3.4 Układy podwójnych dwuwarstw lipidowych bez oraz z tlenem cząsteczkowym 84
3.4.6 Dyfuzja tlenu cząsteczkowego
W celu ilościowego porównania procesu dyfuzji w układach symulacyjnych dPOPC+O2
dPOPC-Chol50+O2 i dChol2+O2, wyznaczono wartość współczynnika dyfuzji D tlenu w tych układach podzielonych na warstwy. Ze względu na różną wysokość układów symulacyjnych
3.4. Układy podwójnych dwuwarstw lipidowych bez oraz z tlenem cząsteczkowym 91
(a) dPOPC+O2
(b) dPOPC-Chol50+O2
Rysunek 3.23:Podział na warstwy układów dPOPC+O2i dPOPC-Chol50+O2. Cząsteczki lipidów wyróżniono kolorem szarym, dla atomów innych niż węgiel zastosowano standardowy schemat kolorowa-nia. Cząsteczki wody oraz niepolarne atomy wodoru zostały ukryte w celu zwiększenia przejrzystości ilustracji. Za pomocą czerwonych, zielonych i niebieskich sfer zostały wyróżnione atomy tlenu cząstecz-kowego, atomy węgla C31 oraz azotu N POPC. Żółte pionowe linie odpowiadają położeniu środka masy wybranego typu atomów i wyznaczają one podział układów symulacyjnych na warstwy.
92 3. Wyniki dPOPC+O2
n(MSD) DXY[10−4 cms2] DXY Z[10−4 cms2] w1 101, 1097 , 559 0,370 ± 0,029 0,311 ± 0,058 w2 365, 353, 388 ,311 0,031 ± 0,001 0,024 ± 0,003 w3 41243, 46436 0,188 ± 0,011 0,171 ± 0,016
dPOPC-Chol50+O2
n(MSD) DXY[10−4 cms2] DXY Z[10−4 cms2] w1 828, 1746, 1665 0,509 ± 0,041 0,457 ± 0,056 w2 402, 131, 106 ,188 0,050 ± 0,001 0,038 ± 0,000 w3 39125, 32102 0,290 ± 0,008 0,234 ± 0,015
Tabela 3.5: Analiza procesu dyfuzji tlenu cząsteczkowego w układach dPOPC+O2 i dPOPC-Chol50+O2podzielonych na warstwy trzech typów: w1 , w2 i w3 (rys. 3.23). Liczba zebranych krzywych MSDw warstwach tych układów mieści się w drugiej kolumnie tabeli. W kolejnych dwóch kolumnach mie-ści się wyznaczony współczynnik dyfuzji w płaszczyźnie dwuwarstwy XY – DXY oraz w trzech wymiarach – DXY Z.
podział ten wykonano w oparciu o położenie środków mas wybranych atomów lipidów. Dwuwar-stwy składające się z jednego typu lipidów, w układach dPOPC+O2 i dChol2+O2, zostały porównane z dwuwarstwami układu dPOPC-Chol50+O2, w oparciu o położenie środka ma-sy wybranych atomów POPC lub cholesterolu. Dla cząsteczek tlenu przebywających w danej warstwie zostały zebrane krzywe MSD trójwymiarowe i dwuwymiarowe (w płaszczyźnie XY) dla 50 ps nie nachodzących na siebie fragmentów symulacji. Wartości współczynnika dyfuzji D zostały wyznaczone zgodnie z opisem w podrozdziale 2.3.
Na ilustracji 3.23 przedstawiony został podział na warstwy układu dPOPC+O2i dPOPC-Chol50+O2. Podziału dokonano w oparciu o położenie środka masy atomów azotu N i węgla C31 POPC (numeracja atomów POPC mieści się na rysunku 1.3), zaznaczonych na ilustracjach za pomocą żółtych linii. Pojedyncze atomy azotu N i węgla C31 POPC zostały wyróżnione za pomocą kolorowych sfer (niebieskich i zielonych) na ilustracjach 3.23a i 3.23b. Dzięki takiemu podziałowi możliwe jest wyróżnienie w układach trzech typów warstw, cechujących się odmien-nym środowiskiem. Pierwszy typ warstwy, oznaczony jako w1 , obejmuje hydrofilowe środowisko rozpuszczalnika oraz grup cholinowych POPC. Drugi typ warstwy, oznaczony jako w2 , mieszczą-cy się między środkiem masy dla atomów azotu N i i węgla C31 ma również charakter polarny, lecz w obszarze tym gęstość atomów dwuwarstwy jest już większa niż rozpuszczalnika. Pokazują to przedstawione wcześniej ilustracje 3.20a i 3.20b, na których można zaobserwować, że gęstość lipidów jest wyższa niż gęstość rozpuszczalnika w warstwie błony ograniczonej położeniem mak-simów gęstości azotu grup cholinowych. Ostatni typ warstw, oznaczony jako w3 , ma charakter hydrofobowy i obejmuje centrum dwuwarstw, między środkiem masy atomów C31 POPC w obu listkach błony.
Przy takim podziale, w każdym z układów powstało łącznie 9 warstw (3 w1 , 4 w2 i 2 w3 ), oznaczonych na ilustracji 3.23. Dla każdej z warstw zebrano krzywe MSD o różnej liczebności, ujętej w tabeli 3.5 w drugiej kolumnie. Zdecydowanie najwięcej krzywych MSD zebrano dla
3.4. Układy podwójnych dwuwarstw lipidowych bez oraz z tlenem cząsteczkowym 93
(a) dPOPC+O2– w1 (b) dPOPC+O2 – w2 (c) dPOPC+O2 – w3
(d) dPOPC-Chol50+O2 – w1 (e) dPOPC-Chol50+O2 – w2 (f) dPOPC-Chol50+O2– w3
Rysunek 3.24: Uśrednione krzywe MSD dla cząsteczek tlenu dyfundujących w obrębie trzech typów warstw w układach dPOPC+O2 i dPOPC-Chol50+O2.
warstw w3 w układach dPOPC+O2 i dPOPC-Chol50+O2, która nie tylko jest warstwą najgrubszą, lecz także posiada najkorzystniejsze dla niepolarnych cząsteczek tlenu środowisko.
Krzywe MSD dla procesu dyfuzji analizowanego w trzech wymiarach, dla trzech typów warstw zostały uśrednione i przedstawione na panelu ilustracji 3.24. Na podstawie krzywych MSD wy-znaczono wartość współczynnika dyfuzji w płaszczyźnie XY oraz w przestrzeni dla kolejnych typów warstwy, które zebrane są w tabeli 3.5.
W przypadku dyfuzji izotropowej, wartość współczynnika dyfuzji DXY jest zbliżona do war-tości współczynnika dyfuzji DXY Z. Wartości zebrane w tabeli 3.5 wskazują, że dla dwuwarstwy dPOPC+O2 i dPOPC-Chol50+O2 dyfuzja jest anizotropowa jedynie w warstwie w2 , gdzie dyfuzja w poprzek błony jest wolniejsza niż w jej płaszczyźnie. Dla w2 wartości DXY są wyższe o ponad 30% od DXY Z i są kilkakrotnie niższe w porównaniu z warstwami w1 i w3 .
Wartość współczynnika dyfuzji DXY i DXY Z jest wyższa dla układu dPOPC-Chol50+O2
w porównaniu z dPOPC+O2 w przypadku wszystkich analizowanych warstw. Fakt ten można tłumaczyć powstawaniem wolnych przestrzeni w obrębie błony zawierającej cholesterol, któ-re ułatwiają dyfuzję w obrębie dwuwarstwy. W obszarze rozpuszczalnika wytłumaczeniem jest mniejsza liczba głów polarnych POPC przypadająca na powierzchnię błony, które mają zdolność tworzenia licznych wiązań wodorowych z cząsteczkami wody. Powstające sieci wodne mogą być znaczącą barierą dla dyfundujących cząsteczek tlenu, a efekt ten w układzie dPOPC+O2 może być większy, niż dla dPOPC-Chol50+O2 .
Układy symulacyjne dPOPC-Chol50+O2i dChol2+O2podzielone zostały na sześć warstw o różnym charakterze. Pierwsza warstwa w1 obejmuje obszar rozpuszczalnika do wysokości
środ-94 3. Wyniki
(a) dPOPC-Chol50+O2
(b) dChol2+O2
Rysunek 3.25: Podział na warstwy układów dPOPC+O2 i dChol2. Cząsteczki lipidów wyróżniono kolorem szarym, dla atomów innych niż węgiel zastosowano standardowy schemat kolorowania. Cząsteczki wody oraz niepolarne atomy wodoru zostały ukryte w celu zwiększenia przejrzystości ilustracji. Za pomocą czerwonych, łososiowych, zielonych i niebieskich sfer wyróżnione zostały atomy tlenu cząsteczkowego, tlenu grupy hydroksylowej, węgla C17 i węgla C24 cholesterolu. Żółte poziome linie wyznaczają podział układów symulacyjnych na warstwy.
3.4. Układy podwójnych dwuwarstw lipidowych bez oraz z tlenem cząsteczkowym 95
dPOPC-Chol50+O2
n(MSD) DXY[10−4 cms2] DXY Z[10−4 cms2] w1 578, 1647, 1439 0,508 ± 0,067 0,466 ± 0,094 w2 47, 42, 36, 48 0,095 ± 0,025 0,068 ± 0,021 w3 755, 711, 680, 630 0,042 ± 0,003 0,031 ± 0,005 w4 1208, 1014, 891, 880 0,029 ± 0,004 0,024 ± 0,006 w5 441, 433, 382, 382 0,042 ± 0,006 0,029 ± 0,007 w6 19518 , 13005 0,369 ± 0,072 0,252 ± 0,062
dChol2+O2
n(MSD) DXY[10−4 cms2] DXY Z[10−4 cms2] w1 304, 1829, 631 0,548 ± 0,014 0,539 ± 0,104 w2 27, 35, 36, 18 0,452 ± 0,040 0,297 ± 0,036 w3 703, 1126, 1001, 743 0,089 ± 0,013 0,061 ± 0,016 w4 14, 9, 6, 4 0,029 ± 0,032 0,037 ± 0,003 w5 438, 546, 404, 423 0,060 ± 0,023 0,041 ± 0,019 w6 2941, 11023 0,220 ± 0,066
0,518 ± 0,067
0,151 ± 0,048 0,350 ± 0,058
Tabela 3.6: Analiza procesu dyfuzji tlenu cząsteczkowego w układach dPOPC-Chol50+O2 i dChol2+O2podzielonych na sześć warstw: w1 - w6 (rys. 3.25). Liczba zebranych krzywych MSD w war-stwach układów symulacyjnych mieści się w drugiej kolumnie tabeli. W kolejnych dwóch kolumnach mie-ści się wyznaczony współczynnik dyfuzji w płaszczyźnie dwuwarstwy – DXY oraz w trzech wymiarach – DXY Z. Dla układu dChol2+O2dla warstw w6 wyznaczono osobno współczynniki dyfuzji DXY i DXY Z
dla dwóch dwuwarstw cholesterolowych.
96 3. Wyniki ka masy dla atomów tlenu O3 cholesterolu plus 9 Å w stronę warstwy wodnej. W warstwie tej, w układzie dChol2+O2 nie mieszczą się atomy lipidów, w przeciwieństwie do dwuwar-stwy dPOPC-Chol50+O2, gdzie sięgają pojedyncze atomy głów polarnych POPC. Kolejna warstwa w2 ograniczona jest położeniem środka masy atomów tlenu O3 cholesterolu plus 9 Å i środka masy atomów tlenu O3 plus 3 Å w stronę warstwy wodnej. Następna warstwa w3 o grubości 6 Å obejmuje najbliższe otoczenie środka masy atomów tlenu O3 cholesterolu, 3 Å nad i 3 Å pod nim. Warstwa w4 obejmuje obszar zajmowany przed grupę steroidową cholesterolu, między położeniem środka masy atomów tlenu O3 cholesterolu minus 3 Å, a położeniem środka masy atomów węgla C17 cholesterolu. Kolejna warstwa w5 obejmuje obszar między środkiem masy atomów węgla C17 a środkiem masy atomów węgla C24 cholesterolu. Natomiast ostatnia warstwa w6 , pomiędzy atomami C24 obu listków dwuwarstwy, zawiera obszar łańcuchów wę-glowodorowych cholesterolu, gdzie łańcuch węglowodorowy ulega rozgałęzieniu. W ten sposób otrzymano 21 warstw: 3 – w1 , 2 – w6 oraz po 3 warstwy dla w2 , w3 , w4 i w5 .
Na panelu ilustracji 3.26 przedstawione zostały uśrednione krzywe MSD w obrębie warstw układów dPOPC-Chol50+O2 i dChol2+O2. W tabeli 3.6 zebrano wyznaczone wartości współczynników dyfuzji DXY i DXY Z w sześciu warstwach w układach symulacyjnych dPOPC-Chol50+O2 i dChol2+O2. W tabeli tej, w drugiej kolumnie zamieszczono informację o liczbie zebranych 50 ps krzywych MSD. Porównując liczbę zebranych krzywych MSD można łatwo za-uważyć, że największe różnice w tej liczbie dla dwóch dwuwarstw obserwowane są dla warstwy w4 i w6 . W warstwie w4 zlokalizowane są grupy steroidowe cholesterolu, których ciasne upa-kowanie w dwuwarstwie cholesterolowej jest niekorzystne dla dyfundujących cząsteczek tlenu.
Zarówno w układzie dPOPC-Chol50+O2jak i dChol2+O2 wartości współczynników dyfuzji DXY i DXY Z są najniższe w warstwie w4 .
Z kolei warstwa w6 odpowiada położeniu reszt dwóch grup metylowych rozgałęziającego się łańcucha węglowodorowego cholesterolu. Warstwa w6 obejmuje ścisłe centrum dwuwarstw.
W układzie dChol2+O2 w dolnej dwuwarstwie dochodzi do nagromadzenia się licznych czą-steczek tlenu, a przez to do jej poszerzenia. Dlatego też w tabeli 3.6, dwie warstwy w6 ukła-du dChol2+O2 zostały przeanalizowane osobno, a kolorem czerwonym wyróżniono informacje uzyskane dla dwuwarstwy poszerzonej. Jedynie w warstwie w6 w dwuwarstwie dChol2+O2
współczynniki dyfuzji DXY i DXY Z są niższe w porównaniu z układem dPOPC-Chol50+O2
i różnica ta jest istotna statystycznie.
Wartość współczynników dyfuzji dla cząsteczek tlenu, zarówno w płaszczyźnie XY jak i w prze-strzeni, są najwyższe w środowisku wodnym, co widać w warstwie w1 dla układu dPOPC-Chol50+O2 oraz w1 i w2 dla układu dChol2+O2. Najniższe wartości parametrów DXY
i DXY Z otrzymane zostały w warstwie w4 .
Na ilustracji 3.27 przedstawiono profile gęstości masy oraz iloczyn współczynnika dyfuzji DXY Z i stężenia C tlenu cząsteczkowego dla górnej dwuwarstwy w układach dPOPC+O2, dPOPC-Chol50+O2 i dChol2+O2. W eksperymentach spektroskopii EPR metoda oksyme-tryczna polega na wyznaczeniu parametru transportu tlenu, który proporcjonalny jest do iloczy-nu DXY Z∗ C (Subczynski i inni, 1989; Subczynski i Swartz, 2005). Iloczyn ten wykorzystywany
3.4. Układy podwójnych dwuwarstw lipidowych bez oraz z tlenem cząsteczkowym 97
(a) dPOPC-Chol50+O2 - w1 (b) dPOPC-Chol50+O2 - w2 (c) dPOPC-Chol50+O2- w3
(d) dPOPC-Chol50+O2 - w4 (e) dPOPC-Chol50+O2- w5 (f) dPOPC-Chol50+O2 - w6
(g) dChol2+O2 - w1 (h) dChol2+O2 - w2 (i) dChol2+O2 - w3
(j) dChol2+O2 - w4 (k) dChol2+O2- w5 (l) dChol2+O2 - w6
Rysunek 3.26: Uśrednione krzywe MSD dla cząsteczek tlenu dyfundujących w obrębie sześciu typów warstw w układach dPOPC-Chol50+O2 i dChol2+O2.
98 3. Wyniki
(a) dPOPC+O2 (b) dPOPC-Chol50+O2
(c) dChol2+O2 (d) dPOPC-Chol50+O2
Rysunek 3.27: Profile wartości iloczyniu współczynnika dyfuzji i stężenia tlenu cząsteczkowego oraz profile gęstości wzdłuż osi Z dla górnej dwuwarstwy w układach dPOPC+O2(a), dPOPC-Chol50+O2
(b) i (d), dChol2+O2(c). Profile wartości współczynnika dyfuzji przedstawiono czarną przerywaną linią, skalę zamieszczono z prawej strony wykresów. Na wykresach czarna, niebieska i czerwona linia odpowia-dają rozkładowi gęstości dla atomów dwuwarstwy, rozpuszczalnika i tlenu. Dodatkowo, na wykresach (b) i (d) przedstawiony został udział w profilach gęstości cząsteczek cholesterolu (żółta linia) oraz POPC (zielona linia).
3.4. Układy podwójnych dwuwarstw lipidowych bez oraz z tlenem cząsteczkowym 99 jest do wyznaczania współczynnika przepuszczalności tlenu dla błon w układach będących w równowadze termodynamicznej, gdzie próbka umieszczona jest w powietrzu atmosferycznym.
Ze względu na różnicę w zawartości tlenu w układach obliczeniowych w porównaniu z bada-nymi doświadczalnie, wyznaczenie wartości współczynnika przepuszczalności tlenu dla układów symulacyjnych jest bezcelowe. Jednakże, sam iloczyn współczynnika dyfuzji DXY Z i stężenia C tlenu cząsteczkowego dla układów symulacyjnych pozwala na jakościowe porównanie wyników obliczeniowych z doświadczalnymi.
Eksperymentalne wyznaczenie współczynnika przepuszczalności tlenu na różnych głęboko-ściach błony wykonywane jest w oparciu o znaczniki spinowe. W przypadku eksperymentu re-ferencyjnego (Raguz i inni, 2008) wykorzystano 7 znaczników fosfolipidowych i dwa znaczniki będące pochodnymi cholesterolu. Pierwsze 7 znaczników umożliwia badanie błon w regionie głów polarnych (jeden znacznik T-PC) oraz w hydrofobowm wnętrzu domeny PCD na 6 głęboko-ściach. Dwa ostatnie znaczniki spinowe (ASL i CSL) mogą lokalizować się zarówno w obrębie domeny PCD jak i CBD i umożliwiają badanie błony na głębokości dwóch krańców grupy steroidowej.
Wyniki otrzymane eksperymentalnie dla domeny PCD pokazują wzrost iloczynu DXY Z∗C, ilustracja 11 (Raguz i inni, 2008), począwszy od regionu głów polarnych aż do głębokości zajmo-wanej przez grupę nitroksydową przyłączoną na wysokości atomu węgla C29 POPC (numeracja atomów POPC mieści się na rys. 1.3). Zgodnie z wynikami przedstawionymi w podrozdziale 3.2 (podsumowanymi na ilustracji 3.9d) znacznik spinowy z grupą nitroksydową na tej pozycji pozwala na uzyskanie informacji o lokalnych warunkach na granicy grupy steroidowej i łańcucha węglowodorowego cholesterolu. Poniżej tej głębokości obserwowany jest zdecydowanie większy wzrost wartości parametru transportu tlenu. Przedstawiony profil iloczynu DXY Z∗C na ilustra-cjach 3.27b i 3.27d pokazuje wynik zgodny z otrzymanym eksperymentalnie. Wartość iloczynu DXY Z∗C rośnie w głąb domeny PCD i jest najwyższa w centrum domeny, w regionie łańcuchów węglowodorowych cholesterolu.
Dla domeny CBD eksperymentalnie otrzymano pomiar na dwóch głębokościach błony. W przypadku pomiaru dla cholesterolu znakowanego grupą nitroksydową przy atomie węgla C3 otrzymano wartość współczynnika przepuszczalności tlenu zbliżoną do domeny PCD na tej samej głębokości. Wartość tego parametru jest nieznacznie wyższa dla cholesterolu z przyłączoną grupą nitroksydową do węgla C17 cholesterolu, która jest jednocześnie niższa niż dla domeny PCD. Również ten wynik jest zgodny z otrzymanym obliczeniowo. O ile otrzymana wartość współczynnika dyfuzji DXY Z w warstwach w4 i w5 jest porównywalna dla układów dPOPC-Chol50+O2i dChol2+O2, to stężenie tlenu cząsteczkowego na tej wysokości jest zdecydowanie niższe dla układu dChol2+O2 (patrz rys. 3.20b i 3.20c).
3.4.7 Dyskusja wyników
Celem tej części pracy było zbadanie wpływu różnej zawartości cholesterolu w matrycy lipido-wej na proces dyfuzji tlenu cząsteczkowego. W podrodziale 3.4 zbadano trzy układy symulacyjne
100 3. Wyniki zawierające tlen cząsteczkowy.
Cząsteczki tlenu, które początkowo umieszczono w środkowej warstwie rozpuszczalnika w ukła-dach symulacyjnych dPOPC+O2, dPOPC-Chol50+O2i dChol2+O2, w większości przedy-fundowały do hydrofobowego wnętrza dwuwarstw lipidowych, gdzie przebywały przez większość czasu trwania symulacji. Przedstawione na ilustracji 3.22 trajektorie ruchu wybranych cząste-czek tlenu w obrębie układów dPOPC+O2, dPOPC-Chol50+O2 i dChol2+O2 pokazują, że w miarę wzrostu zawartości cholesterolu w błonach, przebieg ścieżek dyfuzji ulega znacznej modyfikacji.
Dla układów symulacyjnych różniących się składem lipidowym, otrzymano odmienne roz-kłady gęstości tlenu cząsteczkowego w obrębie dwuwarstw. Obecność grup steroidowych w dwu-warstwach przekłada się na obniżenie gęstości tlenu na tej głębokości (rys.3.20). W układzie dChol2+O2, ze względu na dużą gęstość w tym regionie, profil gęstości tlenu cząsteczkowe-go przyjmuje tam wartości bliskie zeru. Wynikiem tecząsteczkowe-go jest m.in. wzrost gęstości tlenu czą-steczkowego w wąskim pasie centrum dwuwarstwy dChol2+O2, zajmowanym przez łańcuchy węglowodorowe cholesterolu.
Analiza porównawcza procesu dyfuzji (paragraf 3.4.6) w układach dPOPC+O2, dPOPC-Chol50+O2 i dChol2+O2 pokazała, że jest on najszybszy w warstwie wodnej układów symu-lacyjnych, a wartość współczynnika dyfuzji maleje wraz ze wzrostem gęstości lipidów w regionie głów polarnych. Z kolei w hydrofobowym wnętrzu dwuwarstw lipidowych wartość współczyn-nika dyfuzji rośnie w stronę centrum błon. W pracach prof. Subczyńskiego (Subczynski i inni, 2012) postulowane jest istnienie hydrofobowych kanałów w centrum dwuwarstw, które ułatwiają dyfuzję tlenu i innych małych niepolarnych cząsteczek.
Uzyskane profile wartości iloczynu DXY Z∗ C (rys. 3.27) są zgodne z profilami uzyskanymi eksperymentalnie. W porównaniu z metodą eksperymentalną spektroskopii EPR ograniczonej dostępnością znaczników spinowych, zaprezentowane wyniki cechują się wyższą rozdzielczością.
Jest to szczególnie ważne w przypadku domeny CBD, dla której do tej pory uzyskane dane ograniczały się do dwóch głębokości domeny. Otrzymane obliczeniowo wyniki pokazują znaczny wzrost wartości iloczynu DXY Z∗ C w regionie łańcuchów węglowodorowych cholesterolu domen PCDi CBD.