Praca oryginalna Original paper
Rola uk³adu immunologicznego w rozwoju oraz samoistnym ustêpowaniu zmian grzybiczych u zwie-rz¹t i cz³owieka jest przedmiotem badañ wielu auto-rów. Wyniki tych badañ jednoznacznie wskazuj¹, ¿e odpornoæ przeciwgrzybicza wi¹¿e siê z aktywacj¹ komórek ¿ernych, rozwojem nadwra¿liwoci typu pó-nego (DTH Delayed-Type-Hypersensitivity) i uczu-laniem klonów swoistych limfocytów T (2, 11, 12). Supresja komórkowych mechanizmów odpornoci przeciwgrzybiczej u zwierz¹t przebywaj¹cych w ro-dowisku zaka¿onym jest warunkiem wyst¹pienia jaw-nej postaci grzybicy skórjaw-nej. Nastêpstwem supresji odpowiedzi immunologicznej typu komórkowego wywo³anej infekcj¹ grzybicz¹ jest antygenowo specy-ficzna hyporeaktywnoæ lub uogólniona anergia, co przyczynia siê do rozwoju przewlek³ej grzybicy skóry (12, 13, 18). Z³o¿onoæ procesów immunopatogenezy przewlek³ych infekcji grzybiczych sprawia, ¿e towa-rzysz¹ce im zjawiska immunologiczne poznano w nie-wielkim stopniu.
Celem badañ by³a analiza cytometryczna subpopu-lacji limfocytów zawieraj¹cych cz¹steczki CD3, CD4, CD8, CD19 i CD25 oraz okrelenie surowiczego poziomu czynnika martwicy nowotworów TNF-a
(Tumor Necrosis Factor) i IL-10 w krwi obwodowej u królików z przewlek³¹ grzybic¹ skórn¹ wywo³an¹ przez Trichophyton mentagrophytes.
Materia³ i metody
Zwierzêta dowiadczalne. Badania przeprowadzono w fermie królików rasy nowozelandzkiej, licz¹cej 190 sam-ców i 950 samic w ci¹g³ym cyklu produkcyjnym, w której od kilku lat stacjonarnie wystêpuje grzybica skórna wywo-³ana przez Trichophyton mentagrophytes var. granulosum. Króliki trzymane by³y w systemie chowu klatkowego z au-tomatycznymi poid³ami w halach z wentylacj¹ grawitacyj-n¹ i mechanicznym nawiewem wie¿ego powietrza, owiet-lone w sposób naturalny w okresie wiosenno-letnim i sztuczny w okresie jesienno-zimowym. Hale w okresie zimowym ogrzewane by³y nadmuchem ciep³ego powietrza. Zwierzêta tworz¹ce stado podstawowe wraz z przychów-kiem trzymane by³y w oddzielnych halach. Warunki zoo-higieniczne i sanitarne w fermie by³y zadowalaj¹ce. Króli-ki ¿ywiono pe³noporcjow¹ pasz¹ granulowan¹ z dodatKróli-kiem kokcydiostatyków przy sta³ym dostêpie do wody.
Badania wykonano na 15 królikach rasy nowozelandz-kiej (grupa I) w wieku 16 tygodni, u których badaniem kli-nicznym stwierdzono uogólnion¹ postaæ trychofitozy. Od tych królików izolowano T. mentagrophytes var.
granulo-Ocena subpopulacji limfocytów oraz wybranych
cytokin u królików z przewlek³¹ trichofitoz¹
KRZYSZTOF KOSTRO, KATARZYNA WOJCICKA-LORENOWICZ, BARBARA MAJER-DZIEDZIC*, £UKASZ JAROSZ, TOMASZ PIECH**,
MARIUSZ MIKO£AJCZAK***
Zak³ad Epizootiologii i Klinika Chorób Zakanych Instytutu Chorób Zakanych i Inwazyjnych, Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej AR, ul. G³êboka 30, 20-612 Lublin
*Zak³ad Mikrobiologii Weterynaryjnej Instytutu Chorób Zakanych i Inwazyjnych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej AR, ul. Akademicka 12, 20-033 Lublin
**Katedra i Klinika Rozrodu Zwierz¹t Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej AR, ul. G³êboka 30, 20-612 Lublin ***Lecznica dla zwierz¹t, ul. Wyszyñskiego 5b, 87-100 Toruñ
Kostro K., Wojcicka-Lorenowicz K., Majer-Dziedzic B., Jarosz £., Piech T., Miko³ajczak M.
Evaluation of lymphocyte subpopulation and some cytokines in rabbits with chronic trichophytosis Summary
The aim of the study was to carry out a cytometric analysis of a lymphocyte subpopulation with markers CD3, CD4, CD8, CD19 and CD25 and to ascertain the serum level of TNF-a and IL-10 in the peripheral blood of rabbits with chronic trichophytosis, caused by Trichophyton mentagrophytes. The suppression of cellular immune responses in trichophytic rabbits was characterized by an increase in the percentage of suppressor lymphocytes TCD8+ and a decrease in the proportion of TCD4+/TCD8+. The immunological profile of rabbits
with chronic trichophytosis was characterized by an increased level of Th2 and, hence, by an increased production of IL-10. The high concentrations of IL-10 most probably generated anergic lymphocytes TCD4+
and TCD8+ which, in turn, induced antigenic specific immunosuppression. This is due to the key role that this
cytokine plays in regulating immune responses aimed at restricting inflammation and increasing humoral immune responses while simultaneously blocking Th1 type cytokines.
sum. W trakcie wywiadu z w³acicielem ustalono, ¿e zmia-ny grzybicze u wytypowazmia-nych do badañ królików muj¹ siê oko³o 12 tygodni. Ze wzglêdu na d³ugotrwa³e utrzy-mywanie siê zmian chorobowych rozpoznan¹ grzybicê skór-n¹ zakwalifikowano jako przewlek³¹ postaæ trychofitozy. Grupê kontroln¹ (grupa II) stanowi³o 8 zdrowych królików rasy nowozelandzkiej bêd¹cych w tym samym wieku i po-chodz¹cych z hodowli, w której ta choroba dotychczas nie wystêpowa³a.
Badania hematologiczne. Ogóln¹ liczbê leukocytów, limfocytów, granulocytów i monocytów krwi obwodowej u królików dowiadczalnych oznaczono metod¹ cyto-metrii przep³ywowej (Cytron Absolute-Ortho Diagnostic System, Germany).
Okrelenie cz¹steczek powierzchniowych CD3, CD4+,
CD8+, CD19 i CD25 na limfocytach. Badania wykonano
metod¹ cytometrii przep³ywowej stosuj¹c dwustopniowe znakowanie komórek. W pierwszym etapie u¿yto mysich przeciwcia³ monoklonalnych skierowanych przeciwko cz¹steczkom powierzchniowym CD3, CD4, CD8, CD19 i CD25 obecnym na limfocytach cz³owieka, za w drugim przeciwcia³ króliczych znakowanych izotiocyjanianem fluo-resceiny (FITC-Fluoroisothiocyanate) skierowanych prze-ciwko mysiej IgG (Serotec Immunological Excellence Oxford, England). Oznaczenia wykonano zgodnie z za³¹-czon¹ do zestawów przeciwcia³ procedur¹.
Do 100 µl pe³nej krwi królika dodawano 10 µl przeciw-cia³ mysich skierowanych przeciwko nastêpuj¹cym cz¹s-teczkom powierzchniowym na limfocytach cz³owieka: anty--CD3, CD4, CD8, CD19 i CD25. Przygotowane w ten spo-sób próbki inkubowano przez 45 minut w ³ani lodowej w ciemnoci, a nastêpnie p³ukano 3-krotnie p³ynem PBS. Próbki po ka¿dym p³ukaniu wirowano przez 6 minut przy 150 × g w 4°C. Do otrzymanego osadu komórek dodawano 10 µl przeciwcia³a króliczego znakowanego FITC skiero-wanego przeciwko mysiej IgG i inkubowano przez 45 mi-nut w ³ani lodowej w ciemnoci. Nastêpnie zawiesinê ko-mórek p³ukano 3-krotnie p³ynem PBS i po ostatnim odwi-rowaniu i zlaniu supernatantu dodawano 2 ml p³ynu lizuj¹-cego w celu pozbycia siê erytrocytów. Po 10 minutowej inkubacji komórek z p³ynem lizuj¹cym w temperaturze pokojowej w ciemnoci dokonywano pomiaru znakowa-nych komórek na cytometrze przep³ywowym.
Oznaczanie surowiczego poziomu TNF-a i IL-10. Cytokiny oznaczono metod¹ ELISA, u¿ywaj¹c gotowego zestawu firmy Immunotech Beckaman Coulter Comp. Fran-ce, przeznaczonego do oznaczania wy¿ej wymienionych cy-tokin u cz³owieka. Przeciwcia³a skierowane przeciwko TNF-a i IL-10 cz³owieka reaguj¹ krzy¿owo z analogiczny-mi cytokinaanalogiczny-mi królika. Oznaczenia poszczególnych cyto-kin wykonano wed³ug za³¹czonej do zestawów procedury. Stê¿enie TNF-a i IL-10 wyra¿ono w pg/ml.
Wyniki i omówienie
Wyniki ogólnej liczby leukocytów, limfocytów, monocytów i granulocytów w krwi obwodowej u kró-lików z przewlek³¹ trychofitoz¹ oraz u zwierz¹t kon-trolnych przedstawiono na rycinach 1, 2, 3 i 4. rednie wartoci leukocytów u królików w grupie dowiad-czalnej, z wyj¹tkiem dnia rozpoczêcia badañ, by³y
sta-tystycznie istotnie (p £ 0,01) wy¿sze w porównaniu do grupy kontrolnej w pozosta³ych terminach ozna-czeñ (ryc. 1). W grupie królików z przewlek³¹ tricho-fitoz¹ maksymalne wartoci leukocytów obserwowa-no w ostatnich dwóch terminach badañ. U królików w grupie kontrolnej rednie wartoci leukocytów utrzy-mywa³y siê na poziomie zbli¿onym do wyjciowego przez ca³y okres obserwacji.
Z danych na ryc. 2 wynika, ¿e w grupie dowiad-czalnej istotny wzrost (p £ 0,01) rednich wartoci limfocytów w porównaniu do wartoci wyjciowych i kontroli utrzymywa³ siê przez ca³y okres badañ. U królików w grupie kontrolnej rednie wartoci gra-nulocytów by³y zbli¿one we wszystkich terminach oznaczeñ.
rednie wartoci bezwzglêdnej liczby monocytów w grupie dowiadczalnej by³y statystycznie istotnie wy¿sze (p £ 0,01) ni¿ w grupie kontrolnej w toku
ca-Ryc. 1. Bezwzglêdna liczba leukocytów w krwi obwodowej u królików z przewlek³¹ trichofitoz¹ (x ± SD)
Objanienia: A ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy grup¹ dowiadczaln¹ a kontroln¹ (p £ 0,01); B ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy poszczególnymi pobraniami a dniem 70. (p £ 0,01)
Ryc. 2. Bezwzglêdna liczba limfocytów w krwi obwodowej u królików z przewlek³¹ grzybic¹ skórn¹ (x ± SD)
Objanienia: a ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy grup¹ dowiadczaln¹ a kontroln¹ (p £ 0,05); A ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy grup¹ dowiadczaln¹ a kontroln¹ (p £ 0,01); B ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy poszczególnymi po-braniami a dniem 70. (p £ 0,01)
³ej obserwacji (ryc. 3). U królików w grupie kontrol-nej rednie wartoci monocytów utrzymywa³y siê na podobnym do wyjciowego poziomie przez ca³y okres obserwacji.
Porównuj¹c rednie wartoci granulocytów w poszczególnych terminach badañ w grupie dowiadczalnej zaobserwowano, ¿e oprócz dnia rozpoczêcia badañ, by³y one zbli¿one do wartoci grupy kontrolnej w pozosta³ych ter-minach oznaczeñ (ryc. 4). U królików w gru-pie kontrolnej rednie wartoci granulocytów by³y zbli¿one we wszystkich terminach ozna-czeñ.
Cytometryczn¹ analizê subpopulacji limfo-cytów CD3, CD4, CD8, CD19 i CD25 oraz stosunek limfocytów CD4 do CD8 ilustruje tab. 1 oraz ryc. 5. Najwy¿szy odsetek limfocy-tów CD3 u królików z przewlek³¹ trichofitoz¹ stwierdzono w dniu rozpoczêcia badañ i ró¿-ni³ siê on istotnie (p £ 0,01) w stosunku do zwierz¹t grupy kontrolnej. Nastêpnie w gru-pie zwierz¹t dowiadczalnych notowano stop-niowy i statystycznie istotny (p £ 0,01)
spa-dek odsetka limfocytów CD3 w stosunku do wartoci pocz¹tkowej i w ostatnim dniu badañ stwierdzono jego najni¿sze rednie wartoci w toku ca³ego dowiadcze-nia. W grupie kontrolnej odsetek limfocytów CD3 utrzymywa³ siê z niewielkimi odchyleniami na tym samym poziomie przez ca³y okres obserwacji i by³ on statystycznie istotnie ni¿szy w stosunku do królików z przewlek³¹ trichofitoz¹ we wszystkich terminach badañ.
Z danych tab. 1 wynika, ¿e w dniu rozpoczêcia ba-dañ odsetek limfocytów CD4 u królików z przewlek³¹ trichofitoz¹ by³ zbli¿ony do zwierz¹t grupy kontrol-nej. Po tym czasie notowano stopniowy wzrost odset-ka limfocytów CD4 w grupie dowiadczalnej i w ostat-nich dwóch terminach badañ jego rednie wartoci by³y statystycznie istotne wy¿sze tak w odniesieniu do
ñ e iz D Grupa CD3 CD4+ CD8+ CD19 CD25 . 0 7 a n l a z c d a i w o d (7±14,8,1A) (±415,,14) (2±81,7,7A) (±4,28,a1) (7±78,1,5A) a n l o rt n o k (±474,,41) (±381,,48) (±141,,87) (±21,9,8) (±521,,99) . 4 8 a n l a z c d a i w o d (6±81,5,2A) (4±43,5,3A) 3(±2,19,A7,)B (±5,17,A5) (8±02,2,9A) a n l o rt n o k (±493,,82) (±393,,64) (±153,,82) (±31,3,3) (±542,,44) . 8 9 a n l a z c d a i w o d 6(±2,25,A2,B) 4(±6,21,A9,B) 3(±4,29,A9,B) 1(±3,29,A6,B) 8(±7,27,A4,B) a n l o rt n o k (±473,,94) (±392,,16) (±152,,17) (±30,2,9) (±533,,92) . 2 1 1 a n l a z c d a i w o d 6(±0,25,A2,B) 4(±5,21,A9,)b 3(±5,24,A9,B) 1(±6,29,A6,B) 8(±6,27,A4,B) a n l o rt n o k (±473,,94) (±372,,96) (±152,,17) (±20,8,9) (±550,,39)
Tab. 1. Odsetek limfocytów CD3, CD4+, CD8+, CD19 i CD25 w krwi
obwodowej u królików z przewlek³¹ grzybic¹ skórn¹ (x ± SD) Ryc. 3. Bezwzglêdna liczba monocytów w krwi obwodowej
u królików z przewlek³¹ grzybic¹ skórn¹ (x ± SD)
Objanienia: A ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy grup¹ dowiadczaln¹ a kontroln¹ (p £ 0,01)
Ryc. 4. Bezwzglêdna liczba granulocytów w krwi obwodowej u królików z przewlek³¹ grzybic¹ skórn¹ (x ± SD)
Objanienia: a ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy grup¹ dowiadczaln¹ a kontroln¹ (p £ 0,05)
Ryc. 5. Stosunek limfocytów CD4 do CD8 we krwi obwodo-wej u królików z przewlek³¹ trichofitoz¹ (x ± SD)
Objanienia: a ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy grup¹ dowiadczaln¹ a kontroln¹ (p £ 0,05); A ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy grup¹ dowiadczaln¹ a kontroln¹ (p £ 0,01); b ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy poszczególnymi pobraniami a dniem 70. (p £ 0,05); B ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy poszczególnymi pobraniami a dniem 70. (p £ 0,01)
wartoci wyjciowej (p £ 0,01 lub p £ 0,05), jak i grupy kontrolnej (p £ 0,01). Natomiast odsetek lim-focytów CD8 u królików z przewlek³¹ trichofitoz¹ ju¿ w dniu rozpoczêcia badañ by³ istotnie wy¿szy w po-równaniu do kontroli. W kolejnych terminach ozna-czeñ obserwowano dalszy istotny wzrost odsetka lim-focytów CD8 w stosunku do wartoci wyjciowych (p £ 0,01) oraz kontroli (p £ 0,01) i w 112. dniu ba-dañ stwierdzono jego maksymalne wartoci. U króli-ków grupy kontrolnej odsetek limfocytów CD4 i CD8 utrzymywa³ siê na zbli¿onym do wyjciowego pozio-mie w toku ca³ego dowiadczenia.
Stosunek limfocytów CD4 do CD8 u królików z przewlek³¹ trichofitoz¹ we wszystkich terminach oznaczeñ by³ wyranie ni¿szy w stosunku do kontroli i wynosi³ kolejno 1,4, 1,3, 1,3 i 1,2 (ryc. 5). Natomiast w grupie kontrolnej w tych samych terminach badañ wartoci stosunku limfocytów CD4 do CD8 by³y zbli-¿one do wartoci pocz¹tkowej (2,6) i wynosi³y odpo-wiednio 2,5, 2,6 i 2,5.
Z danych tab. 1 wynika, ¿e odsetek limfocytów CD19 u królików z przewlek³¹ trichofitoz¹ ju¿ w pierwszych dwóch terminach badañ by³ istotnie wy¿-szy w porównaniu do zwierz¹t z grupy kontrolnej. Od 98. dnia w grupie dowiadczalnej notowano dalszy i statystycznie istotny (p £ 0,01) wzrost odsetka limfo-cytów CD19 w porównaniu do wartoci pocz¹tkowej oraz kontroli i w ostatnim dniu oznaczeñ stwierdzono maksymalne jego wartoci w toku ca³ego dowiadcze-nia. U królików w grupie kontrolnej odsetek limfocy-tów CD19 utrzymywa³ siê z niewielkimi odchylenia-mi na tym samym pozioodchylenia-mie przez ca³y okres obserwa-cji i by³ on statystycznie istotnie ni¿szy ni¿ w grupie dowiadczalnej we wszystkich terminach badañ.
Odsetek limfocytów CD25 u zwierz¹t dowiadczal-nych do 84. dnia obserwacji utrzymywa³ siê na po-dobnym poziomie i by³ istotnie wy¿szy (p £ 0,01) w porównaniu do grupy kontrolnej (tab. 1). W 98. dniu nast¹pi³ dalszy i istotny wzrost rednich wartoci lim-focytów CD25 tak w stosunku do wartoci wyjcio-wej (p £ 0,01), jak i grupy kontrolnej (p £ 0,01) i na zbli¿onym poziomie utrzymywa³y siê one do koñca badañ. W grupie kontrolnej odsetek limfocytów CD25 utrzymywa³ siê na zbli¿onym poziomie przez ca³y okres obserwacji i by³ on w ka¿dym terminie ozna-czeñ istotnie ni¿szy ni¿ u królików z przewlek³¹ tri-chofitoz¹.
Kszta³towanie siê surowiczego poziomu TNF-a i IL-10 w krwi obwodowej u królików z przewlek³¹ trichofitoz¹ ilustruje ryc. 6 i 7. U królików grupy do-wiadczalnej rednie wartoci TNF-a utrzymywa³y siê z niewielkimi odchyleniami na tym samym poziomie przez ca³y okres obserwacji i by³y zbli¿one do war-toci w grupie kontrolnej (ryc. 6). Natomiast rednie wartoci IL-10 u królików z przewlek³¹ trichofitoz¹ do 84. dnia obserwacji utrzymywa³y siê na podobnym poziomie i by³y istotnie wy¿sze (p £ 0,01) w porów-naniu do grupy kontrolnej (ryc. 7). W ostatnich dwóch
terminach oznaczeñ w grupie dowiadczalnej notowa-no dalszy istotny wzrost poziomu IL-10 w stosunku do wartoci pocz¹tkowej i grupy kontrolnej i w 112. dniu badañ stwierdzono jego maksymalne rednie wartoci w toku ca³ego dowiadczenia. W grupie kon-trolnej rednie wartoci IL-10 utrzymywa³y siê na zbli-¿onym poziomie przez ca³y okres obserwacji i by³y one statystycznie istotnie ni¿sze ni¿ u królików z prze-wlek³¹ trichofitoz¹ we wszystkich terminach badañ.
W odpornoci przeciwgrzybiczej g³ówn¹ rolê pe³-ni¹ komórkowe mechanizmy odpornoci wrodzonej i nabytej. Te dwa rodzaje odpornoci s¹ powi¹zane i nadzorowane przez szereg cz¹steczek i receptorów, które w ca³oci stanowi¹ wysoce skoordynowany i harmonijny mechanizm protekcyjny w zaka¿eniach dermatofitami. Przewlek³e zaka¿enia grzybicze wystê-puj¹ u osobników z niedoborem odpornoci typu ko-mórkowego, co wskazuje na jej zasadnicz¹ rolê w zwalczaniu infekcji wywo³anych dermatofitami (1, 2, 9, 12). Green i wsp. (6) wywo³ali przewlek³e zaka-¿enie przez T. mentagrophytes we fragmentach skóry winki morskiej transplantowanych do bia³ych myszy z wrodzonym brakiem grasicy. Utrzymuj¹c¹ siê w kse-nogenicznym przeszczepie przewlek³¹ infekcjê,
któ-Ryc. 7. Surowiczy poziom IL-10 w krwi obwodowej u króli-ków z przewlek³¹ trychofitoz¹ (x ± SD)
Objanienia: A ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy grup¹ dowiadczaln¹ a kontroln¹ (p £ 0,01); B ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy poszczególnymi pobraniami a dniem 70. (p £ 0,01)
Ryc. 6. Surowiczy poziom TNF-a w krwi obwodowej u króli-ków z przewlek³¹ trychofitoz¹ (x ± SD)
rej myszy bez grasicy nie by³y w stanie siê pozbyæ, autorzy t³umacz¹ brakiem odpornoci komórkowej zale¿nej od grasicy. Rolê grasicy w odpornoci prze-ciwgrzybiczej potwierdzili autorzy w badaniach na szczurach (7). Wykazali oni, ¿e zwierzêta z wrodzo-nym brakiem grasicy w odró¿nieniu od normalnych szczurów zaka¿onych T. mentagrophytes nie by³y w stanie zahamowaæ rozprzestrzeniania siê infekcji, co prowadzi³o do rozwoju infekcji chronicznej. Po-nadto u zwierz¹t tych nie stwierdzono pozytywnych reakcji na trychofitynê w tecie skórnym oraz charak-terystycznej intensywnej infiltracji komórek jedno-j¹drzastych w chorobowo zmienionej skórze. Kolejne badania wykonane przez autorów na szczurach po-twierdzi³y zasadnicz¹ rolê grasicy i funkcjonalnych limfocytów T w odpornoci przeciwgrzybiczej (8). Natomiast Kostro i wsp. (13) stwierdzili, ¿e u króli-ków z przewlek³¹ trychofitoz¹ wystêpuje silnie zazna-czona supresja komórkowych mechanizmów odpor-noci nieswoistej, manifestuj¹ca siê istotnym spadkiem aktywnoci fagocytarnej i metabolizmu tlenowego gra-nulocytów krwi obwodowej.
W odpowiedzi immunologicznej na infekcje wywo-³ane dermatofitami rolê komórek regulatorowych pe³-ni¹ limfocyty pomocniczo/indukuj¹ce TCD4+ i
supre-sorowo/cytotoksyczne TCD8+, a ich wzajemna
propor-cja warunkuje okrelony profil indukowanej odpowie-dzi immunologicznej (11, 12, 17). Zastosowana w ba-daniach w³asnych metoda cytometrii przep³ywowej umo¿liwi³a przeledzenie zachowania siê subpopula-cji limfocytów T i B w krwi obwodowej u królików z przewlek³¹ grzybic¹ skórn¹ wywo³an¹ przez T. men-tagrophytes. Stwierdzono istotny wzrost odsetka lim-focytów CD4+ i CD8+ w odniesieniu do wartoci
wyj-ciowych i grupy kontrolnej, przy jednoczesnym zabu-rzeniu ich wzajemnej proporcji na korzyæ limfocy-tów CD8+. Wskazuje to na wystêpowanie supresji
odpowiedzi immunologicznej typu komórkowego, która jest zwi¹zana z istotnym wzrostem odsetka lim-focytów TCD8 supresorowych, odpowiedzialnych za immunoregulacjê funkcji efektorowych komórek im-munologicznie kompetentnych u królików z przewlek-³ym zaka¿eniem T. mentagrophytes. Dane te znajduj¹ potwierdzenie w wynikach uzyskanych przez innych autorów. Brahmi i wsp. (1), badaj¹c odpowied typu komórkowego u ludzi z grzybic¹ przewlek³¹, wykali jej obni¿enie w tecie transformacji blastycznej, za-hamowania migracji makrofagów oraz w odczynie nad-wra¿liwoci opónionej. Obserwowany brak komór-kowej odpowiedzi immunologicznej autorzy t³umacz¹ nieodpowiednim stosunkiem limfocytów Th do lim-focytów supresorowych Ts. Wed³ug Calderona (2), der-matofitoza przewlek³a rozwija siê w wyniku hypore-aktywnoci komórek immunokompetentnych lub na-stêpuje po modulacji odpowiedzi immunologicznej przez limfocyty T supresyjne lub czynniki humoralne, takie jak specyficzny antygen i/lub przeciwcia³o. Stwierdzony w badaniach w³asnych zaburzony
stosu-nek limfocytów TCD4+ do TCD8+ u królików z
prze-wlek³¹ trychofitoz¹ mo¿e byæ efektem uwalniania czynników immunosupresyjnych podczas infekcji T. mentagrophytes, które hamuj¹ reakcje odpornocio-we organizmu (3-5).
Centraln¹ rolê w immunoregulacji odgrywaj¹ lim-focyty pomocnicze ThCD4+, które w odpowiedzi na
antygen grzybiczy ró¿nicuj¹ siê w kierunku profilu Th1 wytwarzaj¹cego IL-2, IL-12, TNF-a, IFN-g lub profi-lu Th2 produkuj¹cego IL-4, IL-5, IL-10 i IL-13. Obie subpopulacje limfocytów Th posiadaj¹ powierzchnio-we cz¹steczki CD4 i rozpoznaj¹ antygen prezentowa-ny w po³¹czeniu z cz¹steczkami MHC II klasy. Nato-miast profile cytokin uwalnianych przez komórki Th1 i Th2 dzia³aj¹ wobec siebie antagonistycznie. St¹d te¿ subpopulacja limfocytów Th1 decyduje o rozwoju pro-tekcyjnej odpornoci przeciwgrzybiczej (komórkowej) oraz dziêki produkcji i uwalnianiu IL-2 i IFN-g jest zaanga¿owana w odczynach nadwra¿liwoci opónio-nej DTH, aktywacji makrofagów i proliferacji keraty-nocytów. Z kolei subpopulacja limfocytów Th2 pro-dukuj¹c cytokiny stymuluj¹ce proliferacjê limfocytów B, syntezê i sekrecjê przeciwcia³, przyczynia siê do rozwoju przewlek³ej postaci grzybicy skórnej oraz jest przyczyn¹ hamowania protekcyjnej odpornoci prze-ciwgrzybiczej uwarunkowej przez limfocyty Th1 (2, 10, 15, 16). Fakt ten znajduje potwierdzenie w wyni-kach uzyskanych u królików z przewlek³¹ grzybic¹ skórn¹. Prawdopodobnie sta³a ekspozycja komórek prezentuj¹cych APC (Antigen Presenting Cell) na wysokie stê¿enie polisacharydów uwalnianych ze cia-ny komórkowej T. mentagrophytes u królików z chro-niczn¹ trychofitoz¹ powoduje zmianê profilu immu-nologicznego w kierunku komórek Th2 i zwiêkszon¹ przez te komórki produkcjê IL-10, jako czynnika wzrostu limfocytów B oraz jej hamuj¹cego wp³ywu na produkcjê cytokin przez limfocyty Th1. Warto pod-kreliæ, ¿e u królików z przewlek³¹ grzybic¹ skórn¹ rednie wartoci odsetka limfocytów BCD19 by³y istot-nie wy¿sze ni¿ w kontroli w toku ca³ej obserwacji. Wy-sokie stê¿enia IL-10 mog¹ prowadziæ równie¿ do gene-racji anergicznych limfocytów TCD4+ i CD8+, które
indukuj¹ antygenowo swoist¹ immunosupresjê (10, 19). Oprócz komórek prezentuj¹cych APC i limfocytów Th, istotn¹ rolê w indukcji i regulacji odpowiedzi im-munologicznej przeciwko dermatofitom odgrywaj¹ odpowiednie cytokiny, uwalniane po uprzedniej sty-mulacji antygenowej. Ich rola polega zarówno na wzmocnieniu prezentacji antygenów grzybiczych (IFN-g i IL-12), jak i na stymulacji okrelonej subpo-pulacji limfocytów T (IL-2, IL-4, IL-10 i IFN-g). In-terferon gamma uwalniany przez limfocyty Th1 ha-muje proliferacjê i czynnoæ limfocytów Th2, podczas gdy IL-4 i IL-10 wytwarzane przez komórki Th2 ha-muj¹ produkcjê cytokin przez limfocyty Th1 (10, 12). W badaniach w³asnych profil odpowiedzi immunolo-gicznej u królików z przewlek³¹ trychofitoz¹ okrelo-no m.in. w oparciu o kszta³towanie siê surowiczego
poziomu IL-10 i TNF-a jako dwóch dzia³aj¹cych wo-bec siebie antagonistycznie cytokin. Stwierdzono, ¿e u królików z przewlek³¹ infekcj¹ T. mentagrophytes rednie wartoci IL-10 by³y istotnie wy¿sze od war-toci wyjciowych oraz kontroli, co potwierdza domi-nacjê profilu immunologicznego typu Th2. Prawdo-podobnie zwiêkszona produkcja IL-10 przez komórki Th2 u królików z przewlek³¹ trychofitoz¹ odgrywa klu-czow¹ rolê w regulacji odpowiedzi immunologicznej polegaj¹cej na ograniczaniu procesów zapalnych i wspomaganiu humoralnej odpowiedzi immunolo-gicznej, przy jednoczesnym hamowaniu produkcji cy-tokin typu Th1. Uzyskane dane pozwalaj¹ s¹dziæ, i¿ u królików z przewlek³¹ infekcj¹ T. mentagrophytes stale zwiêkszona produkcja IL-10 przez limfocyty Th2 mog³a byæ przyczyn¹ hamowania zdolnoci do prezen-tacji antygenu przez monocyty/makrofagi, komórki Langerhansa i skórne komórki dendrytyczne zmniej-szaj¹c ekspresjê antygenów MHC klasy II na ich po-wierzchni. Ponadto wynikaj¹cy z funkcji biologicznych hamuj¹cy wp³yw IL-10 na powstawanie limfocytów Th1 pobudzonych przez antygen wywiera³ niekorzyst-ny wp³yw na rozwój swoistej odpornoci komórko-wej, która odgrywa zasadnicz¹ rolê w likwidacji czyn-nego procesu chorobowego wywo³aczyn-nego dermatofita-mi (12, 14).
Badania w³asne wykaza³y, ¿e rednie wartoci TNF-a u królików z grupy dowiadczalnej kszta³towa³y siê na poziomie zbli¿onym do kontroli, co odzwierciedla natê¿enie procesów zapalnych wywo³anych przewlek-³¹ infekcj¹ T. mentagrophytes. £agodny stan zapalny w chorobowo zmienionej skórze u królików z grzybi-c¹ przewlek³¹ pozwala s¹dziæ, ¿e odpornoæ komór-kowa odgrywa niewielkie znaczenie w zaka¿eniach chronicznych. Nie mo¿na równie¿ wykluczyæ, ¿e u kró-lików z przewlek³¹ trychofitoz¹ utrzymywanie siê red-nich wartoci TNF-a na stale niskim poziomie jest zwi¹zane z wa¿n¹ rol¹ tej cytokiny w regulacji odpo-wiedzi zapalnej i immunologicznej. Niskie stê¿enia TNF-a zwiêkszaj¹, natomiast wysokie hamuj¹ odpo-wied immunologiczn¹ po stymulacji antygenami za-le¿nymi od limfocytów T (17, 19). W odpornoci skie-rowanej przeciwko zaka¿eniom wywo³anym przez dermatofity TNF-a wraz z IFN-g wywiera zasadniczy wp³yw na syntezê i uwalnianie innych cytokin, któ-rych wzajemne oddzia³ywanie okrela zdolnoæ me-chanizmów obronnych gospodarza, co ma du¿e zna-czenie dla przebiegu dermatofitozy i rozwoju swoistej komórkowej odpornoci przeciwgrzybiczej niezbêd-nej do usuniêcia grzyba z powierzchni skóry i do wy-leczenia.
Pimiennictwo
1.Brahmi Z., Liautaund B., Marill F.: Depressed cell mediated immunity in chronic dermatophytic infectious. Ann. Immunol. (Inst. Pasteur) 1980, 131C, 143-153.
2.Calderon R. A.: Immunoregulation of dermatophytosis. Critical Rev. Micro-biol. 1989, 16, 339-368.
3.Dahl M. V.: Suppression of immunity and inflammation by products produ-ced by dermatophytes. J. Am. Acad. Dermatol. 1993, 28, 19-23.
4.Grando S. A., Herron M. J., Dahl M. V.: Binding and uptake of Trichophyton rubrum mannan by human epidermal keratinocytes: a time course study. Acta Dermatol. Venerol. 1992, 72, 273-276.
5.Grando S. A., Hostager B. S., Herron M. J.: Binding of Trichophyton ru-brum mannan to human monocytes in vitro. J. Invest. Dermatol. 1992, 98, 876-880.
6.Green F., Lee K. W., Balish E.: Chronic T. mentagrophytes dermatophytosis of guinea pigs skin grafts on nude mice. J. Invest. Dermatol. 1982, 79, 125--129.
7.Green F., Webber J. K., Balish E.: The thymus dependency of acquired resi-stance to Trichophyton mentagrophytes dermatophytosis in rats. J. Invest. Dermatol. 1983, 81, 31-38.
8.Green F., Webber J. K., Balish E.: Acquired immunity to Trichophyton men-tagrophytes in thymus-grafted or peritoneal exudates cell-injected nude rats. I. Invest. Dermatol. 1987, 88, 345-349.
9.Honbo S., Jones H. J., Artis W. M.: Chronic dermatophyte infection: eva-luation of the Ig class-specific antibody response reactive with polysacchari-de and peptipolysacchari-de antigens polysacchari-derived from Trichophyton mentagrophytes. J. In-vest. Dermatol. 1984, 82, 287-290.
10.Hryncewicz-Gwód A., Baran E., Plomer-Niezgoda E., Czarnecka A.: Wy-dzielanie wybranych cytokin przez leukocyty chorych z przewlek³¹ grzybic¹ stóp i osób zdrowych pod wp³ywem ekstraktów grzybni T. rubrum i T. men-tagrophytes. Mikol. Lek. 1999, 6, 85-92.
11.Koga T.: Immune response in dermatophytosis. Jpn. J. Med. Mycol. 2003, 44, 270-275.
12.Kostro K., Gliñski Z., Wojcicka-Lorenowicz K.: Odczyny immunologiczne w grzybicach skórnych zwierz¹t. Medycyna Wet. 2001, 57, 709-714. 13.Kostro K., Wojcicka-Lorenowicz K., Leniewska K., Madany J.,
Majer-Dzie-dzic B.: Cytometryczna ocena aktywnoci fagocytarnej i metabolizmu tleno-wego granulocytów krwi obwodowej królików z przewlek³¹ trichofitoz¹. Medycyna Wet. 2006, w druku.
14.£¹cki J. K., Wiktorowicz K. E.: Biologiczne w³aciwoci interleukiny 10. Post. Hig. Med. Dow. 1994, 48, 363-370.
15.Murphy J. W., Bistoni F., Deepe G. S., Blackstock R. A., Buchanan K., Ash-man R. B., RoAsh-mani L., Mencacci A., Cenci E., Fe DOstani C., Del Sero G., Calich V. L. G., Kashino S. S.: Type 1 and type 2 cytokines: from basic scien-ce to fungal infections. Med. Mycol. 36, suppl. 1998, 1, 109-118. 16.Romagnani S.: Type 1 T helper and type 2 T helper cells: functions,
regula-tion and role in protecregula-tion and disease. Int. J. Clin. Lab. Res. 1991, 21, 152--159.
17.Romani L.: The T cell response against fungal infections. Curr. Opinion Im-munol. 1997, 9, 484-490.
18.Romani L.: Immunity to fungal infections. Nature Rev. Immunol. 2004, 4, 11-24.
19.Slunt J. B., Taketomi E. A., Woodfolk J. A., Hayden M. L., Platts-Mills T. A. E.: The immune response to Trichophyton tonsurans. Distinct cell cytokine pro-files to a single protein among subjects with immediate and delayed hyper-sensitivity. J. Immunol. 1996, 157, 5192-5197.
Adres autora: prof. dr hab. Krzysztof Kostro, ul. Sikorskiego 3/81, 20-814 Lublin
