Błony biologiczne są cienkimi dwuwarstwowymi strukturami otaczającymi każdą komórkę oraz struktury subkomówkowe. Ich podstawową funkcją jest odgrodzenie i zapewnienie integral-ności organellom komórkowym oraz samej komórce. Głównymi składnikami błon biologicznych są lipidy i białka, których udział zależy od jej rodzaju. Błony biologiczne są selektywnie przepusz-czalne, dlatego też skład białkowo-lipidowy decyduje o możliwości przekazywania i odbierania sygnałów z zewnątrz. Wagowy udział białek suchej masie ludzkich błon komórkowych wynosi
2Glutation (GSH) jest tripeptydem o właściwościach przeciwutleniających, składającym się z reszt kwasu glutaminowego, cysteiny i glicyny. Jego działanie przeciwutleniające w białkach polega na odtwa-rzaniu grup tiolowych (-SH), które uległy utlenieniu do grup sulfonowych (-SO3H) i wiązań disiarczkowych (-S-S-). Glutation jest substratem dla peroksydazy glutationowej, która redukuje nadtlenek wodoru i nad-tlenki organiczne, takie jak utlenione lipidy. Utlenioną formą glutationu jest dimer (GS-SG) połączony mostkiem disiarczkowym, który redukowany jest przez reduktazę glutationową.
1.3. Morfologia błon biologicznych 15 zwykle ~50%, ale może znacząco odbiegać od wartości średniej. Najniższe stężenie białek, miesz-czące się w zakresie 15-30% suchej masy, zaobserwowano w błonach komórek otoczki mielinowej włókien nerwowych. Najwyższe ~75% suchej masy w błonach wewnętrznych mitochondriów.
Jednakże, nawet w błonach o najwyższym udziale białek, największa część powierzchni błony przypada na matrycę lipidową (Dupuy i Engelman, 2008).
Rysunek 1.2: Porównanie struktury czterech głównych klas lipidów błon biologicznych: glicerofosfo-lipidu (a, PC(16:0/18:1(9Z)), sfingoglicerofosfo-lipidu (b, SM(d18:1/12:0)), glikoglicerofosfo-lipidu (c, GlcCer(d18:0/18:1(9Z))) i cholesterolu (d).
Skład białkowo-lipidowy błon biologicznych zależy od ich źródła, od organizmu oraz funkcji pełnionej przez komórki. Czterema głównymi klasami lipidów błonowych są: fosfolipidy (gli-cerofosfolipidy i sfingofosfolipidy), glikolipidy i steroidy, przedstawione na rysunku 1.2. W ich budowie wyróżnia się region hydrofobowy skierowany do centrum błony i hydrofilowy skierowa-ny do rozpuszczalnika. W przypadku fosfolipidów i glikolipidów, w skład regionu hydrofobowego wchodzą zwykle reszty kwasów tłuszczowych, sfingozyny lub podobnych cząsteczek. Są one zróż-nicowane jeśli chodzi o ich długość, która zwykle mieści się między 14 a 22 atomami węgla, oraz stopień nasycenia. Hydrofobowe wnętrze błony o bardzo ograniczonym kontakcie z cząsteczkami wody, w komórkach zwierzęcych zawiera również płaskie grupy steroidowe cholesterolu znacząco wpływające na właściwości błon.
Hydrofobowe łańcuchy węglowodorowe połączone są z tak zwanymi łącznikami, od których zaczyna się region polarny lipidów. Łącznikami mogą być, przedstawione na rysunku 1.2, reszta glicerolowa (estryfikowana w pozycji β i γ) lub reszta sfingozyny, przyłączona za pomocą wiązań estrowych lub amidowych. W glicerofosfolipidach i sfingolipidach do reszty glicerolu w pozycji
16 1. Wstęp α lub sfingozyny przyłączona jest grupa fosforanowa, która zwykle połączona jest wiązaniem estrowym z kolejną cząsteczką. Obserwowane jest duże zróżnicowanie tych występujących po grupie fosforanowej cząsteczek, są to aminoalkohole (cholina, etanoloamina), aminokwasy (sery-na), alkohole (inozytol, glicerol) i reszty cukrowe. W przypadku glikolipidów do reszty glicerolu lub sfingozyny przyłączona jest reszta cukrowa, rys. 1.2c. Region hydrofilowych głów polarnych potrafi być niezwykle zróżnicowany pod kątem ich objętości, powierzchni przypadającej na lipid, rozkładu ładunków, stopnia hydratacji i wielu innych cech, które wpływają na charakterystykę tworzonych błon.
Białka błonowe są niezwykle ciekawą grupą makrocząsteczek, obejmującą białka powierzch-niowe i integralne, częstokroć specyficzne dla wybranego typu komórki. Pełnią one funkcje re-ceptorów, transporterów, enzymatyczne lub adhezyjne. Ważną ich wspólną cechą jest to, że nie zachodzi przez nie dyfuzja tlenu.
1.3.1 Metody eksperymentalne wykorzystywane do badania ukła-dów błonowych
Najczęściej używanymi technikami eksperymentalnymi, wykorzystywanymi w badaniu błon biologicznych i modelowych są: metody spektroskopowe (fluorescencyjne, elektronowego rezona-nansu paramagnetycznego EPR i magnetycznego rezorezona-nansu jądrowego NMR), analiza rentge-nowska niskokątowa i skaningowa kalorymetria różnicowa DSC.
Spektroskopia fluorescencyjna oparta jest na cząsteczkach znakowanych grupami chromo-forowymi, które absorbują, a następnie emitują światło o spektrum długości fali przesuniętym w stronę dłuższych fal. Pomiar natężenia fluorescencji pozwala na badanie takich właściwo-ści jak przejwłaściwo-ścia fazowe błon biologicznych (Korlach i inni, 1999). Natomiast metody FRAP (ang. Fluorescence Recovery After Photobleaching) (Axelrod i inni, 1976) i FCS (ang. Flu-orescence Correlation Spectroscopy) (Lipari i Szabo, 1980) pozwalają na badanie ruchliwości lateralnej w badanych błonach.
Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego EPR wykorzystuje lipidy z do-łączonymi znacznikami spinowymi, które w porównaniu do grup chromoforowych cechują się małymi rozmiarami. Najczęściej wykorzystywanymi znacznikami spinowymi są stabilne grupy nitroksylowe. Dzięki dołączeniu znacznika w różnych pozycjach cząsteczki lipidu możliwe jest badanie lokalnego środowiska na różnych głębokościach dwuwarstwy. Spektroskopia elektrono-wego rezonansu paramagnetycznego pozwala na badanie struktury błon i organizacji lipidów (Subczynski i inni, 2010), profili hydrofobowości i innych właściwości (Subczynski i inni, 1994), przejść fazowych (Subczynski i inni, 2007) oraz budowy domenowej (Mainali i inni, 2013).
Do badania składu lipidowego wykorzystywana jest również spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego NMR pozwalająca na uzyskanie opisu nienaruszonych błon biologicznych w oparciu o naturalnie występujące centra paramagnetyczne w błonach (1H,2H,13C lub 31P).
Z eksperymentów wykonanych za pomocą spektroskopii NMR otrzymywany jest opis przejść
1.3. Morfologia błon biologicznych 17 fazowych, upakowania lipidów, ich orientacji i właściwości elastycznych błon składających się z białek i lipidów (Grélard i inni, 2010).
Skaningowa kalorymetria różnicowa DSC (ang. Differential Scanning Calorimetry) polega na pomiarze ciepła absorbowanego przez badaną próbkę w trakcie przemiany termicznej. Metoda ta wykorzystywana jest do obserwacji przejść fazowych w błonach oraz charakterystyki tych przejść (Mabrey i Sturtevant, 1976).
Dzięki zastosowaniu metody analizy rentgenowskiej niskokątowej możliwe jest obserwowa-nie i scharakteryzowaobserwowa-nie domen w obrębie badanych błon nawet o wielkościach nanometrowych (Pencer i inni, 2005). Technika ta polega na analizie obrazów rentgenowskich powstałych dla promieni rozproszonych na strukturach znacznie większych niż długość fali promieniowania i sko-limowanych z dala od głównej wiązki światła.
Najważniejszymi z punktu widzenia przedstawianej pracy technikami eksperymentalnymi, są spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego EPR, skaningowa kalorymetria różnicowa DSC oraz niskokątowa analiza rentgenowska. Te metody wykorzystywane są do ba-dania błon w postaci liposomów powstałych z mieszaniny lipidów. Ze względu na to, że wybór metody preparatyki liposomów nie jest obojętny dla otrzymanych wyników, dwie takie metody zostały opisane poniżej.
Pierwszą metodą preparatywną przygotowania liposomów jest metoda depozycji lipidów (ang. Film Deposition Method) w postaci cienkiego suchego filmu osadzonego na ściankach na-czynia. Z filmu lipidowego otrzymywane są liposomy w wyniku jego hydratacji. Drugą techniką jest metoda gwałtownej wymiany rozpuszczalnika (ang. Rapid Solvent Exchange Method), gdzie liposomy otrzymywane są w wyniku szybkiej wymiany lipidów między rozpuszczalnikiem orga-nicznym a środowiskiem wodnym (Buboltz i Feigenson, 1999). Pierwsza z tych metod ze względu na istnienie stanu pośredniego suchego filmu lipidowego może prowadzić do powstawania arte-faktów, co zostało opisane bardziej szczegółowo w dalszej części pracy (podrozdział 1.9)
1.3.2 Morfologia błon komórek włókien soczewki oka
Błony plazmatyczne komórek włókien soczewki oka charakteryzują się unikalnym składem lipidowym i białkowym. W większości błon komórek ssaczych cholesterol stanowi nie więcej niż 50 % molowych wszystkich lipidów (Epand, 2003), natomiast w błonach komórek włókien może stanowić ponad 70 % molowych. Skład lipidowy komórek soczewki oka zmienia się z ich wiekiem.
Podczas dojrzewania, wraz z utratą wszystkich organelli komórkowych, błona komórkowa staje się jedynym typem błony w obrębie komórek włókien soczewki.
1.3.3 Białka błon komórek włókien soczewki oka
Błony komórek włókien są nieprzepuszczalne dla kationów, dlatego też za utrzymanie ho-meostazy odpowiadają białka błonowe: Ca2+-ATPazy, Na,K-ATPazy oraz akwaporyny (AQP).
ATPazy wykorzystują energię z hydrolizy ATP podczas procesu usuwania kationów wapnia
18 1. Wstęp z wnętrza komórek w przypadku Ca2+-ATPazy, oraz podczas transportu kationów sodu i potasu w przypadku Na,K-ATPazy.
Utrzymanie homeostazy kationów wapnia w soczewce przez Ca2+-ATPazy jest niezbędne dla jej przezroczystości. Aktywność tego białka modulowana jest przez otoczenie, jest ona 2-3 razy większa w dwuwarstwie w fazie ciekłokrystalicznej uporządkowanej lo, czyli takiej jak błona komórek włókienkowych, niż w dwuwarstwie w fazie ciekłokrystalicznej nieuporządkowanej ld
(Tang i inni, 2006). Aktywność Ca2+-ATPazy jest mniejsza o około 50% w soczewkach objętych zaćmą (Paterson i inni, 1997).
Oprócz regulacji objętości komórek Na,K-ATPazy, poprzez tworzenie gradientu sodu w po-przek soczewki, umożliwiają funkcjonowanie innych białek transportowych, które potrzebują go do transportu glutationu, glukozy i innych składników odżywczych (Kannan i inni, 1996), (Mantych i inni, 1993).
Akwaporyna-0 (oznaczana skrótowo AQP0 lub MIP) funkcjonuje jako kanał wodny lub biał-ko adhezyje, obie te funkcje są niezwykle ważne dla soczewki oka ale nie mogą być pełnione przez dane białko jednocześnie. Akwaporyna-0 w błonie ma tendencję do tworzenia tetramerów, choć należy zwrócić uwagę, że kanały wodne mieszczą się w obrębie pojedynczego monomeru. Prawi-dłowa funkcja kanałów wodnych jest oczywiście związana z transparentnością soczewki. Badania na mysich soczewkach, na różnym stadium rozwoju, pokazały korelację między uzyskaniem peł-nej transparentności soczewki, a jej przepuszczalnością dla wody (Varadaraj i inni, 2007). Prze-puszczalność akwaporyny-0 wzrasta wraz ze wzrostem stężenia kationów wapnia Ca2+ i cynku Zn2+. Kationy wapnia Ca2+umożliwiają związanie do C-końca białka MIP kalmoduliny, która je aktywuje i stymuluje (Kalman i inni, 2006). Natomiast kationy cynku Zn2+stabilizują strukturę tetrameru AQP0, co pozytywnie wpływa na stabilność kanałów wodnych (Chepelinsky, 2009).
Tetramery akwaporyny dwóch przystających błon mogą utworzyć połączenia (Gruijters, 1989).
Wiąże się to z wcześniejszą modyfikacją AQP0, polegającą na skróceniu białka na C-końcu mieszczącego się w przestrzeni międzykomórkowej, a przez to utratą funkcji kanału wodnego.
Modyfikacje AQP0 są najintensywniejsze w obrębie jądra soczewki (Gonen i inni, 2004). Mu-tacje w genie kodującym AQP0 wiążą się z rozwojem dziedzicznej odmiany zaćmy. Całkowity brak tego białka prowadzi do tworzenia się soczewki o nieprawidłowej architekturze, związa-nej z brakiem zdolności do utworzenia się szwów soczewki, a przez to pozbawiozwiąza-nej prawidłowej akomodacji.
1.3.4 Skład lipidowy błon komórek włókien soczewki oka
Błona plazmatyczna komórek włókien soczewki oka cechuje się unikalnym składem z powodu wysokiej zawartości cholesterolu i niskiej zawartości wielonienasyconych kwasów tłuszczowych.
Skład zrąbu lipidowego komórek włókienkowych jest uzależniony od wieku soczewki i jest różny w warstwach korowych i jądra soczewki (Li i inni, 1985).
Zrąb lipidowy błon komórek włókien soczewki oka różni się między gatunkami zwierząt, został nawet zaobserwowany związek między stosunkiem cholesterolu do fosfolipidów a
długo-1.3. Morfologia błon biologicznych 19 ścią życia różnych gatunków zwierząt (Borchman i Yappert, 2010). U gatunków długo żyjących, takich jak człowiek, głównymi fosfolipidami błon komórek włókien soczewki są sfingomieliny, ce-chujące się niezwykłą stabilnością struktury. Sfingomielina jest typem sfingolipidu składającego się ze sfingozyny, reszty kwasu tłuszczowego, reszty fosforanowej oraz reszty choliny (rys. 1.2b) (Borchman i Yappert, 2010). Natomiast u zwierząt o krótkim czasie życia głównymi fosfolipi-dami są fosfatydylocholiny, których przykład przedstawiono na ilustracji 1.2a (Borchman i inni, 2004).
Błona komórek włókienkowych ludzkiej soczewki oka cechuje się wysoką zawartością chole-sterolu, plazmalogenu3 i dihydroksysfingomieliny. Stężenie tego ostatniego lipidu jest najwyższe u człowieka, w porównaniu z innymi gatunkami zwierząt, i stanowi prawie 50% wszystkich fosfo-lipidów. Ze względu na nasycenie wiązania między węglem C4 i C5 w łańcuchu reszty sfingozyny (zaznaczone na rys. 1.2b), dihydroksysfingomielina może uczestniczyć w tworzeniu wiązań wodo-rowych międzycząsteczkowych z cholesterolem i fosfolipidami (Yappert i Borchman, 2004). Jak już wspomniano, sfingomieliny cechują sie niezwykłą stabilnością, z kolei plazmalogen i chole-sterol mają właściwości przeciwutlaniające. Plazmalogen, dzięki obecności wiązania podwójnego w łańcuchu węglowodorowym jest łatwym celem dla reaktywnych form tlenu i innych utleniaczy, przez co chroni fosfolipidy o nienasyconych wiązaniach (Gorgas i inni, 2006). Z kolei utlenione formy cholesterolu są trwałe, dzięki czemu, w przeciwieństwie do fosfolipidów, nie pozwalają na propagację utleniania składników komórki. Dodatkowym przeciwutleniaczem błon lipidowych jest rozpuszczalna w tłuszczach witamina E.
U człowieka wraz z dojrzewaniem komórek włókien soczewki wzrasta stężenie cholesterolu i sfingomielin (zwłaszcza dihydroksysfingomieliny), a maleje glicerofosfolipidów. Wysoka zawar-tość cholesterolu, sfingomielin i śladowe ilości wielonienasyconych kwasów tłuszczowych zapew-niają stabilność fizyczną i chemiczną błon komórek włókien soczewki oka. Różnicom w składzie lipidowym różnych gatunków zwierząt oraz zmianom zachodzącym z wiekiem poświęcone jest wiele artykułów, z których na największą uwagę zasługują: cykl prac eksperymentalnych grupy prof. Douglasa Borchmana i dwie prace przeglądowe (Yappert i Borchman, 2004) i (Borchman i Yappert, 2010), a także prace prof. Subczyńskiego eksperymentalne i przeglądowe (Subczynski i inni, 2012).
Wysoka zawartość cholesterolu prowadzi do tworzenia się domen cholesterolowych w obrębie błon komórkowych, których badanie eksperymentalne okazało się niezwykle problematyczne.
Pewne formy agregatów cholesterolowych zostały zaobserwowane w badanych układach mode-lowych za pomocą szeregu metod eksperymentalnych: skaningowej kalorymetrii różnicowej DSC (Epand, 2003), dyfrakcji rentgenowskiej (Preston Mason i inni, 2003) i neutronowej (Knoll i inni, 1985), spektroskopii NMR (Epand, 2003) oraz znakowania spinowego wykorzystującego spektro-skopię elektronowego rezonansu paramagnetycznego EPR (Raguz i inni, 2011a; Mainali i inni,
3Plazmalogen jest fosfoglicerolipidem eterowym, w którym łańcuch węglowodorowy na pozycji γ przyłączony jest wiązaniem eterowym i posiada wiązanie podwójne między pierwszym i drugim atomem węgla łańcucha alkilowego. Plazmalogen znajdywany jest w wielu ludzkich tkankach ale jego zawartość jest najwyższa w tkance nerwowej i układzie krwionośnym.
20 1. Wstęp 2012a). We wszystkich tych eksperymentach badania wykonane zostały na błonach modelowych, otrzymanych z ekstraktów lipidów.
Interpretacja wyników większości wspomnianych powyżej metod wskazała na istnienie krysz-tałów cholesterolowych (CCD, ang. cholesterol crystal domain) w obrębie błon komórek włó-kienkowych, zarówno kryształów jednowodnych jak i bezwodnych. Jedynie ostatnia z powyż-szych metod eksperymantalnych, spektroskopia EPR, wskazała istnienie innej formy agregatów tzw. "prawdziwej domeny cholesterolowej" (CBD, ang. cholesterol bilayer domain), której struk-tura jest płynna, tak jak otaczającej ją domeny PCD (ang. phospholipid-cholesterol domain).
Ruchliwość cholesterolu w domenie CBD jest porównywalna z ruchliwością cholesterolu w ota-czającej dwuwarstwie, a więc w błonie fosfolipidowej nasyconej cholesterolem (Mainali i inni, 2013).
Obserwacja dwóch tak odmiennych strukturalnie agregatów cholesterolu stawia przed środo-wiskiem naukowym szereg ważnych pytań. Pierwsze, czy forma krystaliczna CCD jest jedynie artefaktem doświadczalnym lub preparatywnym, czy może występuje ona w soczewce oka? A jeżeli tak, to czy jej występowanie jest stanem fizjologicznym, czy patologicznym soczewki oka?
Kolejne pytanie brzmi: jaka jest struktura i funkcja domen CBD w obrębie soczewki oka?
Następne, jaki jest związek między dwoma typami agregatów cholesterolu, CCD i CBD, czy występują one od siebie niezależnie, czy też kryształy cholesterolu powstają poprzez wytrącenie się domen CBD z błon komórek włókienkowych?
Najnowsze wyniki eksperymentalne otrzymane za pomocą spektroskopii EPR pokazują, że przepuszczalność błon komórek włókien jądra soczewki jest niższa niż komórek kory soczewki (Raguz i inni, 2011a). Pozostaje pytaniem otwartym, czy obniżona przepuszczalność błon komó-rek włókien jądra soczewki wynika ze zmiany zawartości cholesterolu, czy innych parametrów?