i inni, 2000).
1.5.2 Zmiany w soczewce oka związane z wiekiem
Fakt zmiany składu lipidowego soczewki oka z wiekiem jest znany od dawna. Już w 1922 roku zauważono wysoką zawartość cholesterolu w soczewce oka, która wzrasta wraz z wiekiem (Goldschmidt, 1922). W kolejnych latach XX wieku zidentyfikowano inne lipidy występujące w soczewce oka i opisano zmiany z wiekiem oraz w zaćmie soczewki oka.
Jak już zostało wspomniane, wiek jest głównym czynnikiem ryzyka zachorowania na zaćmę.
Wraz z wiekiem zmianie ulega wiele właściwości soczewki oka, przede wszystkim tracą one swoją elastyczność i zmniejsza się współczynnik załamania jądra soczewki oka, co prowadzi do dalekowzroczności starczej.
Tym zmianom towarzyszy modyfikacja składu lipidowego błon komórek włókienkowych.
Przez pierwsze 10 lat życia człowieka obserwowany jest wzrost zawartości cholesterolu i fosfo-lipidów w całej soczewce oka, znacznie przewyższający przyrost masy białkowej. W kolejnych latach notowany jest wzrost zawartości cholesterolu, przy braku lub niewielkim gromadzeniu fosfolipidów w błonach komórek włókienkowych (Li i inni, 1987). Zmiany te związane są z błoną plazmatyczną, w której mieści się ponad 90% molowych lipidów soczewki oka. Kolejną obserwo-waną zmianą zachodzącą z wiekiem, jest spadek zawartości plazmogenu z 25% do 10% molowych, fosfatydylocholiny z 5% do 1% molowego i wzrost stężenia sfingolipidów z 35% do 60% molo-wych na przestrzeni 60 lat życia człowieka, od 10 do 70 roku życia. Te zmiany mogą wpływać
24 1. Wstęp na funkcjonalność białek błonowych (Grami i inni, 2005). Pozostaje pytaniem otwartym, czy te zachodzące zmiany zwiększają podatność na rozwój zaćmy.
W trakcie życia, w ludzkiej soczewce ponad 40% fosfolipidów soczewki oka ulega utlenieniu, a w komórkach objętych kataraktą ten udział jest jeszcze wyższy (Huang i inni, 2005). Utlenione fosfolipidy modulują procesy komórkowe, takie jak wzrost, procesy oddechowe, syntezę białek i wiele innych. Są one substratem dla lipaz, dlatego też zmiana składu lipidowego może wynikać z degradacji fosfolipidów przez te enzymy, zwłaszcza fosfolipazę A2 (Cenedella, 1985)
Kolejną obserwowaną zmianą jest zawartość wolnej α-krystaliny. Szacuje się, że do 40-tego roku życia człowieka, wszystkie cząsteczki tego białka są związane ze zdenaturowanymi białkami i po tym czasie zdenaturowane białka cytoplazmatyczne zaczynają się wiązać z błoną komórkową (Friedrich i Truscott, 2009). Powstające agregaty, mogą nie tylko wpływać na elastyczność so-czewki ale również wpływać na płynność błony i funkcjonowanie białek błonowych. Faktycznie, z wiekiem obserwowana jest zmniejszona dyfuzja wody i glutationu w obrębie soczewki (Moffat i inni, 1999), (Sweeney i Truscott, 1998).
Procesy zachodzące we wnętrzu soczewki oka zależą od funkcjonowania warstw korowych komórek włókienkowych i komórek nabłonka. Z wiekiem zmniejsza się przepuszczalność soczew-ki oka dla glutationu oraz kationów. Jednocześnie nie są zauważalne zmiany w metaboliźmie glutationu w komórkach nabłonka soczewki oka. Dlatego też, obserwowane liniowe obniżanie stężenia filtrów UV, z szybkością 12% na dekadę, wiąże się z powstawaniem bariery dla dyfuzji glutationu (Truscott, 2000),(Bova i inni, 2001).
Soczewki ludzkie po 50-tym roku życia, pomimo utraty zdolności do akomodacji często nie wykazują zmian charakterystycznych dla katarakty. Dlatego też, pomimo starań, nadal nie wia-domo jaki czynnik sprawia, że choroba zaczyna się rozwijać. Kluczem do zagadki wydaje się więc tlen, gdyż w komórkach soczewek starczowzrocznych są obserwowane niewielkie albo żadne skutki utlenienia, w przeciwieństwie do soczewek objętych zaćmą (Truscott, 2007). Proces na pewno jest złożony, gdyż samo utlenienie białek nie jest jednoznaczne z pojawieniem się zaćmy.
Przykładowo, u dorosłych gryzoni pomimo kompletnego utlenienia reszt cysteiny w białkach, soczewka nie musi ulegać zmętnieniu.
Ze względu na małą stabilność nadtlenku wodoru w warstwach korowych i nabłonka soczew-ki oka, związaną z obecnością antyoksydantów i grupy enzymów, za utlenianie wnętrza soczewsoczew-ki odpowiada tlen cząsteczkowy. Tlen dobrze rozpuszcza się w ośrodkach niepolarnych, takich jak błony biologiczne, które mogą być ośrodkiem korzystnym dla dyfundujących cząsteczek. Wiado-mo również, że witamina E, która jest przeciwutleniaczem związanym z błonami biologicznymi skutecznie opóźnia rozwój zaćmy (Robertson i inni, 1991).