A N N A W LA ZŁY , ZD Z ISŁ A W TA R G O Ń SK I
POLIFENOLOOKSYDAZA I β-GLUKOZYDAZA W WYBRANYCH OWOCACH JAGODOWYCH
S t r e s z c z e n i e
Oznaczano aktywność polifenolooksydazy (PPO) i β-glukozydazay w owocach takich, jak: truskaw
ka, malina, porzeczka czerwona i porzeczka czarna. Z każdego rodzaju owocu wybrano 3 odmiany. Do oznaczenia stosowano metody spektrofotometryczne. Substrátem w reakcji enzymatycznej były katechol dla PPO i p-nitrofenolo^-D-ghikozyd dla β-glukozydazy. Zbadano również wpływ pH i temperatury na aktywność tych enzymów oraz ich termiczną inaktywację.
Aktywność PPO stwierdzono jedynie w truskawkach odmiany Senga-Sengana i D ucat, a aktywność β-glukozydazay w truskawkach Senga-Sengana, Ducat, M armolada i malinach Canby, Beskid, Seedling.
Optymalne warunki dla działania PPO były następujące: pH 4,5 i temp.45°C, a dla β-glukozydazay pH w zakresie 5,0-5,5 i temp. od 40°C do 50°C w zależności od pochodzenia enzymu.
Wstęp
O w oce i przetw ory z nich otrzym yw ane stanow ią jed en z istotnych składników diety człow ieka. Z jednej strony są one źródłem składników niezbędnych do praw i
dłow ego funkcjonow ania organizm u ludzkiego, a z drugiej strony dostarczają bogac
tw a zapachow ego i barw y żyw ności.
Jed ną z cech żyw ności, k tó rą spostrzegam y i w edług której oceniam y żyw ność od pierw szego w rażenia je s t barw a. W przypadku ow oców takich, jak : truskaw ki, m aliny, porzeczki czerw one, porzeczki czarne i produktów z nich otrzym yw anych barw ę kształtują naturalnie w ystępujące barw niki antocyjanow e, a także inne polifenole.
Zw iązki te po d leg ają jed n ak przem ianom pow odując poprzez to niekorzystne zm iany barw y. Istotny w pływ na przem iany endogennych polifenoli w szczególności w roz
drobnionych ow ocach i sokach m a aktyw ność dw óch enzym ów : β -glukozydazy i polifenolooksydazy [3],
M g r inż. A. Wlazły, prof, dr hab. Z. Targoński, Katedra Technologii Przem ysłu Rolno-Spożywczego i Przechowalnictwa, A kadem ia Rolnicza w Lublinie, ul. Skromna 8, Box 158, 20-950 Lublin.
PO LIFEN O LO O KSYD AZA I β -GLU KO ZYD AZA W W YBRANYC H O W O CACH JA G O D O W YC H 123 A ntocyjany, w ystępujące w form ie związanej w postaci glikozydów , stanow ią dom inującą form ę tych zw iązków w w iększości ow oców o barw ie czerw onej [12], β-glukozydaza pow oduje odszczepienie cząsteczki cukrów z tych antocyjanów i p o w stanie aglikonu o mniej intensyw nej barw ie i mniej stabilnego, ulegającego degrada
cji do bezbarw nych pochodnych [3],
P olifenolooksydaza (PPO) pow oduje przem ianę antocyjanów w ystępujących w form ie aglikonu, ja k i innych polifenoli. K atalizuje reakcje utleniania grup hydrok
sylow ych w obecności tlenu z w ytw orzeniem chinonów. Pow stałe chinony są w ysoko reaktyw ne i prow adzą do reakcji polim eryzacji i kondensacji pom iędzy białkam i i poli- fenolam i oraz są zdolne do łączenia się m iędzy sobą oraz z innym i zw iązkam i, dopro
w adzając w ten sposób do tw orzenia się w ysokocząsteczkow ych zw iązków o brązo
w ym zabarw ieniu [5, 10, 11],
Zw iązki fenolow e oddziaływ ują korzystnie na w artość biolog iczną produktów ow ocow ych. M iędzy innym i zapobiegają niekorzystnym zm ianom naczyń krw iono
śnych, po w odują neutralizację w olnych rodników oraz m ają p ew n ą aktyw ność prze- ciw now otw orow ą [7, 9], Polifenole w ykazują rów nież aktyw ność przeciw utleniającą, przez co ograniczają utlenianie m.in. w itam iny C i innych substancji [8],
Z żyw ieniow ego punktu w idzenia obecność PPO w ow ocach je st w ięc nieko
rzystna, poniew aż poprzez przem ianę zw iązków fenolow ych prow adzi do utraty ich w łaściw ości antyoksydacyjnych. N atom iast z technologicznego punktu w idzenia obec
ność PPO z jednej strony je st niekorzystna, poniew aż pow oduje niepożądane zm iany barw y produktów ow ocow ych, a z drugiej strony m a korzystny w pływ , poniew aż p o w odując przem iany zw iązków fenolow ych pozbaw ia ich niekorzystnych w łaściw ości, jakim i są m .in. tw orzenie zm ętnień i osadów w sokach, koncentratach ow ocow ych i w inach [7], Zm ętnienia te pow stają w w yniku kondensacji polifenoli m iędzy so b ą lub z innym i zw iązkam i.
Podatność ow oców na procesy brązow ienia i zm iany barw y zależy od aktyw ności polifenolooksydazy, ogólnej sum y zaw artych polifenoli, ich budow y, od bliskości sub
strátu dla PPO [4, 5, 7, 12], a także od aktyw ności β-glukozydazy.
Znajom ość w łaściw ości i aktyw ności polifenolooksydazy i β -glukozydazy m oże być pom ocna przy w yborze odm ian ow oców i m etod przetw arzania, by zagw aranto
wać odpow iednie cechy sensoryczne produktom ow ocow ym i stabilność ich barw y.
C elem pracy było określenie aktyw ności polifenolooksydazy i β -glukozydazy w ow ocach jagodo w ych oraz przeprow adzenie częściowej charakterystyki tych enzy
m ów pochodzących z różnych odm ian tego sam ego gatunku owoców.
Materiał i metody badań
M ateriałem badaw czym były następujące owoce:
• truskaw ki: Senga-Sengana, Ducat, M arm olada;
• m aliny: Canby, Beskid, Seedling;
• porzeczka czerw ona: Rondom, Holenderska, Jonker;
• porzeczka czarna: Ojebyn, Titania, Ben Lomond.
O w oce przechow yw ano w stanie zam rożenia w tem peraturze -20°C.
Ekstrakcja polifenolooksydazy i β -glukozydazy
W celu przeprow adzenia ekstrakcji enzym ów 20 g rozm rożonych ow oców hom o
genizow ano przez 60 sekund z 25 cm3 buforu cytrynianow o-fosforanow ego w g M c Ilv a in e a (sporządzonego z 0,1M kw asu cytrynow ego i 0,2M N a2H P 0 4) o pH 7,0 z dodatkiem Tritonu X -100 (1% ) i nierozpuszczalnego poliw inylopolipirolidonu (4%) [2], N astępnie całość pozostaw iono na 2 godz., w temp. 4°C, w ciem nym m iejscu. Po tym czasie całość odw irow ano przez 15 m in, przy obr. 9000*g, w 4°C. Do oznaczenia aktyw ności enzym ów użyto roztw oru znad osadu.
Oznaczanie aktyw ności polifenolooksydazy
O znaczenia aktyw ności PPO dokonano w reakcji z katecholem poprzez pom iar zm iany absorbancji próby właściw ej (A) i prób kontrolnych (B i C), przy długości fali 420 nm po upływ ie 30 m in w obec w ody destylowanej.
T a b e l a 1 Skład próby właściwej i prób kontrolnych do oznaczenia aktywności PPO.
The com position o f the studied sam ple and the control samples in polyphenoloxidase activity assay.
Składnik Component
Próby / Samples
A B C
0,02 M katechol
0,02 M catechol 2 cm3 2 cm3 -
B ufor Mc Ilvaine a
B uffer M c Ilvaine’a 1 cm3 1 cm3 -
Sok z owoców
Fruit juice 0,2 cm 3 - 0,2 cm 3
W oda destylow ana
Distilled w ater - 0,2 cm3 3 cm 3
Oznaczanie aktyw ności β -glukozydazy.
A ktyw ność β -glukozydazy oznaczono w reakcji z p-nitrofenolo-P-D -glukozydem , poprzez pom iar absorbancji próby właściw ej (A) i prób kontrolnych (B i C), przy dł.
fali 420 nm po upływ ie 30 m in i dodaniu po tym czasie 1 cm 3 1 M N a2C0 3 do w szyst
kich prób.
PO LIFEN O LO O KSYD AZA I β -GLU KO ZYD AZA W W YBRANYC H O W O CACH JA G O D O W YC H 125 T a b e l a 2
Sklad próby właściwej i prób kontrolnych do oznaczania aktywności β -glukozydazy.
The com position o f the studied sam ple and the control samples in β-glucosidase activity assay.
Składnik Próby / Samples
Component A B C
0,9956 mM p-nitrofenolo-P-D-glukozyd
0,9956 m M p-nitrophenol-fi-D-glucoside 0,75 cm 3 0,75 cm3 -
Bufor M c Ilvaine a
0,75 cm3 0,75 cm 3 Buffer M c Ilvaine’a
Sok z owoców
0,2 cm3 0,2 cm 3
Fruit juice
Woda destylow ana
Distilled w ater - 0,2 cm3 1,5 cm 3
A bsorbancję, do określenia aktyw ności enzym ów , w yliczono w edług wzoru:
Ε χ = Ea — [ Eb + Ec ] Ea — absorbancja p róby A,
Eb - absorbancja próby B, E c - absorbancja próby C.
Za jed n o stk ę aktyw ności polifenolooksydazy i β -glukozydazy przyjęto zm ianę absorbancji o 0,001 w yw oływ aną przez 1 cm 3 enzym u w ciągu 1 m in w w arunkach oznaczenia.
Wpływ p H na aktywność PPO i β -glukozydazy
B adając w pływ pH na aktyw ność enzym ów dokonyw ano pom iaru aktyw ności w buforze M c Ilvaine a o następujących w artościach pH: 3,0; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 7,0 w tem peraturze 40°C .Pozostałe w arunki były takie, ja k przy oznaczaniu aktyw ności en
zym atycznych.
Wpływ temperatury na aktywność PPO i β -glukozydazy
W pływ tem peratury na aktyw ność w /w enzym ów przeprow adzono w następują
cych tem peraturach: 20°C, 30°C , 40°C, 45°C ,50°C, 55°C, 60°C, 65°C, p rzy takiej w artości pH , przy której enzym w ykazyw ał n ajw yższą aktyw ność. Pozostałe w arunki były takie, ja k przy oznaczaniu aktyw ności enzym atycznych.
Termiczna inaktywacja PPO i β -glukozydazy
W celu zbadania term icznej inaktyw acji enzym ów w czasie, roztw ór zaw ierający enzym zm ieszany z buforem cytrynianow o-fosforanow ym w g M c Ilvaine a (o pH przy
którym enzym w ykazyw ał najw yższą aktyw ność) w stosunku 1:1 ogrzew ano w tem pe
raturach 45°C i 55°C i m ierzono aktyw ność po 0,5, 1, 2, 4 godz. oraz w tem peraturze 65°C m ierząc aktyw ność po 5, 10, 15, 20, 30 m inutach. Pom iaru dokonyw ano przy takiej w artości pH , przy której enzym w ykazyw ał najw yższą aktyw ność.
Omówienie wyników
Badanie w łaściw ości polifenolooksydazy
A ktyw ność polifenolooksydazy została stw ierdzona jed y n ie w truskaw kach dw óch odm ian Senga-Sengana i Ducat. Pozostałe ow oce nie w ykazyw ały aktyw ności tego enzym u.
N ajw y ższą aktyw ność PPO uzyskano przy pH 4,5. W ynik ten był identyczny dla obydw u odm ian truskaw ek: Senga-Sengana i D ucat, a aktyw ność w ynosiła odpow ied
nio 25,8 i 14,7 jednostek. W zakresie pH 3 ,0 -7 ,0 enzym m iał najniższą aktyw ność przy pH 3,0. A ktyw ność PPO obecnej w w yciągu z truskaw ek odm iany Senga- Sengana w tym pH stanow iła jed y n ie 3,8% aktyw ności m aksym alnej, a z odm iany D ucat 8,1% (rys. 1).
Rys. 1. W pływ pH na aktyw ność polifenolooksydazy obecnej w wyciągach z truskawek.
Fig. 1. Effect o f pH on the activity o f strawberry polyphenolooxidase.
W w yniku badań aktyw ności PPO w różnych tem peraturach, najw yższą aktyw ność posiadał enzym obecny w w yciągu z obydw u odm ian truskaw ek, w temp.45°C.
Poniżej i pow yżej tej tem peratury aktyw ność była niższa, lecz jeszcze w tem peraturze 65°C aktyw ność enzym u kształtow ała się na poziom ie 30% aktyw ności m aksym alnej dla odm iany D ucat i 19,2% dla odm iany Senga-Sengana (rys. 2).
Rys. 2. Wpływ temperatury na aktywność polifenolooksydazy obecnej w wyciągach z truskawek.
Fig. 2. Effect o f temperature on the activity o f strawberry polyphenolooxidase.
Pod wpływem ogrzewania wyciągu z owoców następował spadek aktywności PPO. Po upływie 4 godzin ogrzewania w temperaturze 45°C aktywność PPO obecnej w wyciągu z truskawek Senga- Sengana kształtowała się na poziomie 47% aktywno
ści początkowej, a w temperaturze 55°C 17,2%. Całkowita inaktywacja enzymu nastą
piła w temp.70°C po 30min ogrzewania. Natomiast w temperaturze 65°C po 30 min aktywność stanowiła 16,6% aktywności początkowej (Rys. 3).
Rys. 3. Termiczna inaktywacja polifenolooksydazy obecnej w wyciągach z truskawek Senga-Sengana, w różnych temperaturach.
Fig. 3. Thermal inactivation o f Senga-Sengana strawberry polyphenolooxidase at different temperature.
Badanie aktyw ności β -glukozydazy
A ktyw ność β -glukozydazy stw ierdzono w truskaw kach odm iany Senga-Sengana, Ducat, M arm oada oraz m alinach odm iany Canby, Beskid, Seedling. N atom iast po
rzeczka czerw ona i porzeczka czarna nie w ykazyw ały aktyw ności tego enzymu.
O ptym alna w artość pH dla działania β-glukozydazy w ynosiła 5,0 dla enzym u obecnego w w yciągu z truskaw ek odm iany Senga-Sengana, D ucat i m alin odm iany Canby, Beskid, Seedling oraz 5,5 dla enzym u obecnego w w yciągu z truskaw ek M a r
molada. N ajw yższą aktyw ność posiadał enzym obecny w w yciągu z truskaw ek D ucat i w ynosiła ona 58,6 jednostki, β -glukozydaza obecna w w yciągu z m alin w szystkich odm ian nie posiadała aktyw ności w pH 3,0 i 7,0.
W przypadku β -glukozydazy obecnej w w yciągu z m alin aktyw ność w różnych pH kształtow ała się podobnie niezależnie od odm iany (rys. 5). N atom iast β-glukozydaza obecna w w yciągu z truskaw ek w zależności od odm iany w ykazyw ała znaczne zróżnicow anie aktyw ności przy tych sam ych w artościach pH (rys. 4).
Rys. 4. W pływ pH na aktywność β -glukozydazy obecnej w wyciągach z truskawek.
Fig. 4. Effect o f pH on the activity o f strawberry β -glucosidase.
O ptym alna w artość tem peratury działania β-glukozydazy w ynosiła 50°C w p rzy
padku enzym u obecnego w w yciągach ze w szystkich badanych odm ian truskaw ek, a 45°C w przypadku enzym u obecnego w w yciągu z m alin Canby i 40°C dla enzym u obecnego w w yciągach z m alin B eskid i Seedling. N ajniższe aktyw ności uzyskano w tem peraturze 65°C dla β-glukozydazy obecnej w w yciągach z truskaw ek D ucat i m alin Seedling. A ktyw ność w tej tem peraturze stanow iła odpow iednio 30% i 2,8%
aktyw ności m aksym alnej. W przypadku β -glukozydazy obecnej w w yciągach z pozo
stałych źródeł najniższą aktyw ność stw ierdzono w tem peraturze 20°C (rys. 6 i rys. 7).
POLIFENOLOOKSYDAZA I β-GLUKOZYDAZA W WYBRANYCH OWOCACH JAGODOWYCH 129
pH
Rys. 5. W pływ pH na aktyw ność β -glukozydazy obecnej w w yciągach z malin.
Fig. 5. Effect o f pH on the activity o f raspberry β-glucosidase.
Rys. 6. W pływ tem peratury na aktyw ność β-glukozydazy obecnej w wyciągach z truskawek.
Fig. 6. Effect o f tem perature on the activity o f strawberry β-glucosidase.
P od w pływ em ogrzew ania w yciągu z truskaw ek Senga-Sengana i m alin Canby następow ał spadek aktyw ności obecnej tam β -glukozydazy. A ktyw ność β -glukozydazy spadała ju ż pow yżej 40°C. Po 4 godzinach ogrzew ania w tem peraturze 45°C aktyw ność β -glukozydazy obecnej w w yciągu z truskaw ek kształtow ała się na poziom ie
31,6% aktyw ności początkow ej, a w tem peraturze 55°C na poziom ie 5,8% aktyw ności początkow ej. N atom iast aktyw ność β -glukozydazy obecnej w w yciągu z m alin po 4 godzinach ogrzew ania w tem p.45°C stanow iła 9,1% aktyw ności początkow ej, a w temp. 55°C 1% aktyw ności początkow ej. C ałkow ita inaktyw acja β -glukozydazy obec
nej w w yciągu z truskaw ek nastąpiła po 15 m in ogrzew ania w temp. 65°C, a β- glukozydazy obecnej w w yciągu z m alin po 30 m in ogrzew ania w tej tem peraturze (rys. 8).
Rys. 7. W pływ tem peratury na aktywność β-glukozydazy obecnej w w yciągach z malin.
Fig. 7. E ffect o f tem perature on the activity o f raspberry β -glucosidase.
Rys. 8. Term iczna inaktywacja β-glukozydazy w różnych temperaturach.
Fig. 8. Thermal inactivation o f β -glucosidase at different temperature.
PO LIFEN O LO O KSYD AZÁ I β -G LU KO ZYD AZA W W YBRANYC H O W O C ACH JA G O D O W YC H 131 W n io sk i
1. O w oce jagodow e, tj. truskaw ka, m alina, porzeczka czarna, porzeczka czerwona, różn ią się znacznie pod w zględem aktyw ności polifenolooksydazy i β -glukozy- dazy. W pływ na poziom aktyw ności tych enzym ów w ow ocach m a rów nież od
miana.
2. Soki z porzeczki czerwonej i porzeczki czarnej nie w ykazyw ały aktyw ności polife
nolooksydazy i β-glukozydazy, a soki z m alin i truskaw ek odm iany M arm olada w ykazyw ały tylko aktyw ność β -glukozydazy.
3. W ykazane różnice w aktyw ności polifenolooksydazy i β -glukozydazy zależne od odm iany ow ocu sugerują, że aktyw ności tych enzym ów pow inny być brane pod uw agę przy opracow yw aniu technologii przetw órstw a tych owoców.
4. N ajw yższą aktyw ność w ykazyw ała polifenolooksydaza obecna w w yciągu z tru
skaw ek odm iany Senga-Sengana i β-glukozydaza obecna w w yciągu z truskaw ek odm iany Ducat.
5. O ptym alna w artość pH i tem peratury dla działania enzym ów zależały od źródła, z którego pochodziły enzym y i w ynosiły dla PPO pH 4,5, temp. 45°C, a dla β -gluko- zydazy pH w zakresie 5,0-5,5, temp. od 40°C do 50°C w zależności od odm iany owoców.
L IT E R A T U R A
[1] Fraignier M.P., M arques L., Fleuriet A., M acheix J.J.: Biochem ical and Immunochemical Characte
ristics o f Polyphenol Oxidase from D ifferent Fruits o f Prunus. J. Agric. Food Chem., 9, 1995, 2375.
[2] Gonzalez E.M ., D e Ancos B., Pilar Cano M.: Partial Characterization o f Polyphenol Oxidase A c
tivity in Raspberry Fruits. J. Agric. Food Chem., 47, 1999, 4068.
[3] H orubala A.: Zm iany barwy soków owocowych w procesach technologicznych ich otrzym yw ania i przechow ywania. Przem. Ferm., 8, 1996, 31.
[4] Lee C.Y., K agan V., Jaworski A.W ., Brown S.K.: Enzymatic Browning in Relation to Phenolic Com pound and Polyphenoloxidase A ctivity Among Various Peach Cultivars. J. Agric. Food Chem., 1990, 99.
[5] Łoś J., W ilska-Jeszka J., Paw lak M.: Enzymatic Oxidation o f Polyphenols in Fruit Products and M odel Solution. Pol. J. Food Nutr. Sci., 1, 1996, 83.
[7] O szm iański J.: Przem iany enzym atyczne związków fenolowych w układach modelowych i ekstrak
tach owocowych. Zesz. Nauk. AR, W rocław, 74, 1988, 7.
[8] Oszmiański J.: Polifenole jako naturalne przeciwutleniacze w żywności. Przem. Spoż., 3, 1995, 94.
[9] Sikorski Z.E.: Chem iczne i funkcjonalne w łaściwości składników żywności. WNT, W arszawa 1994.
[10] W esche-Ebeling P., M ontgom ery M.W.: Strawberry Polyphenolooxidase: Extraction and Partial Characterization. J. Food Sci., 5, 1990, 1320.
[11] W esche-Ebeling P., M ontgom ery M.W.: Strawberry Polyphenolooxidase: Purification and Charac
terization. J. Food Sci., 5, 1990, 1315.
[12] W ightm an J.D., W rolstad R.E.: Anthocyanin Analysis as a Measure o f G lucosidase A ctivity in Enzym es for Juice Processing. J. Food Sci., 4, 1995, 862.
POLYPHENOLOOXIDASE AND β-GLUCOSIDASE IN SELECTED BERRY FRUITS
S u m m a r y
The activity o f polyphenolooxidase (PPO) and β -glucosidase in the following fruits: strawberry, rasp
berry, red currant, black currant was estimated. From each kind o f fruit three varieties were selected.
Spectrophotom etric methods were used to estimate the enzymatic activity. The substrates for the enzy
matic reactions were catechol for PPO and p-nitrophenol^-D -glucosidc for β-glucosidase. The influence o f pH value and tem perature on the activity o f the enzymes and their thermal inactivation w as also inves
tigated.
PPO activity w as detected in the following varieties o f strawberries: Senga-Sengana, Ducat.
β-glucosidase activity in strawberries: Senga-Sengana, Ducat, M armolada and in the following varieties o f raspberry: Canby, Beskid, Seedling w as studied. The optimal conditions for PPO were as follows: pH 4,5, tem perature 45°C, and for β -glucosidase pH in the range o f 5,0-5,5 and tem perature 40°C to 50°C depending on the origin o f the enzyme. ^
![SPIS TREŚCI W S P O M N I E N I A [I N M E M O R I A M]](data:image/gif;base64,R0lGODlhAQABAIAAAP///wAAACH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAICRAEAOw==)