Komputerowy model błony komórki włókienkowej soczewki oka

(1)

Uniwersytet Jagielloński

Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii

Komputerowy model błony komórki włókienkowej soczewki oka

Elżbieta Plesnar

Promotor:

Prof. dr hab. Marta Pasenkiewicz-Gierula

Praca Doktorska

wykonana w Zakładzie Biofizyki Obliczeniowej i Bioinformatyki

Kraków, 2014

(2)

(3)

“I believe God gave us science to show He exists. One hundred years ago, we didn’t have the tools to see all this. Science tells us there must be something else. It takes an intelligent designer to produce the level of complexity in our world."

Douglas Borchman (Professor of Ophthalmology & Visual Sciences)

Podziękowania

Pragnę podziękować za ciekawy temat pracy doktorskiej, opiekę naukową, poświęcony czas i okazaną życzliwość Pani prof. Marcie Pasenkiewicz-Gieruli.

Profesorowi Karolowi Subczyńskiemu dziękuję za owocną współpracę, pomoc i wielką serdeczność.

Wszystkim pracownikom i doktorantom Zakładu Biofizyki Obliczeniowej i Bioinformatyki dziękuję za lata współpracy. W szczególności dziękuję dr. Krzysztofowi Baczyńskiemu i dr. Michałowi Markiewiczowi za okazaną pomoc, przyjacielskość, szczerość i rozwijające rozmowy.

Szczególne podziękowania dedykuję mojemu mężowi Jackowi, Mamie i Najbliższym.

(4)

(5)

Spis treści

1 Wstęp 11

1.1 Struktura i funkcja soczewki oka . . . 11

1.2 Tlen w soczewce oka . . . 13

1.3 Morfologia błon biologicznych . . . 14

1.3.1 Metody eksperymentalne wykorzystywane do badania układów bło- nowych . . . 16

1.3.2 Morfologia błon komórek włókien soczewki oka . . . 17

1.3.3 Białka błon komórek włókien soczewki oka . . . 17

1.3.4 Skład lipidowy błon komórek włókien soczewki oka . . . 18

1.4 Białka cytoplazmatyczne . . . 20

1.5 Zaćma i zmiany w soczewce oka związane z wiekiem . . . 21

1.5.1 Zaćma soczewki oka . . . 21

1.5.2 Zmiany w soczewce oka związane z wiekiem . . . 23

1.6 Porównanie ludzkiej soczewki oka ze zwierzęcymi . . . 24

1.7 Cholesterol . . . 26

1.7.1 Źródło i regulacja ilości cholesterolu . . . 27

1.7.2 Cholesterol w fizjologii i patologii . . . 27

1.7.3 Struktura chemiczna cholesterolu . . . 29

1.8 Diagramy fazowe . . . 29

1.8.1 Układy o zerowej lub niskiej zawartości cholesterolu . . . 30

1.8.2 Układy z cholesterolem, poniżej progu rozpuszczalności . . . 31

1.8.3 Układy po przekroczeniu wartości progowej dla rozpuszczalności cholesterolu . . . 31

1.9 Organizacja lipidów . . . 32

1.10 Cele pracy . . . 34

2 Materiały i metody 35 2.1 Symulacje dynamiki molekularnej . . . 35

1

(6)

2 SPIS TREŚCI

2.1.1 Postać funkcji potencjału . . . 35

2.1.2 Parametry funkcji potencjału . . . 37

2.1.3 Parametry kontrolujące przebieg symulacji . . . 37

2.1.4 Metoda Umbrella Sampling . . . 38

2.2 Budowa układów symulacyjnych . . . 38

2.2.1 Budowa układów POPC, POPC-Chol50, Chol, Chol2 . . . . 40

2.2.2 Budowa układów 4POPC-Chol50 i 4Chol2 . . . . 42

2.2.3 Budowa układów symulacyjnych podwójnych dwuwarstw . . . 42

2.2.4 Układy wykorzystane w procedurze Umbrella Sampling . . . 43

2.2.5 Budowa dwuwarstw domenowych . . . 43

2.3 Definicja parametrów błonowych wyznaczanych w pracy . . . 47

2.4 Metody statystyczne . . . 53

2.5 Tesselacja Woronoja . . . 53

2.6 Najczęściej stosowane oprogramowanie . . . 54

3 Wyniki 57 3.1 Równoważenie układów symulacyjnych . . . 57

3.2 Porównanie dwuwarstwy POPC i POPC-Chol50 . . . . 62

3.2.1 Pole powierzchni przypadające na lipid i grubość błony . . . 62

3.2.2 Molekularny parametr uporządkowania Smol . . . . 63

3.2.3 Nachylenie łańcuchów fosfolipidowych . . . 66

3.2.4 Izomeryzacja trans-gauche . . . . 66

3.2.5 Rozkład wertykalny atomów . . . 68

3.2.6 Gładkość powierzchni dwuwarstw . . . 70

3.2.7 Dyskusja wyników . . . 73

3.3 Porównanie dwuwarstwy POPC-Chol50 i Chol2 . . . . 74

3.3.1 Opis dwuwarstw . . . 74

3.3.2 Pole powierzchni przypadające na lipid i grubość błony . . . 74

3.3.3 Molekularny parametr uporządkowania Smol . . . 74

3.3.4 Nachylenie cząsteczek cholesterolu . . . 77

3.3.5 Dyfuzja translacyjna i rotacyjna cząsteczek cholesterolu . . . 77

3.3.6 Wiązania wodorowe cholesterol-woda . . . 83

3.4 Układy podwójnych dwuwarstw lipidowych bez oraz z tlenem cząsteczkowym 84 3.4.1 Opis dwuwarstw . . . 84

3.4.2 Średnie pole powierzchni pudełka symulacyjnego A_box . . . 85

3.4.3 Grubość dwuwarstw . . . 86

3.4.4 Profile gęstości . . . 86

(7)

SPIS TREŚCI 3

3.4.5 Wertykalna trajektoria tlenu w układach . . . 89

3.4.6 Dyfuzja tlenu cząsteczkowego . . . 90

3.5 Dwuwarstwy domenowe . . . 100

3.5.1 Opis dwuwarstw . . . 100

3.5.2 Średnie pole powierzchni przypadające na lipid . . . 102

3.5.3 Względne położenie domen na początku symulacji . . . 105

3.5.4 Zmiana kształtu domen w trakcie symulacji . . . 105

3.5.5 Organizacja lipidów w obrębie układów domenowych . . . 107

3.5.6 Oddziaływania międzycząsteczkowe . . . 110

3.6 Badanie procesu dyfuzji tlenu cząsteczkowego przez dwuwarstwy . . . 114

4 Podsumowanie 121 Spis rysunków . . . 122

Spis tabel . . . 133

(8)

(9)

Wykaz ważniejszych skrótów i oznaczeń.

Skrót Opis Chol cholesterol

POPC 1–palmitilo–2–oleilo-sn–fosfatydylcholina PAL łańcuch palmitynowy POPC

OLE łańcuch oleinowy POPC

LDL lipoproteina niskiej gęstości (ang. Low Density Lipoprotein) HDL lipoproteina wysokiej gęstości (ang. High Density Lipoprotein) POPC domena fosfolipidowa lub układ symulacyjny opisany w tab. 1

PCD

domena fosfolipidowa nasycona cholesterolem (ang. phospholipid-cholesterol do- main). W przypadku domeny PCD liczącej 200 lipidów stosowane jest wymiennie oznaczenie POPC-Chol50

CBD domena cholesterolowa o strukturze płynnej (ang. cholesterol bilayer domain) CCD domena cholesterolowa o strukturze krystalicznej (ang. cholesterol crystal doma-

in)

s₀ faza żelowa

lo faza ciekłokrystaliczna uporządkowana l_d faza ciekłokrystaliczna nieuporządkowana A_L średnie pole powierzchni przypadające na lipid A_box średnie pole powierzchni pudełka symulacyjnego

d_{P P} grubość dwuwarstwy mierzona w oparciu o położenie atomów fosforu P POPC dCC grubość dwuwarstwy mierzona w oparciu o położenie atomów węgla C3 cholesterolu

5

(10)

6 Wykaz skrótów Skrót Opis

Smol parametr uporządkowania

RP parametr szorstkości dwuwarstwy (ang. Roughness Parameter) MSD średnie przesunięcie kwadratowe (ang. Mean Square Displacement)

RAF funkcja autokorelacji rotacyjnej (ang. Rotational Autocorrelation Function) PMF Potencjał Średniej Siły (ang. Potential of Mean Force)

Ð→

N wektor normalny do błony

θ_{P AL} kąt nachylenia łańcucha PAL POPC (∡Ð→

NÐÐÐÐ→C₃₃C₃₁₆) θOLE kąt nachylenia łańcucha OLE POPC (∡Ð→

NÐÐÐÐ→C23C218)

θ_OLE_δ kąt nachylenia górnego fragmentu łańcucha OLE POPC (∡Ð→

NÐÐÐÐ→C₂₃C₂₉)) θ_OLE_ω kąt nachylenia dolnego fragmentu łańcucha OLE POPC (∡Ð→

NÐÐÐÐÐ→C₂₁₀C₂₁₈ ) θ_Chol1 kąt nachylenia grupy steroidowej cholesterolu (∡Ð→

NÐÐÐ→C3C17) θ_Chol2 kąt nachylenia łańcucha węglowodorowego cholesterolu (∡Ð→

NÐÐÐÐ→C₁₇C₂₅) θP N kąt nachylenia głowy POPC (∡Ð→

NÐÐ→P N)

φChol (α) rzut wektora ÐÐÐÐ→C13C18 na płaszczyznę XY, kąt azymutalny φ_C3C17 rzut wektora ÐÐÐ→C₃C₁₇ na płaszczyznę XY

φP N rzut wektora ÐÐ→N P na płaszczyznę XY

(11)

Skład układów symulacyjnych.

Liczba cząsteczek Dodatkowy opis

Chol POPC tlenu wody

POPC

0 200 0 6000

dPOPC

0 400 0 12000 podwojony w osi Z układ POPC

dPOPC+O2

0 400 200 11800 układ dPOPC po dodaniu tlenu cząsteczkowego POPC-Chol50

100 100 0 6000

dPOPC-Chol50

200 200 0 12000 podwojony w osi Z układ POPC-Chol50 dPOPC-Chol50+O2

200 200 200 11800 układ dPOPC-Chol50 po dodaniu tlenu czą- steczkowego

Chol

200 0 0 6000 dwuwarstwa zbudowana w oparciu o strukturę kryształu cholesterolu (Shieh i inni, 1977)

Chol2

200 0 0 6000

dwuwarstwa lipidowa zbudowana poprzez rów- nomierne rozmieszczenie cząsteczek cholesterolu w płaszczyźnie XY

dChol2

400 0 0 12000 podwojony w osi Z układ Chol2 dChol2+O₂

400 0 200 11800 układ dChol2 po dodaniu tlenu cząsteczkowego Tabela 1:Liczba cząsteczek lipidów (cholesterolu i POPC), tlenu cząsteczkowego oraz wody w układach symulacyjnych. Nazwy układów symulacyjnych w niniejszej pracy wyróżnione są pogrubioną czcionką i zawierają w sobie informację o jego typie. Układy symulacyjne podwójnych dwuwarstw rozdzielonych warstwą rozpuszczalnika rozpoczynają się od litery d. Układy z tlenem cząsteczkowym oznaczone są za pomocą +O2.

7

(12)

8 Wykaz skrótów

Liczba cząsteczek Dodatkowy opis

Chol POPC tlenu wody

4POPC-Chol50

400 400 0 24000 powielony w płaszczyźnie XY układ POPC- Chol50

4Chol2

800 0 0 24000 powielony w płaszczyźnie XY układ Chol2 POPC_POPC-Chol50

600 200 0 12000 układ dwudomenowy, powstały przez lateralne połączenie POPC i POPC-Chol50

CBD_POPC-Chol50

200 600 0 12000 układ dwudomenowy, powstały przez lateralne połączenie Chol2 i POPC-Chol50

CinP

360 288 0 19440

dwuwarstwa fosfolipidowa nasycona cholestero- lem z domeną CBD (zawierającą 72 cząsteczki cholesterolu) w jej obrębie

4CinP

480 192 0 17280

dwuwarstwa fosfolipidowa nasycona cholestero- lem z czterema domenami CBD (zawierającymi po 24 cząsteczki cholesterolu) w jej obrębie uPOPC+O₂

0 200 1 5999

seria 36 układów symulacyjnych wykorzystanych w procedurze Umbrella Sampling zawierają- cych dwuwarstwę POPC oraz pojedynczą czą- steczkę tlenu

uPOPC-Chol50+O₂

100 100 1 5999

seria 39 układów symulacyjnych wykorzystanych w procedurze Umbrella Sampling zawierają- cych dwuwarstwę POPC-Chol50 oraz pojedyn- czą cząsteczkę tlenu

uChol2+O2

200 0 1 5999

seria 43 układów symulacyjnych wykorzystanych w procedurze Umbrella Sampling zawierają- cych dwuwarstwę Chol2 oraz pojedynczą czą- steczkę tlenu

Tabela 2:Liczba cząsteczek lipidów (cholesterolu i POPC), tlenu cząsteczkowego oraz wody w układach symulacyjnych. Nazwy układów symulacyjnych w niniejszej pracy wyróżnione są pogrubioną czcionką i zawierają w sobie informację o jego typie. Układy symulacyjne ze znakiem podkreślenia oznaczają układy gdzie domena PCD graniczy z domeną fosfolipidową lub CBD o tej samej liczebności lipidów.

Układy CinP i 4CinP zawierają dwuwarstwę fosfolipidową nasyconą cholesterolem z domenami CBD wprowadzonymi w jej obrębie. Układy uPOPC+O2, uPOPC-Chol50+O2i uChol2+O2reprezentują serie układów symulacyjnych wykorzystanych w symulacjach Umbrella Sampling, które różnią się między sobą położeniem cząsteczki tlenu. Układy z tlenem cząsteczkowym oznaczone są za pomocą +O2.

(13)

(14)

(15)

1

Wstęp

1.1 Struktura i funkcja soczewki oka

Soczewka oka (łac. lens) jest przezroczystym i elastycznym narządem ogniskującym pro- mienie świetlne na siatkówce, zlokalizowanym między tęczówką i ciałem szklistym (rys. 1.1a).

Pozycja soczewki stabilizowana jest za pomocą wiązadełek (rys. 1.1a: obwódka Zinna), a zmiana kształtu odbywa się dzięki pracy mięśni rzęskowych (rys. 1.1a: ciało rzęskowe) (Sawicki i inni, 2012). Zmiana kształtu soczewki pozwala na dostosowanie układu optycznego do oglądania przedmiotów znajdujących się w różnych odległościach od soczewki. Jest to mechanizm akomodacji występujący u kręgowców, takich jak ssaki i ptaki. U kręgowców wodnych, które posiadają soczewki kuliste, przez to mniej elastyczne niż soczewki ssaków o kształcie dwuwypukłego krąż- ka, mechanizm akomodacji polega na zmianie kształtu całej gałki ocznej. U ptaków, wyjątkowa zdolność akomodacji osiągana jest dzięki połączeniu obu mechanizmów, tzn. zmianie kształtu soczewki oka oraz kształtu gałki ocznej.

Soczewka oka jest niezwykłym organem, którego wiek sięga czasów embrionalnych organizmu, kiedy to powstają najstarsze elementy soczewki trwające aż do jego śmierci. Budowa soczewki oka dorosłego człowieka została przedstawiona na rysunku 1.1b. Średnica soczewki dorosłego człowieka wynosi około 10 mm, a grubość około 4 mm. U kręgowców wyróżnia się trzy główne, morfologicznie rozróżnialne, części soczewki oka: torebkę, warstwę nabłonka oraz warstwy włókien soczewki. Zostały one opisane poniżej.

Torebka soczewki(łac. capsula lentis) jest gładką i transparentną błoną podstawną zbudo- waną z polisacharydów i włókien kolagenowych, pozwalającą utrzymać kształt soczewki. Torebka soczewki wytwarzana przez mieszczące się pod nią komórki nabłonka ma zmienną grubość, naj- większą w okolicach równika soczewki (20 µm), a najmniejszą od strony tylnokomorowej (2 µm).

Pojedyncza warstwa nabłonka zlokalizowana jest jedynie w części przedniokomorowej i na 11

(16)

12 1. Wstęp

(a) Schemat budowy ludzkiego oka (b) Schemat budowy dojrzałej soczewki oka

Rysunek 1.1:Schemat budowy ludzkiego oka (a) i soczewki oka (b). Schemat przekroju przez oko (a) odpowiada widokowi z góry na prawe oko. Na rysunku (b) zaznaczono kolorami najważniejsze elementy soczewki. W jądrze soczewki oka wyróżniono warstwy komórek włókien pochodzące z różnych okresów ży- cia organizmu: zarodkowego (brązowe), płodowego (pomarańczowe) oraz powstałe po narodzinach (kolor żółty). Kolorem zielonym wyróżniono część korową soczewki, niebieskim komórki nabłonka, a fioletowym torebkę soczewki. Na rysunku (b) przedstawione są również przekroje poprzeczne, przypominające pla- ster miodu, i podłużne przez komórki włókien soczewki oka. Rysunek (b) został wykonany w oparciu o ilustrację mieszczącą się w pracy Taylora (Taylor i inni, 1996).

obwodzie soczewki (rys. 1.1b). Jest ona zbudowana z komórek nabłonka sześciennego, który w soczewce oka pełni dwie podstawowe funkcje. Pierwsza, polega na utrzymaniu homeostazy w soczewce oka, poprzez wypompowywanie kationów z jej wnętrza. Aktywny transport kationów w komórkach nabłonka soczewki oka odbywa się dzięki pracy pompy sodowo-potasowej, która podczas jednego cyklu, polegającego na transporcie trzech atomów sodu na zewnątrz komórki i dwóch do jej środka, hydrolizuje jedną cząsteczkę ATP. Ze względu na większą aktywność ko- mórek nabłonka w obszarze równikowym, powstaje strumień przepływu. Skierowany on jest od strony przedniokomorowej soczewki do tylnokomorowej i pozwala na dostarczenie jonów i skład- ników odżywczych do wnętrza soczewki. Komórki nabłonka, dzięki zdolności do podziału, peł- nią również drugą niezwykle ważną funkcję, mianowicie tworzą nowe warstwy włókien soczewki, które narastają od strony równika soczewki oka. Przedstawiono je kolorem ciemnozielonym na ilustracji 1.1b.

Komórki włókien soczewki stanowią główną masę soczewki, są one długie (do 12 mm), cienkie (4-7µm) i transparentne. Rozciągają się od strony przedniokomorowej do tyłu soczewki, tak że środek komórek ułożony jest zawsze w równiku. Komórki włókien ułożone są w kon- centrycznych warstwach (rys. 1.1b), przez co struktura soczewki często porównywana jest do budowy cebuli. Względne położenie komórek włókienkowych stabilizowane jest poprzez dopaso- wanie kształtu oraz za pomocą połączeń szczelinowych (ang. gap junctions). Ludzka soczewka zawiera łącznie 1000-3000 warstw komórek włókienkowych. Narastające komórki włókien soczewki przechodzą proces dojrzewania, który polega na utracie wszystkich organelli i zmianie

(17)

1.2. Tlen w soczewce oka 13 składu błon komórkowych. W dojrzałych soczewkach wyróżniane są dwa rodzaje komórek włó- kien. Pierwsze, zlokalizowane w warstwach korowych soczewki, są w takcie procesu dojrzewania i nadal posiadają mitochondria. Drugi typ komórek włókien, już dojrzałych, mieści się w ją- drze soczewki. Ze względu na ich zredukowaną wymianę w trakcie życia organizmu, komórki włókien jądra soczewki uznawane są za najstarsze komórki tego organizmu. Soczewka oka posiada charakterystyczne szwy, które zespalają krańce komórek włókien. Dzięki szwom soczewki w strukturze jądra możliwe jest wyróżnienie, przedstawionych na rys. 1.1b, części centralnej wy- kształconej w wieku płodowym oraz bardziej skrajnych warstw, z wieku nieletniego i dorosłego organizmu (Li i inni, 1985).

1.2 Tlen w soczewce oka

Soczewka oka jest narządem pozbawionym kontaktu z naczyniami krwionośnymi, których obecność prowadziłaby do niepożądanego rozproszenia światła. Przez to w jej wnętrzu panuje niezmiennie środowisko hipoksyczne. Ciśnienie parcjalne tlenu w powietrzu wynosi 160 mmHg, w wewnętrznych warstwach rogówki oka jego wartość spada do 24 mmHg. We wnętrzu gał- ki ocznej spada jeszcze bardziej. Badania przeprowadzone na izolowanych ludzkich soczewkach lub gałkach ocznych pokazały, że ciśnienie parcjalne tlenu w soczewce oka mieści się między

~0 mmHg a ~9 mmHg (Siegfried i inni, 2010), (Subczynski i inni, 2012). Najniższe wartości za- notowano w obrębie jądra soczewki, wyższe w wierzchnich warstwach korowych, różne dla części przedniokomorowej i tylnokomorowej, odpowiednio: ~3 mmHg i ~9 mmHg. Zarówno w obrębie cieczy wodnistej jak i ciała szklistego utrzymywany jest gradient ciśnienia parcjalnego tlenu w kierunku soczewki. Pomiary ciśnienia parcjalnego tlenu u ludzi pokazały, że w wyniku zabie- gów przeprowadzanych w obrębie gałki ocznej, takich jak operacja jaskry lub usunięcie cieczy wodnistej oka, wspomniany gradient ulega nieodwracalnemu zaburzeniu (Siegfried i inni, 2010).

Może być to związane ze zwiększeniem płynności cieczy, a przez to łatwiejszą dyfuzją tlenu.

Wzrost stężenia tlenu w obrębie soczewki oka uznaje się za główną przyczynę powstawania w niej zaćmy (Borchman i Yappert, 2010). Dlatego też, zrozumienie procesów kontrolujących transport tlenu i jego dystrybucję w obrębie soczewki jest ważne. Wiadomo, że kwas askorbinowy¹ obecny w komorze przedniej i tylnej oka reaguje z cząsteczkami tlenu, w wyniku czego powstaje nadtlenek wodoru, przekształcany następnie przez katalazę do postaci wody (Sieg- fried i inni, 2010). Tlen jest również usuwany w pojedynczej warstwie nabłonka soczewki oka.

Mitochondria nabłonka odpowiadają za konsumpcję około 90% tlenu w obrębie soczewki oka.

Niektórzy badacze uważają nawet, że główną rolą tych mitochondriów nie jest wcale produkcja ATP, ale utrzymywanie stale niskiego stężenia tlenu w soczewce oka (McNulty i inni, 2004).

Mechanizm kontrolujący stężenie tlenu w warstwach komórek włókien soczewki nie został

1Kwas askorbinowy(witamina C) jest przeciwutleniaczem reagującym z reaktywnymi formami tlenu, takimi jak rodnik hydroksylowy, z powstaniem mało reaktywnej i trwałej pochodnej. Witamina C, jak każdy inny przeciwutleniacz, może jednak stać się reaktywna. Warunkiem dla tego szkodliwego działania jest obecność wolnych jonów metali.

(18)

14 1. Wstęp jak dotąd poznany. Udział w konsumpcji tlenu w komórkach włókienkowych powinny mieć nie- mitochondrialne szlaki oparte na kwasie askorbinowym lub glutationie² (McNulty i inni, 2004), (Beebe i inni, 2011). Faktycznie, obserwowane jest wysokie stężenie glutationu przekraczajace 2 mM w jądrze zdrowej soczewki oka, które ma znaczenie w zapobieganiu trwałemu utlenieniu białek (Truscott, 2005) oraz lipidów (Scholz i inni, 1989). Stężenie glutationu jest jeszcze wyższe (4-6 mM) w komórkach warstwy nabłonka soczewki, gdzie zlokalizowana jest pula reduk- tazy glutationowej, odpowiedzialna za redukcję utlenionego glutationu napływającego z wnętrza soczewki.

Istnienie barier dla dyfuzji tlenu jest kolejnym postulowanym mechanizmem obniżenia ciśnie- nia parcjalnego tlenu w warunkach jego wolnej konsumpcji. Biorąc pod uwagę liczbę kilku tysięcy błon komórkowych komórek włókienkowych napotykanych przez dyfundujące cząsteczki trudno nie wziąć ich pod uwagę jako istotny element w tworzeniu bariery dla dyfuzji. Wyznaczone profile hydrofobowe oraz parametry transportu tlenu poprzez modele błon wykonane z ekstraktu lipidów ze zwierzęcych soczewek oka pokazały prostokątne profile dla tych parametrów. Nagła zmiana wartości tych parametrów zlokalizowana jest na granicy grupy steroidowej i łańcucha węglowodorowego cholesterolu (Raguz i inni, 2008). Oznacza to, że bariera przepuszczalności dla tlenu cząsteczkowego zlokalizowana jest w obszarze głów polarnych oraz regionu hydofobowego do głębokości zajmowanej przez grupę steroidową cholesterolu.

Wyznaczone współczynniki przepuszczalności dla tlenu przez zwierzęce modele błony fosfolipidowej nasyconej cholesterolem (57,2-69,2 cm/s), gdzie stosunek cholesterolu do fosfolipidów wynosi 1, są nieznacznie niższe od wartości wyznaczonej w warstwie wodnej o tej samej grubości (69,3 cm/s) (Widomska i inni, 2007b), (Raguz i inni, 2009). W tych modelowych układach skon- struowanych z ekstraktów lipidowych, nie są obecne białka błonowe, jednakże wiadomo, że przez białka błonowe dyfuzja tlenu nie zachodzi. Na transport tlenu wpływa natomiast zdecydowanie obecność domen cholesterolowych CBD formujących się w obrębie dwuwarstw fosfolipidowych przesyconych cholesterolem (Subczynski i inni, 2012).

1.3 Morfologia błon biologicznych

Błony biologiczne są cienkimi dwuwarstwowymi strukturami otaczającymi każdą komórkę oraz struktury subkomówkowe. Ich podstawową funkcją jest odgrodzenie i zapewnienie integral- ności organellom komórkowym oraz samej komórce. Głównymi składnikami błon biologicznych są lipidy i białka, których udział zależy od jej rodzaju. Błony biologiczne są selektywnie przepusz- czalne, dlatego też skład białkowo-lipidowy decyduje o możliwości przekazywania i odbierania sygnałów z zewnątrz. Wagowy udział białek suchej masie ludzkich błon komórkowych wynosi

2Glutation (GSH) jest tripeptydem o właściwościach przeciwutleniających, składającym się z reszt kwasu glutaminowego, cysteiny i glicyny. Jego działanie przeciwutleniające w białkach polega na odtwa- rzaniu grup tiolowych (-SH), które uległy utlenieniu do grup sulfonowych (-SO3H) i wiązań disiarczkowych (-S-S-). Glutation jest substratem dla peroksydazy glutationowej, która redukuje nadtlenek wodoru i nad- tlenki organiczne, takie jak utlenione lipidy. Utlenioną formą glutationu jest dimer (GS-SG) połączony mostkiem disiarczkowym, który redukowany jest przez reduktazę glutationową.

(19)

1.3. Morfologia błon biologicznych 15 zwykle ~50%, ale może znacząco odbiegać od wartości średniej. Najniższe stężenie białek, miesz- czące się w zakresie 15-30% suchej masy, zaobserwowano w błonach komórek otoczki mielinowej włókien nerwowych. Najwyższe ~75% suchej masy w błonach wewnętrznych mitochondriów.

Jednakże, nawet w błonach o najwyższym udziale białek, największa część powierzchni błony przypada na matrycę lipidową (Dupuy i Engelman, 2008).

Rysunek 1.2: Porównanie struktury czterech głównych klas lipidów błon biologicznych: glicerofosfo- lipidu (a, PC(16:0/18:1(9Z)), sfingolipidu (b, SM(d18:1/12:0)), glikolipidu (c, GlcCer(d18:0/18:1(9Z))) i cholesterolu (d).

Skład białkowo-lipidowy błon biologicznych zależy od ich źródła, od organizmu oraz funkcji pełnionej przez komórki. Czterema głównymi klasami lipidów błonowych są: fosfolipidy (gli- cerofosfolipidy i sfingofosfolipidy), glikolipidy i steroidy, przedstawione na rysunku 1.2. W ich budowie wyróżnia się region hydrofobowy skierowany do centrum błony i hydrofilowy skierowany do rozpuszczalnika. W przypadku fosfolipidów i glikolipidów, w skład regionu hydrofobowego wchodzą zwykle reszty kwasów tłuszczowych, sfingozyny lub podobnych cząsteczek. Są one zróż- nicowane jeśli chodzi o ich długość, która zwykle mieści się między 14 a 22 atomami węgla, oraz stopień nasycenia. Hydrofobowe wnętrze błony o bardzo ograniczonym kontakcie z cząsteczkami wody, w komórkach zwierzęcych zawiera również płaskie grupy steroidowe cholesterolu znacząco wpływające na właściwości błon.

Hydrofobowe łańcuchy węglowodorowe połączone są z tak zwanymi łącznikami, od których zaczyna się region polarny lipidów. Łącznikami mogą być, przedstawione na rysunku 1.2, reszta glicerolowa (estryfikowana w pozycji β i γ) lub reszta sfingozyny, przyłączona za pomocą wiązań estrowych lub amidowych. W glicerofosfolipidach i sfingolipidach do reszty glicerolu w pozycji

(20)

16 1. Wstęp α lub sfingozyny przyłączona jest grupa fosforanowa, która zwykle połączona jest wiązaniem estrowym z kolejną cząsteczką. Obserwowane jest duże zróżnicowanie tych występujących po grupie fosforanowej cząsteczek, są to aminoalkohole (cholina, etanoloamina), aminokwasy (sery- na), alkohole (inozytol, glicerol) i reszty cukrowe. W przypadku glikolipidów do reszty glicerolu lub sfingozyny przyłączona jest reszta cukrowa, rys. 1.2c. Region hydrofilowych głów polarnych potrafi być niezwykle zróżnicowany pod kątem ich objętości, powierzchni przypadającej na lipid, rozkładu ładunków, stopnia hydratacji i wielu innych cech, które wpływają na charakterystykę tworzonych błon.

Białka błonowe są niezwykle ciekawą grupą makrocząsteczek, obejmującą białka powierzch- niowe i integralne, częstokroć specyficzne dla wybranego typu komórki. Pełnią one funkcje re- ceptorów, transporterów, enzymatyczne lub adhezyjne. Ważną ich wspólną cechą jest to, że nie zachodzi przez nie dyfuzja tlenu.

1.3.1 Metody eksperymentalne wykorzystywane do badania ukła- dów błonowych

Najczęściej używanymi technikami eksperymentalnymi, wykorzystywanymi w badaniu błon biologicznych i modelowych są: metody spektroskopowe (fluorescencyjne, elektronowego rezona- nansu paramagnetycznego EPR i magnetycznego rezonansu jądrowego NMR), analiza rentge- nowska niskokątowa i skaningowa kalorymetria różnicowa DSC.

Spektroskopia fluorescencyjna oparta jest na cząsteczkach znakowanych grupami chromo- forowymi, które absorbują, a następnie emitują światło o spektrum długości fali przesuniętym w stronę dłuższych fal. Pomiar natężenia fluorescencji pozwala na badanie takich właściwo- ści jak przejścia fazowe błon biologicznych (Korlach i inni, 1999). Natomiast metody FRAP (ang. Fluorescence Recovery After Photobleaching) (Axelrod i inni, 1976) i FCS (ang. Flu- orescence Correlation Spectroscopy) (Lipari i Szabo, 1980) pozwalają na badanie ruchliwości lateralnej w badanych błonach.

Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego EPR wykorzystuje lipidy z do- łączonymi znacznikami spinowymi, które w porównaniu do grup chromoforowych cechują się małymi rozmiarami. Najczęściej wykorzystywanymi znacznikami spinowymi są stabilne grupy nitroksylowe. Dzięki dołączeniu znacznika w różnych pozycjach cząsteczki lipidu możliwe jest badanie lokalnego środowiska na różnych głębokościach dwuwarstwy. Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego pozwala na badanie struktury błon i organizacji lipidów (Subczynski i inni, 2010), profili hydrofobowości i innych właściwości (Subczynski i inni, 1994), przejść fazowych (Subczynski i inni, 2007) oraz budowy domenowej (Mainali i inni, 2013).

Do badania składu lipidowego wykorzystywana jest również spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego NMR pozwalająca na uzyskanie opisu nienaruszonych błon biologicznych w oparciu o naturalnie występujące centra paramagnetyczne w błonach (¹H,²H,¹³C lub ³¹P).

Z eksperymentów wykonanych za pomocą spektroskopii NMR otrzymywany jest opis przejść

(21)

1.3. Morfologia błon biologicznych 17 fazowych, upakowania lipidów, ich orientacji i właściwości elastycznych błon składających się z białek i lipidów (Grélard i inni, 2010).

Skaningowa kalorymetria różnicowa DSC (ang. Differential Scanning Calorimetry) polega na pomiarze ciepła absorbowanego przez badaną próbkę w trakcie przemiany termicznej. Metoda ta wykorzystywana jest do obserwacji przejść fazowych w błonach oraz charakterystyki tych przejść (Mabrey i Sturtevant, 1976).

Dzięki zastosowaniu metody analizy rentgenowskiej niskokątowej możliwe jest obserwowa- nie i scharakteryzowanie domen w obrębie badanych błon nawet o wielkościach nanometrowych (Pencer i inni, 2005). Technika ta polega na analizie obrazów rentgenowskich powstałych dla promieni rozproszonych na strukturach znacznie większych niż długość fali promieniowania i sko- limowanych z dala od głównej wiązki światła.

Najważniejszymi z punktu widzenia przedstawianej pracy technikami eksperymentalnymi, są spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego EPR, skaningowa kalorymetria różnicowa DSC oraz niskokątowa analiza rentgenowska. Te metody wykorzystywane są do ba- dania błon w postaci liposomów powstałych z mieszaniny lipidów. Ze względu na to, że wybór metody preparatyki liposomów nie jest obojętny dla otrzymanych wyników, dwie takie metody zostały opisane poniżej.

Pierwszą metodą preparatywną przygotowania liposomów jest metoda depozycji lipidów (ang. Film Deposition Method) w postaci cienkiego suchego filmu osadzonego na ściankach na- czynia. Z filmu lipidowego otrzymywane są liposomy w wyniku jego hydratacji. Drugą techniką jest metoda gwałtownej wymiany rozpuszczalnika (ang. Rapid Solvent Exchange Method), gdzie liposomy otrzymywane są w wyniku szybkiej wymiany lipidów między rozpuszczalnikiem orga- nicznym a środowiskiem wodnym (Buboltz i Feigenson, 1999). Pierwsza z tych metod ze względu na istnienie stanu pośredniego suchego filmu lipidowego może prowadzić do powstawania arte- faktów, co zostało opisane bardziej szczegółowo w dalszej części pracy (podrozdział 1.9)

1.3.2 Morfologia błon komórek włókien soczewki oka

Błony plazmatyczne komórek włókien soczewki oka charakteryzują się unikalnym składem lipidowym i białkowym. W większości błon komórek ssaczych cholesterol stanowi nie więcej niż 50 % molowych wszystkich lipidów (Epand, 2003), natomiast w błonach komórek włókien może stanowić ponad 70 % molowych. Skład lipidowy komórek soczewki oka zmienia się z ich wiekiem.

Podczas dojrzewania, wraz z utratą wszystkich organelli komórkowych, błona komórkowa staje się jedynym typem błony w obrębie komórek włókien soczewki.

1.3.3 Białka błon komórek włókien soczewki oka

Błony komórek włókien są nieprzepuszczalne dla kationów, dlatego też za utrzymanie homeostazy odpowiadają białka błonowe: Ca²⁺-ATPazy, Na,K-ATPazy oraz akwaporyny (AQP).

ATPazy wykorzystują energię z hydrolizy ATP podczas procesu usuwania kationów wapnia

(22)

18 1. Wstęp z wnętrza komórek w przypadku Ca²⁺-ATPazy, oraz podczas transportu kationów sodu i potasu w przypadku Na,K-ATPazy.

Utrzymanie homeostazy kationów wapnia w soczewce przez Ca²⁺-ATPazy jest niezbędne dla jej przezroczystości. Aktywność tego białka modulowana jest przez otoczenie, jest ona 2-3 razy większa w dwuwarstwie w fazie ciekłokrystalicznej uporządkowanej lo, czyli takiej jak błona komórek włókienkowych, niż w dwuwarstwie w fazie ciekłokrystalicznej nieuporządkowanej ld

(Tang i inni, 2006). Aktywność Ca²⁺-ATPazy jest mniejsza o około 50% w soczewkach objętych zaćmą (Paterson i inni, 1997).

Oprócz regulacji objętości komórek Na,K-ATPazy, poprzez tworzenie gradientu sodu w po- przek soczewki, umożliwiają funkcjonowanie innych białek transportowych, które potrzebują go do transportu glutationu, glukozy i innych składników odżywczych (Kannan i inni, 1996), (Mantych i inni, 1993).

Akwaporyna-0 (oznaczana skrótowo AQP0 lub MIP) funkcjonuje jako kanał wodny lub biał- ko adhezyje, obie te funkcje są niezwykle ważne dla soczewki oka ale nie mogą być pełnione przez dane białko jednocześnie. Akwaporyna-0 w błonie ma tendencję do tworzenia tetramerów, choć należy zwrócić uwagę, że kanały wodne mieszczą się w obrębie pojedynczego monomeru. Prawi- dłowa funkcja kanałów wodnych jest oczywiście związana z transparentnością soczewki. Badania na mysich soczewkach, na różnym stadium rozwoju, pokazały korelację między uzyskaniem peł- nej transparentności soczewki, a jej przepuszczalnością dla wody (Varadaraj i inni, 2007). Prze- puszczalność akwaporyny-0 wzrasta wraz ze wzrostem stężenia kationów wapnia Ca²⁺ i cynku Zn²⁺. Kationy wapnia Ca²⁺umożliwiają związanie do C-końca białka MIP kalmoduliny, która je aktywuje i stymuluje (Kalman i inni, 2006). Natomiast kationy cynku Zn²⁺stabilizują strukturę tetrameru AQP0, co pozytywnie wpływa na stabilność kanałów wodnych (Chepelinsky, 2009).

Tetramery akwaporyny dwóch przystających błon mogą utworzyć połączenia (Gruijters, 1989).

Wiąże się to z wcześniejszą modyfikacją AQP0, polegającą na skróceniu białka na C-końcu mieszczącego się w przestrzeni międzykomórkowej, a przez to utratą funkcji kanału wodnego.

Modyfikacje AQP0 są najintensywniejsze w obrębie jądra soczewki (Gonen i inni, 2004). Mu- tacje w genie kodującym AQP0 wiążą się z rozwojem dziedzicznej odmiany zaćmy. Całkowity brak tego białka prowadzi do tworzenia się soczewki o nieprawidłowej architekturze, związa- nej z brakiem zdolności do utworzenia się szwów soczewki, a przez to pozbawionej prawidłowej akomodacji.

1.3.4 Skład lipidowy błon komórek włókien soczewki oka

Błona plazmatyczna komórek włókien soczewki oka cechuje się unikalnym składem z powodu wysokiej zawartości cholesterolu i niskiej zawartości wielonienasyconych kwasów tłuszczowych.

Skład zrąbu lipidowego komórek włókienkowych jest uzależniony od wieku soczewki i jest różny w warstwach korowych i jądra soczewki (Li i inni, 1985).

Zrąb lipidowy błon komórek włókien soczewki oka różni się między gatunkami zwierząt, został nawet zaobserwowany związek między stosunkiem cholesterolu do fosfolipidów a długo-

(23)

1.3. Morfologia błon biologicznych 19 ścią życia różnych gatunków zwierząt (Borchman i Yappert, 2010). U gatunków długo żyjących, takich jak człowiek, głównymi fosfolipidami błon komórek włókien soczewki są sfingomieliny, ce- chujące się niezwykłą stabilnością struktury. Sfingomielina jest typem sfingolipidu składającego się ze sfingozyny, reszty kwasu tłuszczowego, reszty fosforanowej oraz reszty choliny (rys. 1.2b) (Borchman i Yappert, 2010). Natomiast u zwierząt o krótkim czasie życia głównymi fosfolipidami są fosfatydylocholiny, których przykład przedstawiono na ilustracji 1.2a (Borchman i inni, 2004).

Błona komórek włókienkowych ludzkiej soczewki oka cechuje się wysoką zawartością cholesterolu, plazmalogenu³ i dihydroksysfingomieliny. Stężenie tego ostatniego lipidu jest najwyższe u człowieka, w porównaniu z innymi gatunkami zwierząt, i stanowi prawie 50% wszystkich fosfo- lipidów. Ze względu na nasycenie wiązania między węglem C4 i C5 w łańcuchu reszty sfingozyny (zaznaczone na rys. 1.2b), dihydroksysfingomielina może uczestniczyć w tworzeniu wiązań wodo- rowych międzycząsteczkowych z cholesterolem i fosfolipidami (Yappert i Borchman, 2004). Jak już wspomniano, sfingomieliny cechują sie niezwykłą stabilnością, z kolei plazmalogen i cholesterol mają właściwości przeciwutlaniające. Plazmalogen, dzięki obecności wiązania podwójnego w łańcuchu węglowodorowym jest łatwym celem dla reaktywnych form tlenu i innych utleniaczy, przez co chroni fosfolipidy o nienasyconych wiązaniach (Gorgas i inni, 2006). Z kolei utlenione formy cholesterolu są trwałe, dzięki czemu, w przeciwieństwie do fosfolipidów, nie pozwalają na propagację utleniania składników komórki. Dodatkowym przeciwutleniaczem błon lipidowych jest rozpuszczalna w tłuszczach witamina E.

U człowieka wraz z dojrzewaniem komórek włókien soczewki wzrasta stężenie cholesterolu i sfingomielin (zwłaszcza dihydroksysfingomieliny), a maleje glicerofosfolipidów. Wysoka zawar- tość cholesterolu, sfingomielin i śladowe ilości wielonienasyconych kwasów tłuszczowych zapew- niają stabilność fizyczną i chemiczną błon komórek włókien soczewki oka. Różnicom w składzie lipidowym różnych gatunków zwierząt oraz zmianom zachodzącym z wiekiem poświęcone jest wiele artykułów, z których na największą uwagę zasługują: cykl prac eksperymentalnych grupy prof. Douglasa Borchmana i dwie prace przeglądowe (Yappert i Borchman, 2004) i (Borchman i Yappert, 2010), a także prace prof. Subczyńskiego eksperymentalne i przeglądowe (Subczynski i inni, 2012).

Wysoka zawartość cholesterolu prowadzi do tworzenia się domen cholesterolowych w obrębie błon komórkowych, których badanie eksperymentalne okazało się niezwykle problematyczne.

Pewne formy agregatów cholesterolowych zostały zaobserwowane w badanych układach mode- lowych za pomocą szeregu metod eksperymentalnych: skaningowej kalorymetrii różnicowej DSC (Epand, 2003), dyfrakcji rentgenowskiej (Preston Mason i inni, 2003) i neutronowej (Knoll i inni, 1985), spektroskopii NMR (Epand, 2003) oraz znakowania spinowego wykorzystującego spektro- skopię elektronowego rezonansu paramagnetycznego EPR (Raguz i inni, 2011a; Mainali i inni,

3Plazmalogen jest fosfoglicerolipidem eterowym, w którym łańcuch węglowodorowy na pozycji γ przyłączony jest wiązaniem eterowym i posiada wiązanie podwójne między pierwszym i drugim atomem węgla łańcucha alkilowego. Plazmalogen znajdywany jest w wielu ludzkich tkankach ale jego zawartość jest najwyższa w tkance nerwowej i układzie krwionośnym.

(24)

20 1. Wstęp 2012a). We wszystkich tych eksperymentach badania wykonane zostały na błonach modelowych, otrzymanych z ekstraktów lipidów.

Interpretacja wyników większości wspomnianych powyżej metod wskazała na istnienie krysz- tałów cholesterolowych (CCD, ang. cholesterol crystal domain) w obrębie błon komórek włó- kienkowych, zarówno kryształów jednowodnych jak i bezwodnych. Jedynie ostatnia z powyż- szych metod eksperymantalnych, spektroskopia EPR, wskazała istnienie innej formy agregatów tzw. "prawdziwej domeny cholesterolowej" (CBD, ang. cholesterol bilayer domain), której struk- tura jest płynna, tak jak otaczającej ją domeny PCD (ang. phospholipid-cholesterol domain).

Ruchliwość cholesterolu w domenie CBD jest porównywalna z ruchliwością cholesterolu w ota- czającej dwuwarstwie, a więc w błonie fosfolipidowej nasyconej cholesterolem (Mainali i inni, 2013).

Obserwacja dwóch tak odmiennych strukturalnie agregatów cholesterolu stawia przed środo- wiskiem naukowym szereg ważnych pytań. Pierwsze, czy forma krystaliczna CCD jest jedynie artefaktem doświadczalnym lub preparatywnym, czy może występuje ona w soczewce oka? A jeżeli tak, to czy jej występowanie jest stanem fizjologicznym, czy patologicznym soczewki oka?

Kolejne pytanie brzmi: jaka jest struktura i funkcja domen CBD w obrębie soczewki oka?

Następne, jaki jest związek między dwoma typami agregatów cholesterolu, CCD i CBD, czy występują one od siebie niezależnie, czy też kryształy cholesterolu powstają poprzez wytrącenie się domen CBD z błon komórek włókienkowych?

Najnowsze wyniki eksperymentalne otrzymane za pomocą spektroskopii EPR pokazują, że przepuszczalność błon komórek włókien jądra soczewki jest niższa niż komórek kory soczewki (Raguz i inni, 2011a). Pozostaje pytaniem otwartym, czy obniżona przepuszczalność błon komó- rek włókien jądra soczewki wynika ze zmiany zawartości cholesterolu, czy innych parametrów?

1.4 Białka cytoplazmatyczne

Wszystkie białka występujące w rdzeniu soczewki oka powstają w okresie płodowym. Fakt, że część soczewek pozostaje transparentna przez ponad 80 lat jest zadziwiający. Połowiczny czas życia białek cytoplazmatycznych mieści się zwykle w zakresie minut do dni. Znane wyjątki, to białka takie jak: histony, białka tworzące włókna kolagenowe i elastynowe, białka zębiny i szkliwa oraz białka krystaliny soczewki oka (Toyama i Hetzer, 2013). Aby zachować właściwości optyczne, takie jak wysoki współczynnik załamania światła i niski współczynnik rozpraszania światła, białka cytoplazmatyczne muszą zachować swoją wysoką rozpuszczalność przy niezwykle wysokiej zawartości białek w cytoplazmie komórek włókien soczewki oka.

Głównymi białkami cytoplazmatycznymi komórek włókienkowych soczewki oka kręgowców są krystaliny, stanowiące ponad 90% wszystkich białek cytopazmatycznych i ponad 35% mokrej masy soczewki. Krystaliny dzielone są na trzy główne klasy: α, β i γ. Występują u większo- ści zwierząt i cechują się różną strukturą i funkcją. Wspólną cechą krystalin jest zwiększanie współczynnika załamania światła.

(25)

1.5. Zaćma i zmiany w soczewce oka związane z wiekiem 21

α-krystalina należy do grupy “białek opiekuńczych”, inaczej zwanych “białkami szoku ciepl- nego”, których funkcja polega na wiązaniu zdenaturowanych białek. To zapobiega ich niepożą- danej agregacji i częściowo umożliwia im odzyskanie prawidłowej struktury przestrzennej. W soczewce oka α-krystalina jest białkiem oligomerycznym (Jehle i inni, 2010), największym i wy- stępującym w najwyższym stężeniu w cytoplazmie komórek włókien soczewki oka. Funkcjonalna struktura α-krystaliny nie jest znana, wiadomo jednak, że jest zbudowana z około 40 łańcuchów polipeptydowych. W skład struktury oligomerycznej wchodzą podjednostki αA i αB-krystaliny oraz związane przez nie białka o nieprawidłowej strukturze (Bloemendal i inni, 2004).

β i γ-krystaliny charakteryzują się podobną strukturą i są one białkami wywodzącymi się z mikrobowych białek stresu (Wistow, 1990). Są to białka dwudomenowe, w których podobne domeny połączone są krótkimi łącznikiem. Białka β i γ-krystaliny mają strukturę drugorzędową składającą się głównie z rozmieszczonych antyrównolegle nici β, o topologi motywu klucza grec- kiego. Proces fałdowania motywu klucza greckiego należy do prostych, dzięki czemu nawet białka o nieprawidłowej strukturze mogą łatwo odzyskać strukturę natywną w obrębie kompleksu α- krystaliny. Stabilność β i γ-krystaliny zwiększona jest dzięki wiązanym kationom wapnia Ca²⁺. Różnicą między β i γ-krystaliną jest występowanie tej pierwszej w formie oligomeru, a drugiej w formie monomeru.

Zgodnie z obecnym stanem wiedzy, pozostałe białka cytoplazmatyczne nie są specyficzne dla komórek soczewki oka.

1.5 Zaćma i zmiany w soczewce oka związane z wiekiem

W przypadku wielu zmian zachodzących w starzejących się soczewkach oka trudne jest rozstrzygnięcie, czy są one też związane z rozwojem zaćmy. Dlatego też zmiany te zostały opisane we wspólnym podrozdziale.

1.5.1 Zaćma soczewki oka

Zaćma soczewki oka, inaczej nazywana kataraktą, jest chorobą prowadzącą do zmętnienia soczewki, a przez to do pogorszenia widzenia, aż do utraty wzroku. Występuje ona głównie po 60 roku życia, kiedy to nazywana jest zaćmą nabytą, ale jej pojawienie możliwe jest jeszcze przed narodzinami, nazywana jest wtedy zaćmą wrodzoną. Zaćma o podłożu genetycznym, czyli zaćma wrodzona, związana jest często z mutacjami w obrębie genów kodujących grupę białek:

krystaliny, białka cytoszkieletu lub białka błonowe (Graw, 2004), lecz również z zaburzeniami metabolizmu cholesterolu (Mori i inni, 2006)

Przyczyną powstawania katarakty nabytej może być konkretna choroba (np. zaćma cukrzy- ca), stosowane leki (np. zaćma kortyzonowa przy stosowaniu sterydów), przebywanie w otoczeniu o wysokiej zawartości tlenu (np. zaćma dzieci przedwcześnie urodzonych przebywających w in-

(26)

22 1. Wstęp kubatorze) lub urazy penetrujące gałkę oczną (zaćma elektryczna, hutnicza lub popromienna).

Dostępność do metod leczenia polegających na operacyjnym wszczepieniu nowej soczewki jest oczywiście uzależniona od regionu świata. Dlatego też, większość osób cierpiących na ślepotę i niepełnosprawność z niej wynikającą zamieszkuje kraje słabo rozwinięte. Rozległe badania epidemiologiczne nad tą chorobą podają wiek jako główny czynnik ryzyka (Truscott, 2000), cho- ciaż wymieniane są też takie czynniki jak: palenie papierosów, spożycie alkoholu, narażenie na promieniowanie UV oraz czynniki genetyczne (Congdon i inni, 2004).

Transparentna, prawie bezbarwna zdrowa soczewka oka wraz z rozwojem zaćmy jądra soczewki, staje się mętna i zmienia swój kolor do różnych odcieni koloru żółtego, brązowego, a nawet czarnego. Zmiany barwnikowe są zawsze najsilniejsze w obszarze jądra soczewki i wią- zane są z modyfikacjami białek, które jednak nie zostały poznane na poziomie molekularnym.

W przypadku zaćmy korowej, zmętnienie ma kolor biały i wiązane jest z lokalnym zaburzeniem regulacji osmotycznej.

W zaćmie obejmującej jądro soczewki oka, takiej jak zaćma starcza, obserwowane jest utlenianie reszt cysteiny i metioniny w białkach, które ma charakter postępujący aż do utlenienia

>90% reszt cysteiny i połowy reszt metioniny w najbardziej zaawansowanych stadiach rozwoju katarakty (Truscott, 2005). Proces utleniania białek skorelowany jest ze spadkiem poziomu glutationu, który częściowo może być tłumaczony przez tworzenie mostków disiarczkowych między glutationem i białkiem. W zdrowej soczewce takie połączenia mają charakter tymczasowy i są one zrywane poprzez działanie enzymu tioltransferazy występującego w cytoplazmie (Löfgren i inni, 2008). Ograniczenie w przypływie formy utlenionej i zredukowanej glutationu w obrębie soczewki, bądź zaburzenie pracy peroksydazy glutationowej w nabłonku soczewki, prowadzi do tworzenia się trwałych agregatów, a przez to do rozwoju zaćmy (Reddan i inni, 1999).

Starzenie się organizmu związane jest z degeneracją białek o długim czasie życia. Nagro- madzenie się zmodyfikowanych białek w soczewce oka mogłoby tłumaczyć zmianę optycznych i fizycznych właściwości soczewki. Pod tym kątem zbadano metodami proteomicznymi zależny od wieku proces modyfikacji białek soczewki oka. Pokazano, że niektóre zmiany zależne od wie- ku, jak racemizacja reszt seryny γS-krystaliny (Hooi i inni, 2013) i asparginianu αA-krystaliny (Hooi i inni, 2012b) jest nasilona w zaćmie, a część, jak na przykład deamidacja reszt glutami- ny (Gln-92 i Gln-170) białka γS-krystaliny nie ma z nią związku (Hooi i inni, 2012a). Wyniki tych badań nie odpowiadają jednak na pytanie, czy modyfikacja białek jest skutkiem czy też przyczyną zaćmy.

Glutation, jak wiele innych przeciwutleniaczy, w określonych warunkach sam staje się utle- niaczem. Dla glutationu, takim warunkiem jest spadek stężenia poniżej 1 mM. Spadek stężenia glutationu we wnętrzu soczewki związany jest z pojawieniem się ograniczenia dla jego dyfuzji o nie znanym pochodzeniu (Reddan i inni, 1999). Wraz ze spadkiem stężenia glutationu, również cząsteczki filtrów UV, obecne w soczewkach naczelnych, oraz kwasu askorbinowego mogą stać się utleniaczami, czemu sprzyja pojawienie się bariery dyfuzji dla nich i cząsteczek glutationu. W soczewkach osób po 50-tym roku życia zawartość kompleksów białek i filtrów UV jest znacząco wyższa, zwłaszcza w obrębie jądra soczewki (Korlimbinis i inni, 2007)

(27)

1.5. Zaćma i zmiany w soczewce oka związane z wiekiem 23 Kolejną zmianą obserwowaną w soczewce oka wraz z rozwojem zaćmy, jest utrata rozpusz- czalności białek cytoplazmatycznych soczewki oka. Białka pochodzące ze zdrowej soczewki są rozpuszczalne w roztworze mocznika, natomiast, wraz z rozwojem zaćmy tracą one tę właściwość.

Częściowo są one rozpuszczalne po dodaniu czynnika redukującego, co świadczy o istnieniu mię- dzyłańcuchowych mostków disiarczkowych w białkach. Jednakże część agregatów pomimo jego dodania nadal nie jest rozpuszczalna. Otrzymywane wyniki doświadczeń wskazują, że powsta- jące agregaty w soczewce oka są amorficzne (Truscott, 2007). Ciekawe są wyniki otrzymane dla soczewek we wczesnych stadiach rozwoju choroby, w których możliwe jest rozróżnienie frakcji rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej w roztworze mocznika, gdzie tylko druga frakcja jest zabar- wiona (Truscott, 2005). Badania chromatograficzne potwierdzają tworzenie się agregatów białek, w których istnieją połączenia między łańcuchowe nie-siarczkowe, takie w których reszty amino- kwasów połączone są ze sobą wiązaniami kowalencyjnymi (Kanayama i inni, 1987). Ze zdrowych soczewek oka za pomocą detergentów uzyskuje się frakcje błony oporne na działanie detergentu, w których stosunek cholesterolu do fosfolipidów jest wyjątkowo wysoki, dochodzący do warto- ści 7. Frakcja ta nie jest możliwa do uzyskania z błon komórek włókienkowych objętych zaćmą.

Wraz z pojawianiem się tlenu we wnętrzu soczewki oka, znaczenie zyskują obecne w niej jony metali, takie jak żelazo i miedź, które mogą być katalizatorami w procesie przekształcania nadtlenku wodoru, w którym powstaje wysoce reaktywny rodnik hydroksylowy. W zaawansowanych stadiach zaćmy obecne są reaktywne formy żelaza Fe²⁺ w soczewkach oraz podwyższony poziom rodników kwasu askorbinowego (Garner i inni, 2000).

1.5.2 Zmiany w soczewce oka związane z wiekiem

Fakt zmiany składu lipidowego soczewki oka z wiekiem jest znany od dawna. Już w 1922 roku zauważono wysoką zawartość cholesterolu w soczewce oka, która wzrasta wraz z wiekiem (Goldschmidt, 1922). W kolejnych latach XX wieku zidentyfikowano inne lipidy występujące w soczewce oka i opisano zmiany z wiekiem oraz w zaćmie soczewki oka.

Jak już zostało wspomniane, wiek jest głównym czynnikiem ryzyka zachorowania na zaćmę.

Wraz z wiekiem zmianie ulega wiele właściwości soczewki oka, przede wszystkim tracą one swoją elastyczność i zmniejsza się współczynnik załamania jądra soczewki oka, co prowadzi do dalekowzroczności starczej.

Tym zmianom towarzyszy modyfikacja składu lipidowego błon komórek włókienkowych.

Przez pierwsze 10 lat życia człowieka obserwowany jest wzrost zawartości cholesterolu i fosfo- lipidów w całej soczewce oka, znacznie przewyższający przyrost masy białkowej. W kolejnych latach notowany jest wzrost zawartości cholesterolu, przy braku lub niewielkim gromadzeniu fosfolipidów w błonach komórek włókienkowych (Li i inni, 1987). Zmiany te związane są z błoną plazmatyczną, w której mieści się ponad 90% molowych lipidów soczewki oka. Kolejną obserwo- waną zmianą zachodzącą z wiekiem, jest spadek zawartości plazmogenu z 25% do 10% molowych, fosfatydylocholiny z 5% do 1% molowego i wzrost stężenia sfingolipidów z 35% do 60% molowych na przestrzeni 60 lat życia człowieka, od 10 do 70 roku życia. Te zmiany mogą wpływać

(28)

24 1. Wstęp na funkcjonalność białek błonowych (Grami i inni, 2005). Pozostaje pytaniem otwartym, czy te zachodzące zmiany zwiększają podatność na rozwój zaćmy.

W trakcie życia, w ludzkiej soczewce ponad 40% fosfolipidów soczewki oka ulega utlenieniu, a w komórkach objętych kataraktą ten udział jest jeszcze wyższy (Huang i inni, 2005). Utlenione fosfolipidy modulują procesy komórkowe, takie jak wzrost, procesy oddechowe, syntezę białek i wiele innych. Są one substratem dla lipaz, dlatego też zmiana składu lipidowego może wynikać z degradacji fosfolipidów przez te enzymy, zwłaszcza fosfolipazę A2 (Cenedella, 1985)

Kolejną obserwowaną zmianą jest zawartość wolnej α-krystaliny. Szacuje się, że do 40-tego roku życia człowieka, wszystkie cząsteczki tego białka są związane ze zdenaturowanymi białkami i po tym czasie zdenaturowane białka cytoplazmatyczne zaczynają się wiązać z błoną komórkową (Friedrich i Truscott, 2009). Powstające agregaty, mogą nie tylko wpływać na elastyczność soczewki ale również wpływać na płynność błony i funkcjonowanie białek błonowych. Faktycznie, z wiekiem obserwowana jest zmniejszona dyfuzja wody i glutationu w obrębie soczewki (Moffat i inni, 1999), (Sweeney i Truscott, 1998).

Procesy zachodzące we wnętrzu soczewki oka zależą od funkcjonowania warstw korowych komórek włókienkowych i komórek nabłonka. Z wiekiem zmniejsza się przepuszczalność soczewki oka dla glutationu oraz kationów. Jednocześnie nie są zauważalne zmiany w metaboliźmie glutationu w komórkach nabłonka soczewki oka. Dlatego też, obserwowane liniowe obniżanie stężenia filtrów UV, z szybkością 12% na dekadę, wiąże się z powstawaniem bariery dla dyfuzji glutationu (Truscott, 2000),(Bova i inni, 2001).

Soczewki ludzkie po 50-tym roku życia, pomimo utraty zdolności do akomodacji często nie wykazują zmian charakterystycznych dla katarakty. Dlatego też, pomimo starań, nadal nie wiadomo jaki czynnik sprawia, że choroba zaczyna się rozwijać. Kluczem do zagadki wydaje się więc tlen, gdyż w komórkach soczewek starczowzrocznych są obserwowane niewielkie albo żadne skutki utlenienia, w przeciwieństwie do soczewek objętych zaćmą (Truscott, 2007). Proces na pewno jest złożony, gdyż samo utlenienie białek nie jest jednoznaczne z pojawieniem się zaćmy.

Przykładowo, u dorosłych gryzoni pomimo kompletnego utlenienia reszt cysteiny w białkach, soczewka nie musi ulegać zmętnieniu.

Ze względu na małą stabilność nadtlenku wodoru w warstwach korowych i nabłonka soczewki oka, związaną z obecnością antyoksydantów i grupy enzymów, za utlenianie wnętrza soczewki odpowiada tlen cząsteczkowy. Tlen dobrze rozpuszcza się w ośrodkach niepolarnych, takich jak błony biologiczne, które mogą być ośrodkiem korzystnym dla dyfundujących cząsteczek. Wiado- mo również, że witamina E, która jest przeciwutleniaczem związanym z błonami biologicznymi skutecznie opóźnia rozwój zaćmy (Robertson i inni, 1991).

1.6 Porównanie ludzkiej soczewki oka ze zwierzęcymi

Wcześniej w pracy opisano różnice w składzie lipidowym błon komórek włókien soczewki oka związane z wiekiem. Jednakże soczewki oka pochodzące od różnych ssaków mogą się między

(29)

1.6. Porównanie ludzkiej soczewki oka ze zwierzęcymi 25 sobą też znacząco różnić. Jedną z różnic jest zawartość białek w soczewce, która mieści się w szerokim zakresie: od 16% mokrej masy u kurczaka do ponad 65% u szczura. Wartość u człowieka 35% mokrej masy zbliżona jest do zmierzonej u świni i nie zmienia się ona w czasie życia tych organizmów. Niezwykle wysokie stężenie białek w cytoplazmie szczurów wiąże się z dehydratacją soczewki, która ma miejsce również u myszy i krów (Truscott, 2007). Zawartość białek w mokrej masie jest niższa u zwierząt, które wyróżniają się soczewkami o lepszej akomodacji, takich jak wyższe naczelne i ptaki, w przeciwieństwie do wspomnianych gryzoni i ryb.

Kolejną różnicą jest obecność filtrów UV, które u większości zwierząt wcale się nie pojawiają, a te które występują u człowieka są specyficzne dla naczelnych (Korlimbinis i inni, 2007). Dzięki obecności filtrów UV soczewka ludzkiego oka jest skutecznie chroniona przed promieniowaniem słonecznym w zakresie 300-400 nm, co jest uzupełnieniem ochrony rogówki, zatrzymującej promieniowanie do 300 nm.

Najlepiej zbadanymi błonami komórek włókienkowych są błony plazmatyczne zwierzęce.

W badanych błonach młodych krów i świni, stosunek cholesterolu do fosfolipidów mieści się w granicach 0,55 do 0,80. Głównymi fosfolipidami są fosfatydyloetanoloaminy, stanowiące 34%

molowych. Następne w kolejności są: fosfatydylocholiny - 29% molowych, fosfatydyloseryny - 11%

molowych oraz sfingolipidy - 21% molowych, w których ponad 80% molowych to sfingomieliny (Raguz i inni, 2008; Widomska i inni, 2007a)

Profile hydrofobowości oraz transportu tlenu dla błon w fazie ciekłokrystalicznej uporządko- wanej lo (patrz podrozdział 1.8) wykonanych z 1) ekstraktów lipidowych z soczewek cielęcych, 2) mieszaniny POPC i cholesterolu lub 3) mieszaniny DMPC⁴i cholesterolu są analogiczne i ma- ją kształt dzwonu. Pomimo tego, że obecność cholesterolu w błonie decyduje o kształcie profili, to jednak obecność lub brak domen cholesterolowych nie mają na niego wpływu (Raguz i inni, 2008),

Skład fosfolipidowy nie ma również wpływu na uporządkowanie łańcuchów węglowodoro- wych lipidów w błonach. Porównywalne wyniki otrzymywano, w dość szerokim zakresie tempe- ratur (15-45^○C), dla 1) błon zbudowanych z lipidów ekstrahowanych z komórek włókienkowych, i 2) błon modelowych zawierających mieszaninę POPC i cholesterolu o analogicznym stosunku fosfolipidu do cholesterolu (Widomska i inni, 2007b). Wyniki te, otrzymane z zastosowaniem znaczników spinowych są zgodne z wynikami anizotropii florescencyjnej, gdzie porównywano parametr uporządkowania w komórkach włókienkowych o różnym pochodzeniu: ludzkich i wo- łowych (Gooden i inni, 1982; Li i inni, 1987).

Błona modelowa zbudowana z POPC i cholesterolu charakteryzuje się porównywalną grubo- ścią do błony zbudowanej z ekstraktu lipidów z cielęcych komórek włókienkowych (Widomska i inni, 2007b).

Powyższe wyniki pokazują, że wspomniane parametry zależą od obecność cholesterolu, a nie składu fosfolipidowego. Na tej podstawie można stwierdzić, że badając błony zwierzęce lub błony modelowe otrzymywana jest również charakterystyka błon ludzkich, co jest ważnym uzasadnie-

4DMPC - 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfatydylocholina

(30)

26 1. Wstęp

Rysunek 1.3: Struktura i numeracja atomów w cząsteczkach POPC (a) i cholesterolu (b) Numera- cja atomów jest zgodna z nomenklaturą Sundaralihgama (Sundaralihgam, 1972), atomy reszty kwasu oleinowego i palmitynowego wyróżnione są za pomocą pierwszej cyfry w numeracji: “2” i “3”. W celu zwiększenia przejrzystości, nie zaprezentowano atomów wodoru, poza grupą hydroksylową cholesterolu, oraz pominięto oznaczenie chemiczne atomów węgla.

niem wykonania badań przedstawianych w poniższej pracy.

Jednym z najlepiej poznanych eksperymentalnie modeli błony komórek włókienkowych jest dwuwarstwa zbudowana z mieszaniny POPC i cholesterolu, przedstawionych na ilustracji 1.3.

Wybór fosfolipidu tłumaczony jest składem biologicznych błon plazmatycznych komórek włó- kienkowych soczewki oka pochodzącej od cielaka. W nich 33% molowych kwasów tłuszczowych stanowią kwasy nasycone zawierające 16 atomów węgla, a 34% molowych kwasy jednonienasyco- ne zawierające 18 atomów węgla. Z kolei fosfatydylocholiny stanowią 32% molowych wszystkich fosfolipidów (Widomska i inni, 2007a). Należy jednak pamiętać, że w ludzkich błonach plazmatycznych soczewki oka fosfatydylocholiny stanowią tylko około 5% wszystkich fosfolipidów.

1.7 Cholesterol

Cholesterol jest głównym składnikiem ssaczych błon komórkowych i sam ten fakt sugeruje, że jego obecność jest ważna dla funkcjonowania zwierzęcych błon plazmatycznych. Stężenie cholesterolu w większości ssaczych błon plazmatycznych mieści się w granicach 30-50% molowych (Epand, 2003). Wyjątkiem są wspomniane komórki włókienkowe, gdzie stężenie cholesterolu przekracza 70% molowych. Również komórki erytrocytów cechują się wysokim stężeniem cholesterolu wynoszącym 50% molowych.

Cholesterol, oprócz pełnienia funkcji elementu budulcowego błon biologicznych, jest także prekursorem hormonów steroidowych oraz witamin. Wpływ cholesterolu na właściwości błon bio-

(31)

1.7. Cholesterol 27 logicznych został wnikliwie zbadany. Obejmuje on: zwiększenie wytrzymałości fizycznej (Bloom i Mouritsen, 1988), utrzymanie odpowiedniej płynności błon (Kusumi i inni, 1983), zmniejszenie dyfuzji pasywnej wody oraz innych małych cząsteczek (Jedlovszky i Mezei, 2003; Subczynski i inni, 1994). Cholesterol wpływa również na przejścia fazowe w błonach, czemu poświęcony został podrozdział 1.8 pracy.

1.7.1 Źródło i regulacja ilości cholesterolu

U człowieka, większość cholesterolu występującego w komórkach pochodzi ze źródeł po- karmowych, jednakże wszystkie jądrzaste komórki ssacze posiadają zdolność jego syntezy, do czego wykorzystują łatwo dostępny acetylokoenzym A⁵. Proces syntezy cholesterolu odbywa się w obrębie retikulum endoplazmatycznego i zachodzi głównie w wątrobie (ponad 60% syntetyzo- wanego cholesterolu), jelitach i skórze. Dla większości komórek ssaczych, źródłem cholesterolu są cząsteczki wchodzące w skład lipoprotein krwi⁶zawierających cholesterol wolny i zestryfikowany.

Cholesterol pobierany jest przez komórki w procesie bezpośredniej desorpcji (transferu z lipoprotein do zewnętrznego listka błony komórkowej) lub za pośrednictwem receptorów lipoprotein i procesu endocytozy. Znane są trzy sposoby uwalniania cholesterolu z błony, pierwszy polega na desorpcji cholesterolu z błony plazmatycznej do krwi, drugim jest wydzielanie poprzez sekrecję cząsteczek związanych z lipoproteinami (głównie komórki syntetyzujące cholesterol). Trzecim mechanizmem jest uwalnianie pęcherzyków błony komórkowej (ang. membrane shedding) (Si- mons i Ikonen, 2000).

1.7.2 Cholesterol w fizjologii i patologii

Mechanizmy regulujące ilość pobieranego i wydzielanego cholesterolu oraz jego dystrybucję w obrębie komórek są skomplikowane i jedynie częściowo poznane. Stosunkowo najwięcej wiadomo o procesach, których dysfunkcja związana jest ze znanymi stanami chorobowymi. Pierwszym przykładem jest choroba tangierska, która objawia się niskim poziomem lipoprotein HDL we krwi, związanym z mutacją w genie kodującym receptor ABC1, odpowiedzialnym za wydzielanie cholesterolu i fosfolipidów z komórek. Choroba związana jest z gromadzeniem się cholesterolu

5Acetylokoenzym A(acetylo-CoA) jest tioestrem kwasu octowego i koenzymu A, który powstaje podczas β-oksydacji kwasów tłuszczowych i dekarboksylacji oksydacyjnej kwasu pirogronowego. Jest ważnym substratem cyklu Krebsa - drugiego etapu spalania metabolitów.

6Lipoproteina jest wielkocząsteczkowym kompleksem złożonym z tłuszczy i białek. Hydrofobowy rdzeń lipoprotein zawiera kwasy tłuszczowe i estry cholesterolu. Natomiast, otoczka zawiera amfipa- tyczne cząsteczki fosfolipidów, cholesterolu i białek. Wszystkie lipoproteiny służą do transportu lipidów w organizmie i dzielone są na cztery frakcje, w zależności od ich składu i funkcji. Odpowiednie frakcje lipoprotein transportują lipidy z jelita do mięśni i wątroby (chylomikrony) oraz z wątroby do tkanki tłuszczowej (VLDL). Kolejne dwie frakcje o największej zawartości cholesterolu odpowiadają za trans- port lipidów: z wątroby do mięśni (lipoproteiny niskiej gęstości LDL, ang. low density lipoprotein) lub w kierunku odwrotnym (lipoproteiny wysokiej gęstości HDL, ang. high density lipoprotein). Oprócz różnej funkcji, frakcje LDL i HDL różnią się zawartością białek, a przez to gęstością, co zadecydowało o nadaniu im wcześniej wspomnianych nazw.

(32)

28 1. Wstęp w komórkach w postaci kropli cholesterolowych, przerostem narządów, uszkodzeniem układu nerwowego i wczesnym rozwojem miażdżycy tętnic (Rust i inni, 1999).

Kolejnym przykładem jest miażdżyca (łac. atherosclerosis), czyli przewlekła choroba obja- wiająca się zmianami zwyrodnieniowo-wytwórczymi w obrębie tętnic, dotykająca znaczną część społeczeństwa. Zmiany miażdżycowe mogą być zlokalizowane w różnych miejscach organizmu.

Najbardziej znanym schorzeniem, będącym wynikiem miażdżycy, jest choroba niedokrwienna serca związana ze zwężeniem tętnic wieńcowych, mogąca prowadzić w skrajnych sytuacjach do zawału mięśnia sercowego. Z kolei miażdżyca mózgu i tętnic szyjnych może prowadzić do stanów niedokrwiennych i zawału mózgu, który często nazywany jest udarem mózgu. Innymi częstymi chorobami przewlekłymi są miażdżyca aorty brzusznej, związana z wysokim ciśnieniem tętni- czym krwi i miażdżyca tętnic kończyn dolnych. Chorzy cierpiący na powyższe schorzenia leczeni są farmakologicznie lub operacyjnie, dzięki czemu możliwe jest poprawienie jakości życia chorych, zatrzymanie postępu choroby miażdżycowej i zmniejszenie prawdopodobieństwa zawałów.

Do tej pory nie został poznany początkowy mechanizm rozwoju miażdżycy. Pierwszymi ob- serwowanymi zmianami jest przedostanie się lipoprotein, głównie frakcji LDL do ścian naczyń krwionośnych oraz utlenienie zawartości lipoprotein. Ponadto, reakcja zapalna w obrębie śród- błonka związana z migracją monocytów krwi do niego i transformacją w makrofagi, a potem w komórki piankowate, czyli makrofagi wypełnione lipidami (Hong, 2010). Z czasem ściany naczyń krwionośnych przechodzą takie zmiany jak: nadmierny podział komórek mięśniowych, produkcja macierzy pozakomórkowej, odkładanie kolagenu i proteoglikanów oraz powstawanie nowych naczyń krwionośnych. Stany zapalne śródbłonka i osłabienie naczyń prowadzi do uszko- dzeń mechanicznych, agregacji płytek krwi i tworzenia zakrzepów na powierzchni tętnic i dal- szego rozwoju choroby. Jednocześnie zachodzi ciągły proces gromadzenia lipidów, ich utleniania, wapnienia skupisk lipidów i tworzenia się agregatów cholesterolu, które dodatkowo osłabiają naczynia krwionośne.

Cholesterol jest uznawany za główny czynnik w rozwoju choroby miażdżycowej, przez co leczenie oparte na obniżeniu jego zawartości jest nieodłącznym sposobem leczenia i profilaktyki.

Leczenie wspomagane jest przez aktywność statyn, polegającą na promowaniu migracji mono- cytów ze ścian naczyń krwionośnych do krwi, podawaniem leków obniżających krzepliwość krwi, co zapobiega powstawaniu zakrzepów oraz β-blokerów, które obniżają ciśnienie krwi.

Zaburzenie homeostazy cholesterolu wiązane jest również z chorobami neurodegeneracyjny- mi, takimi jak choroba Alzheimera oraz choroba Niemanna-Picka typu C (Yanagisawa, 2002;

Koudinov i Koudinova, 2005).

Cholesterol nie tylko w nadmiarze prowadzi do stanów patologicznych. Jego brak niesie ze sobą szereg poważnych konsekwencji. Ingerencja, genetyczna lub farmakologiczna, w syntezę cholesterolu u myszy prowadzi do znaczących nieprawidłowości w rozwoju, a nawet śmierci mysich płodów (Ohashi i inni, 2003).