C opyright 1945 b y : Schweizerische chemische Gesellschaft, Basel — Société suisse de Chimie, Bâle — Società svizzera di chimica, Basilea.
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138. Über d en E influss vo n L ö su n g sm itte l und T em peratur a u f d ie S tä r k e v o n A m in osäu ren
von T hor J. G. L ö n n in g und W . D. T r e a d w e ll.
(14. V II. 45)
Die S äurev erstärk u n g , welche der F o rm o ltitra tio n nach Soeren- sen zugrunde liegt, scheint n ich t au f der B ildung einer S c h iff sehen Base im Sinne der G leichung:
'OCOCH2-NH3- + OCH2 > h 2o + h o c o c h 2 n = c h 2
zu beruhen, sondern au f einer A nlagerung der Enolform des F o rm a l
dehyds (H C O H )= an die A m inogruppe, wie Levy u nd Silberm ann1), Balson u n d Law son2) u n d T o m iy a m a 3) gezeigt haben. W ahrschein
lich wird zun ächst das en tsprechende H y d ra t angelagert, w orauf dann insbesondere die folgenden beiden A nlagerungsprodukte leicht gebildet w erden k ö n n ten :
OH H OH
H C -O H --N -C H 2COOH > HC N H CH2COOH und (H 2COH)2N C H 2COOH
i h: h:
Wadsworth u n d Pangborn4) bewiesen durch F ällu n g m it D im edon den sehr langsam en V erlauf der B ildung von S c h iff scher Base. D urch Versuche aus unserem L ab o rato riu m sind diese Ergebnisse für v e r
dünnte Lösungen w eiter erg änzt u n d g e stü tz t w ord en5).
Es schien n u n in te ressa n t, neben F o rm aldeh yd auch noch andere Zusätze m it reaktionsfähigem Sauerstoff- resp. H y d ro x y l bezüglich ihrer F äh ig k eit zur B eeinflussung der D issoziation der A m inosäuren zu prüfen.
In der vorliegenden A rb eit w urde die Beeinflussung der A cid ität von verd ü n n ten wässrigen A m inosäurelösungen du rch A ceton, P ro pionaldehyd und Ä thylalkohol u n te rsu c h t. Bei der lockeren A n
lagerung des F o rm aldehyds an die in w ässriger Lösung vorliegenden Aminosäuren w ar eine besonders em pfindliche T em p eratu rab h än g ig keit der resultierenden S äu rev erstärk u n g zu erw arten. E s w urde daher versucht, die T em p eratu rab h än g ig k eit der p H-W erte einiger Aminosäuren in F o rm ald ehyd sorgfältig zu bestim m en.
Zur A usführung der T itra tio n e n in G egenw art von A ldehyden und Alkoholen ist die V erw endung der G l a s e l e k t r o d e unerlässlich.
!) J . Biol. Ch. 118, 737 (1937).
2) Biochem. Z. 30, 1257 (1936).
3) J . Biol. Ch. I I I , 51 (1935).
4) J . Biol. Ch. 116, 423 (1936).
5) Vgl. H elv. 28, 945 (1945); J . Bergsland, Diss. E .T .H . (1944).
67
Diese w urde n ach den A ngaben von M a c ln n e s u n d Dole1) u n d nach den von J . B ergsland2) g em ach ten E rfa h ru n g e n hergestellt.
V erw endet w urde C o r n in g 0 1 5 - G la s von der Zusam m ensetzung 7 ,2 g S i0 2, 0.6 g CaO un d 3,8 g N a2C 0 3. K leine Stückchen dieses Glases w urden an die E nden von G lasröhren aus gewöhnlichem Biegeglas angeschm olzen un d zu K ugeln von 0,5—2 cm D urchm esser aufgeblasen. E s em pfiehlt sich, bei dieser O peration rasch u n d in der Sauer
stofflam m e zu arbeiten, um eine Verm ischung der beiden G lassorten zu vermeiden.
E s h a t sich als sehr zweckmässig erwiesen, die E lektrode m it einer Pufferlösung zu füllen, in der m an etw as A gar-A gar gelatinieren lässt, um der M em bran vermehrte F estigkeit zu verleihen. D urch kleine E rw eiterungen in dem R ohr der E lektrode, wenig oberhalb der M em bran, w ird der A gar-A garsäule d er nötige H a lt im R o h r erteilt.
Zur T itra tio n der A m inosäuren w urde ste ts sorgfältig gereinigte c a r b o n a t f r e i e L a u g e v erw en d et, welche n ach V orschrift von 1. M . K o lth o ff3) aus „Ö llauge“ herg estellt u n d durch T itra tio n mit der G laselektrode gegen rein ste O xalsäure eingestellt w urde. Die A ufbew ahrung erfolgte in Je n ae r-F la sc h en u n te r peinlichstem Ab
schluss gegen K ohlensäure.
F ü r die E ich u n g d er E le k tro d en dien ten die folgenden P u f f e r l ö s u n g e n :
1. 0,1-n. H Cl m it 0,1-m. G lykokoll in 0,1-n. N aCl nach Sörensen.
pH -Bereich 1,04— 3,68. V erw endeter P u ffer: p H 3,34.
2. 0,2-m. Essigsäure m it 0,2-m. N a triu m acetat nach Walpole.
p H -Bereich 3,6—5,6. V erw endeter P uffer: pH 4,60.
3. 1/15-m. K H 2P 0 4 m it 1/15-m. N a2H P 0 4 • 2 H 20 n ach Sörensen.
P g-B ereich 5,59— 8,04. V erw endeter P uffer: pH 5,91, pH 7,73.
4. 0,05-m. Soda m it 0,05-m. B orax n ach Kolthoff.
pH -Bereich 9,2— 11,0. V erw endeter P uffer: pH 10,00.
D ie v erw end eten A m i n o s ä u r e n w aren P r ä p a r a te der Firma F . H o ffm an n-L a Roche & Co. A .G ., B asel4). Ih re K o n tro lle wurde du rch M ikroanalyse, K jeld ah l-B estim m ungen, sowie du rch Formol- titra tio n vorgenom m en u n d ergab, dass die verw en deten Produkte an aly sen rein w aren.
I. T i t r a t i o n v o n G l y k o k o l l i n A c e t o n .
Z ur B estim m u ng d er D isso ziatio n sk o n stan ten von Glykokoll in A ceton w ar rein stes säurefreies A ceton erforderlich, das in folgender W eise h erg estellt w u rd e:
Reines käufliches A ceton w urde zunächst 1 S tunde m it P erm an g an at gekocht, um es von reduzierenden V erunreinigungen zu befreien, d an n w urde abdestilliert, hierauf über K alk gekocht, um vorhandene Säure u n d W asser zu binden. Eine weitere Destillation lieferte d a n n das gew ünschte reine P ro d u k t.
20 cm 3 des auf diese Weise hergestellten A cetons w urden m it 22 cm 3 W asser ver
setzt u nd hierauf m it 0,1-n. N aO H (f = 1,084) bei 16° C m it der G laselektrcde titriert.
h Am. Soc. 52, 29 (1930).
2) Diss. E .T .H . (1944).
3) M assanalyse I I . Teil, 2. Aufl. 80 (1931).
4) W ir m öchten der F irm a F. H offm ann-La Roche & Co., A.G., B asel, auch an dieser Stelle fü r die Ü berlassung der A m inosäurepräparate unsern besten D ank aus
sprechen.
—
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—Fig. 1, A, zeigt die erhaltene K urve, aus der zu ersehen ist, dass das Aceton keine Spur von freier Säure e n th ält.
M it steigender A lk a litä t ist indessen eine zunehm ende B indung von H y d ro x y lion zu erkennen, welche wohl von der Enolisierung des A cetons h e rriih rt. Schon bei p H= 9 a n ist dieser E ffek t m erklich und m uss bei E n d p u n k te n , die noch w eiter im alkalischen Gebiet liegen, du rch eine entsprechende K o rre k tu r b erück sichtig t w erden.
Das ist z. B. bei der T itra tio n des G lykokolls in A ceton der F all, da hier der E n d p u n k t erst bei p H = 11,44 a u ftr itt, wie aus der K urve B in Fig. 1 zu ersehen ist.
cm3 0,1-n. N a O H (f)
Fig. 1.
Zur O rientierung ü b er den V erlauf der T itratio n sk u rv e sei der pH-W ert bei hälftig er T itra tio n angegeben, der die konventionelle D issoziationskonstante p K resp ek tiv e k s b estim m t. D ie p H-W erte am Anfang u nd am E n de der T itra tio n p H (A) u n d p H (E) können leicht aus der K u rv e abgelesen w erden.
Fig. 1, K urve A, zeigt die T itratio n von 42 cm 3 47,7 Vol.proz. Aceton m it 0,1 -n. N aOH (f = 1,084) bei 16° C. K urve B ist die entsprechende T itratio n von 42 cm 3 0,00447-m.
Glykokoll in 47,7 Vol.proz. Aceton m it 0,1-n. N aO H (f = 1,084) bei 16° C.
E n d p u n k t gef. = 2,122 cm 3 0,1-n. N aO H
Sollwert = 2,00 ,, ,, ,,
p K (halbe Titr.) = 10
k g = 1,00 X 1 0 -10 (16° C)
Der W endepunkt am Ende der T itration liegt bei pH = 11,44. A ceton verbraucht bei diesem pH -W erte 0,1084 cm 3 0,1-n. N aOH . W enn m an diese K o rrek tu r von dem ge
fundenen W ert, 2,122 cm 3 0,1-n. N aO H , abzieht, bekom m t m an einen L augeverbrauch von 2,014 cm 3 0,1-n. N aOH , was m it dem Sollwert von 2,00 cm 3 sehr g u t übereinstim m t.
Bei T itra tio n von Glykokoll in w ässriger Lösung fin d et m an
pK = 9,74 u n d den P o ten tialsp ru n g des E n d p u n k tes bei p H = 10,97,
also ganz ähnliche W e rte wie bei der L a u g e titra tio n von Glykokoll in A ceton. E s sch ein t sich h ier die Säureschw ächung du rch das L ö su n g sm ittel u n d die B eeinflussung der A m inogruppe durch das A ceton p ra k tisc h aufzuheben. Es ist d ah er auch du rch hohe A ceton
k o n z e n tra tio n e n eine S ä u rev e rstä rk u n g des Glykokolls gegenüber w ässriger Lösung n ic h t erzielbar, wie die folgenden beiden B estim m ungen zeigen:
j W asser = 9,74
pK von G lykokoll in , 47,7 Vol. proz. A ceton = 10,00
72 „ „ „ = 9,99
I I . T i t r a t i o n v o n G l y k o k o l l i n P r o p i o n a l d e h y d l ö s u n g . Es schien v o n In te resse , zu prüfen , ob auch noch m it P ropion
ald e h y d eine dem F o rm a ld e h y d analoge S ä u rev e rstä rk u n g von Am ino
säu ren b e w irk t w erden k a n n . D azu w ar die H erstellu n g von reinem, vollkom m en säurefreien P ro p io n ald eh y d erforderlich.
Es h a t sich gezeigt, dass infolge d er sehr leich t erfolgenden Dis
p ro p o rtio n ie ru n g des P ro p io n ald eh y d s die H erstellu n g der säurefreien rein en L ösung noch h eik ler ist als beim F o rm ald eh y d . D ie O xydier
b a rk e it d u rch den L u ftsau ersto ff spielt neben der N eigung zur Dis
p ro p o rtio n ie ru n g in A lkohol u n d Säure eine u n terg e o rd n e te Bolle.
D a der technische Propionaldehyd wegen seines Säuregehaltes nich t verwendbar ist, w urde die R eindarstellung n ach W. L. M c Ewen u n d W . H. Carothers1) durch Zu
tropfen einer Lösung von K alium dichrom at in w ässriger Schwefelsäure zu Propylalkohol versucht.
Die R eaktion w urde in einem D reihalskolben ausgeführt, der m it Tropftrichter, R ührw erk u n d R ückflusskühler versehen w ar. D er u n te r 45° eingesetzte Rückflusskühler w urde m it W asser auf einer T em peratur von 60° gehalten. An diesen K ühler war ein zw eiter absteigender K ühler angeschlossen, durch welchen Eisw asser geleitet wurde. Am u n te rn E nde desselben w ar noch eine m it Eisw asser gekühlte Spiralvorlage angeschlossen, in welcher der übergehende Propionaldehyd aufgefangen w urde. Die Dichrom atlösung w urde in Zeit von 30 M inuten zugesetzt. Die A usbeute an A ldehyd h ä n g t stark von d er Leistung des R ü h rers ab. D er erhaltene P ropionaldehyd w urde über wasserfreiem N atriu m su lfat g etrocknet u n d in einem m it Eisw asser gekühlten Widmer-Kolben frak
tio n iert. Die bei 46,5—47,5° übergehende F ra k tio n b esteh t aus reinem Propionaldehyd.
Z ur K ontrolle w urde der B rechungsindex bestim m t, welcher bei 19° C 1,365 betrug, was bis zur d ritte n Dezimale m it dem in der L ite ra tu r angegebenen W ert übereinstim m t.
Bei der T itratio n m it der G laselektrode k o n n ten aber im m er noch m erkliche Mengen von Säure in der wässrigen Lösung des A ldehyds festgestellt w erden. E s wurde daher v ersucht, diese n ach folgenden M ethoden abzutrennen:
D a durch Ü berleiten von dam pfförm igem P ropionaldehyd über Calciumoxyd, das a u f 60° gehalten w urde, der A ldehyd nich t vollständig von Säure befreit w urde, wurde v ersucht, der w ässrigen Lösung des Propionaldehyds die vorhandenen Spuren Säure d urch S chütteln m it H ydrogencarbonat zu entziehen. H ierauf wurde der A ldehyd in Benzol aufgenom m en u nd d an n durch fraktionierte D estillation aus der Benzolschicht ab g etren n t. D er übergehende A ldehyd w ar nun frei von Säure, en th ielt aber noch m erk
liche Mengen von Benzol.
J) O rganic Synthesis XII, 64 (1932).
In einigen w eitern Versuchen wurde der Propionaldehyd kontinuierlich in kochende Kalkmilch eintropfen gelassen und gleichzeitig abdestilliert. Trotz der kurzen B erüh
rungszeit m it der K alkm ilch tr a t merkliche Polym erisation und spurenweise D ispropor
tionierung ein, so dass bei der elektrom etrischen T itration ein Säuregehalt des A ldehyds erkennbar w urde. E s gelang dan n aber schliesslich, den A ldehyd aus der m it K alkw asser versetzten Lösung in schonender Weise abzudestillieren, so dass ein säurefreies D estillat erhalten wurde. Zu dem Zwecke w urden 10 cm 3 des nach dem eingangs erw ähnten V er
fahren hergestellten konzentrierten Propionaldehyds m it gesättigter K alkm ilch bis zur schwach alkalischen R eaktion versetzt und hierauf, vorsichtig bei gewöhnlichem D ruck destilliert. Die bis 85° C übergehende F rak tio n w urde aufgefangen und in einem kleinen fFwfmer-Kölbchen von 20 cm 3 und einer Rektifizierkolonne von 14 cm w eiterfraktioniert.
Hierbei gingen 4 cm 3 reiner A ldehyd bei 46,5— 47,5° C über, aus welchen nun eine 10-proz.
wässrige Lösung hergestellt w urde. Die nächsten 2 cm 3 gingen bereits in dem weiten Tem peraturintervall von 47,5— 135° C über und enthielten wohl schon merkliche Mengen von M ethyl-äthyl-acrolein, Sdp. 758>6 mm = 137,3° C (korr.) ’), das nach Hoppe*) leicht beim Erhitzen von Propionaldehyd en tsteh t.
B e s t i m m u n g v o n P r o p i o n a l d e h y d : D as K o n d en satio n s
produkt von P rop ion aldeh y d m it D im edon n ach der Gleichung:
0
I c2h5 h
, NüH 2 2 5\ 0 /
/ \ A 0 A
konnte in 80-proz. Alkohol scharf m it Lauge titr ie r t werden, wobei die phenolische G ruppe n eu tra lisie rt wird.
Trotzdem eignet sich die D imedonm ethode nicht zur Bestim m ung von Propionalde
hyd in verdünnter Lösung. N ach D. Vorländer3) ist die R eaktion erst nach 6 Stunden beendigt. Es wurde gefunden, dass 5 mg Propionaldehyd in 5 cm 3 W asser m it 25 cm 3 gesättigter Dimedonlösung (ca. 0,4 g D imedon in 100 cm 3 Wasser) nach 12 Stunden noch nicht q u an titativ um gesetzt war. Selbst nach weiterem 2-tägigem W arten fiel nichts mehr aus. Der Niederschlag w urde abfiltriert, in wenig Ä thanol gelöst und dann nach Zusatz von etw as W asser (zur Schonung der Elektrode) m it der Glaselektrode u n ter V er
wendung von 0,1-n. N aO H aus einer M ikrobürette titrie rt. H ierbei w urden n u r 73,8%
des Sollwertes gefunden. Die restlichen 26,2% des Propionaldehyds waren also selbst nach 2-tägiger W artezeit noch nich t ausgefallen.
Als zuverlässigste M ethode erw eist sich die argentom etrische, wobei der A ldehyd m it einem Ü berschuss von Silberoxyd in schwach alkalischer Lösung zur Säure o xy d iert wird. D urch Z urückm essen des u n v erb ra u c h te n Silberoxyds k a n n die Menge des oxydierten Aldehyds genau e rm itte lt w erden.
In der R eihe der aliph atisch en A ldehyde n im m t die R e a k tio n s
geschwindigkeit m it w achsender Länge der K ohlenstoff k e tte ab.
Es ist dah er w ichtig, die O xyd atio n bei op tim aler A lk a litä t v o rzu nehmen. Stepp u n d F ricke4) verw enden zur O xydation des P ro p io n aldehyds Silberdiam m inoxyd in einer Lösung m it m öglichst kleinem A m m oniaküberschuss. E in grösserer A m m oniakgehalt verschieb t das
b Liehen un d Zeisel, M. 4, 16 (1883).
2) M. 9, 637 (1888). 3) Z. anal. Ch. 77, 241 (1929).
*) Z. physikal. Ch. 116, 293 (1921); 118, 241 (1922).
—
1061
—O x y d a tio n sp o te n tial der Silberlösung so s ta rk n ach d er negativen Seite, dass d a m it keine v ollständige O x y d atio n des A ldehyds mehr erzielt w erden k a n n . Stepp u n d Fricke verm ieden die Anw endung einer a lk a lih y d ro x y d h a ltig e n Lösung, weil sie b e fü rc h te ten , dass eine solche zu m erklicher D isp ro p o rtio n ieru n g des A ldehyds in Alkohol u n d Säure n ach Cannizzaro A nlass geben k ö n n te. N u n h a t ab e r Ponn- dorf gezeigt, dass diese G efahr n u r bei h öh erer A ldehydkonzentration b e s te h t u n d dass die O x y d atio n v o n v e rd ü n n te m A ldehyd beim E r w ärm en m it S ilberoxyd bei m assiger A lk alih y dro xy dk on zen tration rasch u n d q u a n tita tiv v o n s ta tte n geht.
In der e rk a lte te n Lösung w ird das u n v e rb ra u c h te Silberoxyd d u rch vorsichtiges A n säu ern m it Schw efelsäure gelöst u n d dann sofort m it einem Ü berschuss von 0,1-n. K J u m gesetzt. I n einer a liq u o te n Menge des F iltra te s w ird n u n das im Ü berschuss v o rh an d ene K J m it 0,002-n. A g N 0 3 zurückgem essen, w oraus der Ver
b rau c h an S ilb e rn itra t fü r die O x y d atio n des A ldehyds bestim m t w erden k a n n . 1 c m 3 0,1-n. A g N 0 3 zeigt 2,903 m g P rop io n ald eh y d an.
Z u r A usführung der O xydation w urden 10 cm 3 einer ca. 0,4-proz. Lösung von Pro
pionaldehyd in einem Messkolben von 50 cm 3 m it 15 cm 3 0,1-n. A g N 0 3 verm ischt und bei dauerndem S ch ü tteln allm ählich auf ca. 70° C erw ärm t. H ierbei w urde der Lösung allm ählich 10,5 cm 3 0,2-n. A lkali zugefügt u n d zum Schluss, nachdem die Hauptmenge des A ldehyds schon oxydiert w ar, noch 2 cm 3 50-proz. K alilauge.
N ach dem A bkühlen w urde die Lösung m it 50-proz. Schwefelsäure schwach an
g esäuert, d an n m it 15 cm 3 0,1-n. K J v ersetzt u n d m it W asser auf 50 cm 3 v erdünnt. In 40 cm 3 des F iltra te s w urde der Ü berschuss des K alium jodids m it S ilb ern itrat zurück
titrie rt. M it dieser A rbeitsweise w urden befriedigende R esu ltate erhalten.
cm3 0,1-n. N a O H ( f )
Fig. 2.
T itra tio n von 20 cm 3 0,01-m . Glykokoll in 10 Vol.proz.
P ropionaldehyd m it 0,1-n. N aO H bei 19° C.
Fig. 2 zeigt die T itra tio n von 20 cm 3 0,01-m. G lykokoll in ijism 10 Yol.proz. P ro p io n ald eh y d m it 0,1-n. N aO H bei 39° C, wobei der
besseren Ü b ersich t wegen n u r einige der sehr zahlreich aufgenom - menen M esspunkte eingetragen sind. Die T itra tio n lässt keine Spur 111«: eines Säuregehaltes des Lösungsm ittels erkennen. D er E n d p u n k t
stim m t m it dem Sollw ert genau ü b erein :
~iF- ’ E n d p u n k t gef. = 2,00 cm 3 0,1-n. N aOH Sollwert = 2,00 ,, ,, ,,
ffiUtlt p K (halbe T itr.) = 9,14
k3 = 7,25 X l 0 - 10 (19° C)
älter Gegenüber der wässrigen Lösung (pK = 9,71) ist in Propion- mlfe aldehyd n u r eine ganz geringfügige Säure V erstärkung festzustellen, t. In ü Die T itra tio n von G lykokoll in einer dem angew andten Propion- usswk aldehyd äq uiv alen ten Lösung von F o rm ald eh yd (10 Yol.proz. Pro- isder 1 pionaldehyd e n tsp ric h t 5,2 Vol.proz. F orm aldehyd) findet m an einen istefc p K-W ert von 6,59 gegenüber 9,11 in P ropionaldehyd.
I I I . T i t r a t i o n e n u n d p K- B e s t i m m u n g e n v o n A m i n o s ä u r e n ramki in w ä s . s r i g - a l k o h o l i s c h e r L ö s u n g u n d i n d e m t e r n ä r e n
riefele
S y s t e m v o n W a s s e r - A l k o h o l - F o r m a l d e h y d .
Ü ber den Einfluss von A lkohol au f die A c id itä t von A m ino
säuren liegen bereits zahlreiche A rb eiten vor. Zur B estim m ung der i'vait; scheinbaren D issoziationskonstanten in alkoholhaltigen Lösungen be- miiiilir. nützten u. a. H a rris1) u n d M artens2) die In d ik ato rm eth o d e. Diese
—
1063
—Autoren fanden, dass der Alkohol sich im Sinne einer E rh ö h u n g des pK-W ertes au sw irkt. N ach den von M ichaelis und M izu ta n i3) d u rc h geführten U ntersuchungen m it der W asserstoffelektrode b eru h t n un aber der erw ähnte E ffek t des Alkohols n u r zum kleinen Teil auf einer Veränderung der D issoziationsverhältnisse der A m inosäure. W eit b e deutender ist die gleichzeitig ein treten d e V eränderung im U m schlags
gebiet des In d ik a to rs. Dies w ird u. a. von K olthoff4), K ä m m et5), N e u berger6) und von Juhes u n d Schm idt7) b e stä tig t. P . M . Richardsons) diskutiert u. a. den Einfluss von A lkohol bei der T itra tio n von A m ino
säuren im L ichte der Z w itterionenhypothese.
D a die E instellu ng der P o te n tiale m it der W asserstoffelektrode in alkoholischen u n d fo rm aldehydhaltigen Lösungen oft n u r langsam erfolgt, schien es von In teresse, den Einfluss von A lkohol auf die
b Proc. Roy. Soc. London [B] 95, 500 (1923—24).
2) Bull. Soc. chim. biol. 9, 454 (1927).
3) Z. physikal. Ch. 116, 135 (1925).
4) J . Phys. Chem. 35, 2732 (1931).
5) Am. Soc. 50, 2666 (1928).
6) Proc. Roy. Soc. London [B] 115, 180 (1934), u n d die weitere L ite ra tu r daselbst und bei 7).
7) J . Biol. Chem. 105, 359 (1934).
8) Proc. R oy. Soc. London [B] 115, 121 (1934) und die weitere L ite ra tu r daselbst.
A c id itä t v o n A m in osäu ren u n d A m inosäure-Form aldehyd-G em ische auch m it der G laselektrode zu un tersu ch en .
A u s f ü h r u n g d e r V e r s u c h e : Die analysenreinen Lösungen d er A m inosäuren w urden m it peinlich von K ohlensäure befreiter N atro n lau g e u n te r V erw endung von M ik ro b ü retten titrie rt. Als P o te n tialso n d e d ien te die w eiter oben beschriebene, selbst hergestellte G laselektrode. Die P o te n tia le w urde m it einem E ö h re n v o ltm e ter ge
m essen. Die p K-W erte ergaben sich aus den T itra tio n e n als die pH- W erte bei h älftig er N e u tra lisa tio n . I n den folgenden T itration s
k u rv en u n d der angeschlossenen T abelle sind die erh alten en E rgeb
nisse zusam m en gestellt.
Fig. 3 zeigt die T itra tio n e n von 20 c m 3 0,1-rn. G l y k o k o l l in v erschiedenen K o n z e n tra tio n e n von Ä th an o l u n d F o rm ald eh y d mit 0,1-n. N aO H (f = 1,2172) bei 16° C. A nfangsvolum en 20 c m 3, E n d v o lu m en 21,64 c m 3. (Die V o lu m en k o n trak tio n ist n ich t berücksichtigt
w orden.)
cm 3 0,1-n. N a O H (f) cm3 0,1-n. N a O H (f)
Fig. 3. Fig. 4.
K u r v e 1. 0,01-m. Glykokoll in 80-proz. Ä thanol
E n d p u n k t gef. = 2,00 cm 3 0,1-n. N aO H Sollwert = 2,00 ,, ,, ,, p K (halbe T itr.) = 9,93
k g = 1,02 X lO “ 10
K u r v e 2. 0,01-m. Glykokoll in 75-proz. Ä thanol u nd 0,70-proz. Form aldehyd E n d p u n k t gef. = 2,00 cm 3 0,1-n. N aO H
Sollwert = 2,00 ,, ,, ,, p K (halbe T itr.) = 8,28
K u r v e 3. 0,01-m. Glykokoll in 50-proz. Ä thanol und 4,17-proz. Form aldehyd E n d p u n k t gef. = 2,00 cm 3 0,1-n. N aO H
Sollwert = 2,00 ,, ,, „
p K (halbe T itr.) = 7,71
k s = 1,95X 10-«
K u r v e 4. 0,01-m. Glykokoll in 25-proz. Ä thanol und 7,65-proz. F orm aldehyd E n d p u n k t gef. = 2,00 cm 3 0,1-n. N aOH
Sollwert = 2,00 ,, ,, ,, p K (halbe T itr.) = 7,35
k s = 4,47 x IO"8 K u r v e 5. 0,01-m. Glykokoll in 11,13-proz. F orm aldehyd
E n d p u n k t gef. = 2,00 cm 3 0,1-n. N aOH
Sollwert = 2,00 ,, ,, „
pK (halbe T itr.) = 6,06
k g = 8,17 x IO“ 7
Fig. 4 zeigt die T itra tio n e n von 20 cm 3 0,01-m. S e r i n in v e r
schiedenen K o n zen tratio n en von Ä th an o l u n d F o rm aldehyd m it 0,1-n. N aO H (f = 1,2172) bei 16° C. A nfangsvolum en 20 c m 3, E n d volumen 21,64 c m 3. (Die V olu m enk o n trak tio n ist n ich t berücksich
tig t worden.)
K u r v e 1. 0,01-m. Serin in 80-proz. Ä thanol
E n d p u n k t gef. = 2,00 cm 3 0,1-n. NaOH Sollwert = 2,00 ,, ,, ,, p K (halbe T itr.) = 9,47
k s = 3,39 X lO -10 (16° C)
K u r v e 2. 0,01-m. Serin in 75-proz. Ä thanol u nd 0,70-proz. Form aldehyd E n d p u n k t gef. = 2,00 cm 3 0,1-n. N aOH
Sollwert = 2,00 ,, ,, ,, p K (halbe T itr.) = 7,87
k g = 1,35X 10-« (16° C)
K u r v e 3. 0,01-m. Serin in 50-proz. Ä thanol un d 4,17-proz. Form aldehyd E n d p u n k t gef. = 2,00 cm 3 0,1-n. N aOH
Sollwert = 2,00 ,, ,, ,, p K (halbe Titr.) = 6,58
k s = 2,63 X lO “ 7 (16° C)
K u r v e 4. 0,01-m. Serin in 25-proz. Ä thanol u n d 7,65-proz. Form aldehyd E n d p u n k t gef. = 2,00 cm 3 0,1-n. N aO H
Sollwert = 2,00 ,, ,, ,, p K (halbe T itr.) = 5,97
k 8 = 1 ,0 1 x 1 0 -« (16° C) K u r v e 5. 0,01-m. Serin in 11,13-proz. Form aldehyd
E n d p u n k t gef. = 2,00 cm 3 0,1-n. N aOH Sollwert = 2,00 ,, ,, ,, p K (halbe T itr.) = 5,58
F ig. 5 zeigt die T itra tio n e n von 20 cm 3 0,01-m. H i s t i d i n in verschiedenen K o n z e n tra tio n e n von Ä th a n o l u n d F o rm ald eh y d m it 0,1-n. N aO H (f = 1,0840) bei 16° C. A nfangsvolum en 20 c m 3, E n d volum en 21,84 c m 3. (Die V o lu m en k o n trak tio n ist n ic h t b erü ck sic h tig t w orden.)
Ph
cm 3 0,1-n. N a O H ( f)
Fig. 6.
Fig. 5.
K u r v e 1. 0,01-m - H is tid in in 8 0-proz. Ä th a n o l
E n d p u n k t gef. = 2,00 cm 3 0,1-n. N aO H Sollwert = 2,00 ,, ,, ,, p K (halbe T itr.) = 9,53
k 3 = 2,95 X 10-10 (16° C)
K u r v e 2. 0,01-m. H istid in in 75-proz. Ä thanol u n d 4,17-proz. Form aldehyd E n d p u n k t gef. = 2,00 cm 3 0,1-n. N aO H
Sollwert = 2,00 ,, ,, ,, p K (halbe T itr.) = 7,32
k s = 4 ,78X10“8 (16° C)
K u r v e 3. 0,01-m. H istid in in 50-proz. Ä thanol u n d 4,17-proz. Form aldehyd E n d p u n k t gef. = 2,00 cm 3 0,1-n. N aOH
Sollw ert = 2,00 „ ,, ,, p K (halbe T itr.) = 7,53
k s = 2,95x10-« (16° C)
K u r v e 4. 0,01-m. H istid in in 11,13-proz. Form aldehyd
E n d p u n k t gef. = 2,00 cm 3 0,1-n. N aO H Sollw ert = 2,00 „ ,, ,, p K (halbe T itr.) = 8,16
I n Fig. 6 sind die p K-W erte der A m inosäuren aus den F igu ren 3, 4 u n d 5 als F u n k tio n der K o n z e n tra tio n von Ä than ol u n d F o rm a l
dehyd auf getragen. D ie K u rv e n stellen d a r:
1. p K-W erte von 0,01-m. H istidin 2. pK -W erte von 0,01-m. Glykokoll 3. p K-W erte bei 0,01-m. Serin.
Fig. 7 zeigt die T itra tio n von 25 cm 3 0,008-m. a - A l a n i n in v e r
schiedenen K o n z e n tra tio n e n von Ä th an o l m it 0,1-n. N aO H (f = 1,2171) hei 18° C. (Die V olum enko n trak tio n bei der H erstellung der Lösungen ist b erü ck sich tig t w orden.)
Fig. 7 K u rv e 1. 0,008-m. a-A lanin in 70-proz. Ä thanol
E n d p u n k t gef. = 1,99 cm 3 0,1-n. N aOH
Sollwert = 2,00 ,, ,, ,,
p K (halhe T itr.) = 10,30 ks = 5 ,0 2 x 1 0 - “ K u rv e 2. 0,008-m. a-A lanin in 50-proz. Ä thanol
E n d p u n k t gef. = 2,02 cm 3 0,1 -n. NaOH
Sollwert = 2,00 ,, ,, ,,
p K (halbe T itr.) = 10,22 k g = 6 ,0 3 x 1 0 - “ K u r v e 3. 0,008-m. a-A lanin in 30-proz. Ä thanol
E n d p u n k t gef. = 1,99 cm 3 0,1-n. N aOH
Sollwert = 2,00 ,, ,, ,,
p K (halbe T itr.) = 10,04 k s = 9 ,1 2 x 1 0 - “
Fig. 8 zeigt die T itra tio n von 25 cm 3 0,008-m. V a l i n in v e r
schiedenen K o n zen tratio n en von Ä th an ol m it 0,1-n. N aO H (f = 1,2171)
bei 18° C. (Die V o lum enk o ntrak tio n bei der H erstellung der Lösungen
ist n ich t b e rü c k sich tig t w orden.)
—
1068
—Fig. 8.
K u r v e 1. 0,008-m. Valin in 70-proz. Ä thanol
E n d p u n k t gef. — 2,00 cm 3 0,1-n. N aO H
Sollwert = 2,00 „ ,, ,,
p K (halbe T itr.) = 10,17
ks = 6,77 X 1 0 -11
K u r v e 2. 0,008-m. V alin in 50-proz. Ä thanol
E n d p u n k t gef. = 2,00 cm 3 0,1-n. N aO H
Sollwert = 2,00 ,, ,, ,,
p K (halbe T itr.) = 10,06
k s = 8,71 X l0 ~ 11
K u r v e 3. 0,008-m. V alin in 30-proz. Ä thanol
E n d p u n k t gef. = 1,99 cm 3 0,1-n. N aOH
Sollwert = 2,00 ,, ,, ,,
p K (halbe T itr.) = 10,01 k g = 9 ,7 7 x 1 0 - “
Die e rh a lte n e n p K-W erte der A m inosäuren in w ässrig alkoholi
scher Lösung u n d in dem te rn ä re n S ystem v o n W asser-Alkohol- F o rm a ld e h y d sind in T ab. 1 zusam m engestellt.
W ie aus den K u rv e n v o n F ig. 3 - 8 u n d d er T ab. 1 zu ersehen ist, v e ru rsa c h t d er Z usatz von A lkohol zur w ässrigen Lösung der A m inosäuren n u r eine sehr geringe S teigeru ng des p K-W ertes. In 7 0 -8 0 -p ro z . Alkohol v erg rö ssert sich der p K-W ert u m 0 ,3 - 0 ,6 E in
heiten. B ei gleicher V erän d eru n g des L ösungsm ittels sind von M ichaelis u n d M iz u ta n i1) ähn lich e A ciditätsv ersch ieb u n g en im p0H- W e rt von A m m oniak u n d A nilin b e o b a c h te t w orden, w ährend bei M onocarbonsäuren die Säureschw ächung, d. h. der A nstieg des p H-W ertes, 1 - 2 ,5 E in h e ite n b e tru g .
D e r geringe E influss des A lkohols auf die D issoziation der A m inosäuren k ö n n te d a ra u f b e ru h en , dass h ier die D issoziation d er freien Säure d u rch den A lkohol in äh n lich er W eise verm indert w ird, wie die in nere Salzbildung. Diese beiden gleichartigen Ionisa-
>) Bioch. Z. 147, 7 (1924); Z. physikal. Ch. 116, 135, 350 (1925), 118, 318 (1925).
tionsverschiebungen w ürden eine geringe A bhängigkeit der S äu re
stärke der A m inosäure vom A lkoholgehalt des L ösungsm ittels Vor
täuschen.
T a b e lle 1.
pK-W e r t e v o n A m i n o s ä u r e n in w ä s s r i g - a l k o h o l i s c h e r L ö s u n g u n d in d e m t e r n ä r e n S y s t e m v o n W a s s e r - A l k o h o l - F o r m a l d e h y d
Lösungsm ittel Glykokoll H istidin Serin a-Alanin Valin
W asser 9,74b 9,51!) 9,152) 9,683) 9,644)
80% Ä thanol 9,93 9,53 9,47
16» C 70% Ä thanol
18° C 10,30 10,17
50% Ä thanol
18° C 10,22 10,06
30% Ä thanol
18° C 10,04 10,01
75% Ä thanol
0,70% C H 20 8,28 7,32 7,87
16» C 50% Ä thanol
4,17% CH20 7,91 7,53 6,58
16» C 25% Ä thanol
7,65% CH 20 7,35 7,88 5,97
16» C 11,13 CH20
16° C 6,06 8,16 5,58
90% Ä thanol
18° C 9,286) 10,095)
72% Ä thanol 9,82«) 9,45») 10,02») 9,73«)
25» C 9,997)
Die säureverstärkende W irk u ng des Fo rm aldehyds auf die A m ino
säuren w ird durch einen Zusatz von Alkohol w eitgehend k om pen siert. E ntgegen dem üblichen V erh alten der A m inosäuren zeigt
') Siehe unsere vorhergehende M itteilung.
2) Iiirk u nd Schmidt, J . Biol. Chem. 81, 237 (1929).
3) Branch un d M iyamoto, Am. Soc. 52, 863 (1930).
4) Iiirk un d Schmidt, U niv. Calif. P ub. Physiol. 7, 57 (1929).
5) Neuberger, Proc. Roy. Soc. London [B] i 15, 180 (1934).
») Jukes un d Schmidt, J . Biol. Chem. 105, 359 (1934).
7) Michaelis un d M izutani, Z. physikal. Ch. 116, 135 (1925).
H istid in in 75-proz. Ä th an o l schon bei Z u satz v o n 0,7 % F orm aldehyd einen m inim alen p K-W ert von 7,32. D u rch einen w eitern Z usatz von F o rm ald eh y d w ird der p K-W ert erheblich erh ö h t. I n wässrigem F orm ald eh y d von 1 1 % steig t er au f 8,16. I n 80-proz. Ä th an o l wird p ra k tisc h derselbe W e rt wie in W asser, näm lich p K = 9,5, beobachtet.
D as abn orm ale M inim um des p K-W ertes von H istid in beim Zusatz von F o rm ald eh y d sch eint in alkoholischen Lösungen noch deutlicher h e rv o rz u tre te n als in w ässriger Lösung.
IV . B e s t i m m u n g d e s T e m p e r a t u r k o e f f i z i e n t e n d e r s c h e i n b a r e n D i s s o z i a t i o n s k o n s t a n t e n v o n A m i n o s ä u r e n . U m einen w eiteren E in b lick in die N a tu r d er Säure Verstärkung der A m inosäuren beim Z u satz von F o rm a ld e h y d zu gew innen, wurde v ersu ch t, die T e m p era tu ra b h än g ig k e it der D issoziationskonstanten von einigen A m inosäuren zu e rm itte ln . Zu dem Zw eck w urden reine L ösungen der A m inosäuren in 4,77 x 10 _3-m. K o n z e n tra tio n in 10,42-proz. F o rm ald eh y d m it re in ste r N atro n lau g e h ä lftig n eu trali
siert u n d der p H-W ert m it der G laselektrode im Tem peraturbereich von 8 - 3 5 ° C gem essen.
A p p arat zur B estim m ung des Tem peraturkoeffizienten der D issoziationskonstanten v on A m inosäuren.
Zur A usführung der B estim m ungen w urde der in Fig. 9 abgebildete A pparat gebaut.
R echts auf der F igur ist der M esstherm ostat m it der G laselektrode un d den angeschlos
senen beiden K alom elelektroden zu sehen, die sich in einem Ö ltherm ostaten befinden, dessen Füllung durch eine Z ahnradpum pe im U m lauf gehalten w ild. D er M essthermostat w ar m it einem genauen K ontrolltherm om eter un d einem M anom eter versehen, um den Ü berdruck im um laufenden Öl messen zu können. I n dem m ittleren Gefäss erfolgte die E rw ärm ung des Öls m it einem elektrisch gesteuerten Tauchsieder. Z ur raschen Einstellung einer bestim m ten T em p eratu r w urde der m it einem Relais gesteuerten elektrischen E r
wärmung eine A bkühlung des Öls m it Hilfe der Kühlw asserspirale in dem m ittleren Gefäss entgegengeschaltet. F ü r die m ittleren T em peraturen genügte hierzu Leitungsw asser von genau eingestellter Strom geschw indigkeit. F ü r die tiefen T em peraturen wurde m it Hilfe eines Höppler-Therm ostaten Eiswasser aus dem links gezeichneten Gefäss m it Hilfe einer Zentrifugalpumpe in genau regulierter Geschwindigkeit durch die im ö l liegende Spirale geleitet.
Die T em peratur der Zelle w urde u n m ittelb ar über der Glaselektrode m it einem empfindlichen T herm om eter gemessen und konnte auf ;£ 0,1° C k o n stan t gehalten werden.
Der in den Ö lkreislauf eingeschaltete D reiw eghahn diente dazu, um w ährend der Potentialmessungen auf „L eerlauf“ um schalten zu können, so dass die B eobachtungen bei ruhendem ö l, ungestört von eventuellen R eibungseffekten, gem acht werden konnten.
Es zeigte sich indessen, dass die Potentialm essungen durch das um laufende ö l nicht merklich beeinflusst wurden.
Als Messelektrode diente eine selbst hergestellte Kugelglaselektrode aus Corning 015-Glas nach den A ngaben bei Bergsland1). Die G laselektrode wurde m it einem A cetat
puffer von pH = 4,6 gefüllt. Als A bleitungselektrode diente eine gesättigte Kalomel- elektrode m it einem A gar-A garheber, der m it einem A cetatpuffer von pH = 4,6 d u rch trän k t war. Als Vergleichselektrode diente ebenfalls eine gesättigte Kalom elelektrode, die mit einem Dreiweghahn u n d einem m it K alium chlorid gefüllten V erbindungsheber versehen war. Vor jeder Messung w urde der Dreiw eghahn so gestellt, dass etw as K alium - chlorid durch das V erbindungsrohr der Vergleichselektrcde m it gelindem L uftdruck au s
gepresst werden konnte. D as R ohr w ar unten durch einen W attepfropfen verschlossen.
Mit der scharfen Flüssigkeitsgrenze werden g u t definierte Potentiale erhalten.
Am u n tern E nde der Messzelle w ar eine m it Dreiw eghahn versehene K apillare a n geschmolzen. D urch diese konnte zum R ühren der Lösung Stickstoff eingeleitet werden.
Gleichzeitig diente die K apillare auch zum Ablassen der gemessenen Lösungen.
Zur Vermeidung von K riechström en waren die aus dem T herm ostaten heraus
ragenden Teile der E lektroden sorgfältig paraffiniert, ebenso die Schenkel derselben, ' welche durch einen ebenfalls paraffinierten G um mistopfen geführt waren. D as A bleitungs
kabel von der Glaselektrode w ar sorgfältig abgeschirm t und der M esstberm ostat geerdet.
Der Übergang von m ittleren M esstem peraturen zu den nächsthöheren benötigte W arte
zeiten von 20—30 M inuten. Im Bereich der T em peraturen um 0° C waren hierzu 3 bis 4 Stunden erforderlich.
Die Potentiale der Aminosäuren w urden m it den P otentialen von geeigneten Puffern auf S. 1058 verglichen, deren Tem peraturkoeffizienten genau bekannt sind.
Die resultierende A cid itätsverschiebung r ü h rt von der Ä nderung der D issoziation der gebildeten F orm aldehyd-A m inosäure u n d von der Ä nderung des Gleichgewichtes ih rer B ildung aus der freien A m ino
säure u n d dem v orhan denen F o rm aldeh y d her. H ierbei d arf wohl angenommen werden, dass die lockere A nlagerung des F orm aldehyds an die A m inosäure sich als besonders tem p eraturem pfind lich erw eist, so dass eher grössere la te n te W ärm en zu erw arten sind als bei der Dissoziation analoger M onocarbonsäuren in w ässriger Lösung.
Aus dem T em peraturkoeffizienten der (scheinbaren) D issozia
tio nskonstanten ergib t sich die zugehörige la te n te W ärm e nach der van f H o ffsc h e n G leichung wie folgt:
— d ln K d log K„ d (log K )
ÜH = — = 2,303-R - = 4,571 (1)
Die T em p eratu rab h än g ig k eit der la te n te n W ärm e ZlH erh ält man n ach dem K irc h h o ff sehen Gesetz aus der D ifferenz der W ärm e-
b l.C.
—
1071
——
1072
k a p a z itä t d C p d er bei d er B e a k tio n v erschw indenden u n d e n t
steh en d en Stoffe:
B ei sehr g enau er M essung k önnen in te ressa n te A ngaben ü b er die T e m p era tu ra b h än g ig k e it des W ärm ein h altes der reagierenden B e
sta n d te ile des System s gew onnen w erden. So fan d H . 0 . Jen M n s1) bei der U n te rsu c h u n g des T em p eratu rk o effizien ten von M onocarbon
säu ren in v e rd ü n n te r w ässriger L ösung, dass A Cp/d n = 4,51, wobei n die Z ahl der K o h len sto ffato m e in der F e tts ä u re b e d e u te t.
Z ur D a rste llu n g der G leichgew ich tsk onstanten schw acher Säuren als T e m p e ra tu rfu n k tio n sind in n eu erer Z eit die folgenden Ansätze vorgeschlagen w ord en :
ln K = A /T + B ln T + C T + D 2) (3)
l n K = A / T - B + C T 3) (4)
d C n
ln K — A /T + - ln T + B 4) (5)
Jcv
ln K = A /T + B I| T- + C1° — - + D » ) (6)
D u rch D ifferen tiatio n der oben erw ä h n te n G leichungen 3 bis 6 n ach 1/T e rh ä lt m an A H . E in e w eitere D iffe ren tia tio n n ach T liefert A Cp als T e m p e ra tu rfu n k tio n :
z lH = ( A - B T - C T 2) R (3a)
A C p = ( - B - 2 C T ) R (3b)
ü H = ( A - C T 2) R (4a)
zlCp = —2 C T R (4b)
/ A C \
Ü H = ( A r£- T ) R (5a)
Ü Cp = - Ü C p (5b)
Ü H = (A + B ln T - B + C ln 2 T - 2 C ln T) R (6a) ,6b,
Z um al bei k o m plizierter zusam m eng esetzten Lösungen, deren W ärm eeigenschaften m an n ich t ü b erb h c k e n k a n n , w ird m an genötigt sein, den rechnerisch leich t au sw e rtb a re n A n s a tz :
lo g K s = - ^ - + B + C T + D T 2 (7)
zu v erw enden m it den rein em pirischen K o n sta n te n A, B, C u nd D.
b T rans. F a ra d a y Soc. 40, 19 (1944).
2) Harned u n d Owen, Chem. R ev. 25, 31 (1939).
3) Harned u n d Robinson, T rans. F a ra d a y Soc. 36, 973 (1940).
4) Everett u n d W ynne-Jones, T rans. F a ra d a y Soc. 35, 1380 (1939).
5) H. 0 . Jenkins, T rans. F a ra d a y Soc. 40, 19 (1944).
1073 Aus (7) fo lg t:
J H = 4,57t- -d (l0 g K )
Aus (8) folgt:
~ A C v = d (l/T ) d (H )
d T
= 4,571- ( A - C T 2- 2 D T 3)
4,571-(2 CT + 6 D T 2)
( 8 )
(9) In T ab. 2 sind die p K-W erte zusam m engestellt, welche m it den u ntersu ch ten 4,77 x 10_3-m. A m inosäuren in 10,42 Gew.proz. F o r
m aldehyd e rh a lte n w orden sind.
T a b e lle 2.
308° K 298° K 289° K 281° K
1. A sparaginsäure 4,00 4,03 4,08 4,14
2. Serin . . . . 5,59 5,65 5,73 5,82
3. Glykokoll . . 5,95 5,985 6,04 6,10
4. /1-Alanin . . . 6,33 6,42 6,53 6,65
5. P henylalanin . 6,88 7,01 7,15 7,29
6. Leucin . . . . 6,965 7,17 7,38 7,59
7. Isoleucin . . . 7,455 7,60 7,745 7,91
8. O xyprolin . . 7,59 7,72 7,85 7,99
9. Sarkosin . . . 7,73 7,86 8,00 8,16
Die p K-W erte der obigen Tabelle w urden zunächst gegen l/T aufgetragen, wobei, wie Fig. 10 zeigt, p rak tisch gerade Linien erhalten wurden, gem äss dem A n satz:
lg K s = A/T + B ... (10)
I som it:
d d H
J H - ~ 4 ' 6 7 1 ' A “ n d ' V t - 0 (11)
3 J 0 3.40 3.50 3.60
I O ' 3 ■ l / T “ K
Fig. 10.
- R l n K von 4,77 x 10_3-m. Aminosäuren in 10,42-proz. C H ,0 in F u n k tio n von l/T .
Fig. 11.
p t -W erte v o n 4 ,77 x 10~3-m. Aminosäuren in 10,42-proz. CH 20 in F u n k tio n von T.
68
F ü r die u n te rsu c h te n A m inosäuren sind in T ab. 3 die K o n sta n te n A u n d B von Gl. 10 u n d die W erte v o n J H d er Gl. 11 zusam m en
g estellt.
T a b e lle 3.
A B A H
1. A sparaginsäure - 448,7 - 2,543 2051 2. Serin . . . . - 737,2 - 3 ,1 9 6 3370 3. G lykokoll . . - 480,8 - 4,3889 2198 4. /3-Alanin . . . -1 0 2 5 ,6 - 2,9999 4688 5. P henylalanin . -1 3 1 4 ,1 -2 ,6 1 3 1 6007 6. Leucin . . . . - 2003,2 - 0,4635 9157 7. Isoleucin . . . -1 4 5 8 ,3 -2 ,7 1 9 9 6666 8. O xyprolin . . -1 2 8 2 ' - 3,4274 5860 9. Sarkosin . . . -1 3 7 8 ,2 - 3,255 6300
W enn indessen die p K-W erte gegen die em pfindlichere u n ab hängige V ariable T au fg etrag en w erden, so t r i t t eine deutliche Tem
p e ra tu ra b h ä n g ig k e it in E rscheinung, wie die graphische D arstellung in Fig. 11 erk enn en lässt.
Es schien n u n in te ressa n t, die K u rv e n von Fig. 11 m it Hilfe von Gl. 7 d arzustellen. H ierzu reic h te n die D a te n von Tab. 2 eben aus.
Die e rh a lte n e n K o n sta n te n sind in T ab. 4a, die zugehörigen W erte von J H u n d zlCp in T ab. 4b zusam m engestellt.
T a b e lle 4 a . Die K o n stan ten von Gl. 7.
Substanz A B C x lO “ 3 D X 1 0 -4
1. A sparaginsäure 521,16 - 2 1 ,4 9 95,256 -1 ,4 2 7
2. Serin . . . . 340,84 - 24,15 105,160 - 1,574
3. Glykokoll . . 1443,56 -3 1 ,3 7 116,640 -1 ,6 0 1 4. /J-Alanin . . . 160,40 - 25,96 115,00 - 1 ,7 2 0 5. Phenylalanin . - 521,29 -1 9 ,0 0 83,757 -1 ,2 6 3 6. Leucin . . . . - 581,44 - 22,26 98,941 -1 ,4 0 1 7. Isoleucin . . . -4 6 8 1 ,5 6 18,25 - 30,648 - 0 ,1 1 2
8. O xyprolin . . - 2686,63 2,20 3,664 - 0,338
9. Sarkosin . . . -3 2 8 8 ,1 2 2,58 26,100 - 0.828
Die gefundenen J H - W e r te zeigen den in Fig. 12 dargestellten T em p eratu rg an g , dem eine p ra k tisc h lineare V eränderlichkeit von J Cp m it der T e m p era tu r e n tsp ric h t, wie aus Fig. 13 zu ersehen ist.
Die in Tab. 4b an g e fü h rte n W erte von J C P sind von ganz ä h n licher Grösse wie die von Everett u n d W y n n e -J ones1) u n d von J e n k in s 2) an g e fü h rte n analogen W erte fü r wässrige Lösungen zahlreicher
J) T rans. F a ra d a y Soc. 35, 1384 (1939).
2) T rans. F a ra d a y Soc. 45, 22 (1944).
organischer Säuren. F ü r die zugehörige la te n te W ärm e kom m en im Gegensatz zu Tab. 4b /IH -W e rte m it w echselndem V orzeichen vor, die n u r vereinzelt den W ert von 3000 gcal erreichen u n d m ehrheitlich sogar u n te r 1000 gcal bleiben.
T a b e lle 4b.
d H - und d C p-W erte nach Gl. 8 und 9.
Substanz zl H gcal d C p gcal
308» K 298° K 289» K 281» K 308» K 298» K 289° K 281» K 1. Aspara-
ginsäure . 806,12 1760,95 2495,10 2791,98 -1 0 3 ,0 5 - 88,04 - 75,21 - 64,33 2. Serin . . 1998,43 3049,08 3856,65 4182,21 -1 1 3 ,4 1 - 96,86 - 82,71 - 70,12 3. Glykokoll 1214,66 2015,34 2603,09 2732,55 - 88,11 - 72,17 - 58,57 - 47,07 4. jS-Alanin . 3190,25 4335,998 5216,40 5570,37 -1 2 3 ,6 9 - 105,62 - 90,16 - 77,06 5. Phenyl
alanin . . 4965,55 5825,92 6489,02 6763,27 - 92,76 - 79,43 - 68,02 - 58,35 6. L eu cin . . 8138,50 8925,78 9520,23 9694,14 - 85,91 - 71,67 - 59,51 - 49,23 7. Isoleucin . 5126,08 6256,32 7233,95 8051,43 -1 1 5 ,3 6 -1 1 0 ,7 0 - 106,56 -1 0 2 ,9 2 8. Oxyprolin 4851,68 5600,33 6229,73 6693,33 - 77,52 - 72,24 - 67,65 - 63,70 9. Sarkosin . 4496,21 5841,88 6956,67 7724,14 - 140,19 -1 2 8 ,8 1 -1 1 9 ,0 8 -1 1 0 ,6 8
Fig. 12.
A H von 4,77 x 10~3-m. A minosäuren in 10,42-prcz. CH20 in F u n k tio n von T.
280 290 300
Fig. 13.
310 T °K
A Cp von 4,77 x 10~3-m. Aminosäuren in 10,42-proz. CH20 in F u n k tio n von T.
Es ist n u n zu bem erken, dass die in Tab. 4b e n th a lte n e n W ärm e
daten auf sehr kleinen in der N ähe der Messfehler liegenden Ä n d e
rungen der p K-W erte m it der T e m p era tu r beruhen, wie aus folgendem zu ersehen is t: N im m t m an auf graphischem W ege einen Ausgleich der p K-W erte in n erh alb von 0,01 p K fü r die einzelnen P u n k te , im Sinne einer Streck un g der K urven, vor, um die W erte der la te n te n W ärm en bei A nnahm e der geringst zulässigen Ä nderung der W ärm e
k a p a zitä t zu erfahren, so erh ält m an die
zlII-W erte der Tab. 5.
—
1076
—T a b e lle 5.
ZlH u n d -dCp a u s d e n g r a p h i s c h a u s g e g l i c h e n e n p K - W e r t e n
Substanz T em peratur der M esspunkte
308° K 298° K 289° K 281° K
1. A s p a r a g i n s ä u r e
p {, a u s g e g l i c h e n ...
-dH in g c a l ...
( d H Xi- Z l H TJ / Z l T = /ICp
3,99 1953
4,04 1990
L7 - 1
4,08 2088 0,9
4,13 2166 9,8 2. S e r i n
p K a u s g e g l i c h e n ...
AH in g c a l ...
( A Kt - a kT2)i a t = a c v
5,58 3292
5,66 3380 8,8
5,74 3456 8,4
5,82 3519 7,9 3. G l y k o k o ll
p K a u s g e g h c h e n ...
-dH in g c a l ...
(-d H T] - AH t )/zIT = -dC^
5,94 2151
- 4 6,00 2195 1,4
6,04 2266 7,8
6,09 2374 13,5 4. /3 - A la n in
p K a u s g e g l i c h e n ...
-dH in g c a l ...
(AH Ti - AH X )//1T = AC~p
6,32 4625
6,44 4656 1,1 - 1
6,54 4761 LI,7
6,64 4822 7,6 5. P h e n y l a l a n i n
pK a u s g e g h c h e n ...
-dH in g c a l ...
( A H Ti- A HtJ / A T = A C ^
6,88 5937
7,02 5978 1,1
7,16 6007 3,2
7,28 6020 1,6 6. L e u c i n
p K a u s g e g h c h e n ...
A K in g c a l ...
(zlH Xi- d H ,,) / z ! T = z l C p
6,96 8938
- 1 7,17 9113 7,5
7,38 9117 0,4
7,58 9145 3,5 7. I s o l e u c i n
p K a u s g e g h c h e n ...
-dH in g c a l ...
( A K Ti- A K Ti)I A T = A Cp
7,45 6601
7,61 6615 1,4
7,75 6693 8,7 - 1
7,90 6796 2,9 8. O x y p r o l i n
p K a u s g e g h c h e n ...
AH in g c a l ...
("d H Xi ~ AH Xi)/ZlT = zl Cp
7,58 5824
7,72 5844 2,0
7,86 5897 5,9
7,98 5922 3,1 9. S a r k o s i n
p K a u s g e g h c h e n ...
-dH in g c a l ...
(A H Ti - A HtJ /A T = -d
7,72 6166
—
7,87 6230 3,4
8,01 6271 1,6
8,15 6325 6,8
—
1077
—Aus den hohen W e rten der W ärm etö n u ngen A H der Tab. 4b und 5 d a rf w ohl geschlossen w erden, dass die T em p eratu rän d eru n g der D issoziationskonstanten der A m inosäuren in F orm ald ehy d v o r
wiegend auf einer V erschiebung vom reversiblen Gleichgewicht der A nlagerungsverbindung zwischen A m inosäuren u n d F orm aldehyd beruht. Die frü h er besprochene A nnahm e einer lockeren A nlagerung des F orm aldehyds an die A m inosäure als U rsache der S äu rev er
stärkung scheint durch die gefundenen positiven und hohen la te n te n W ärmen zlH g e stü tz t zu w erden.
V. L e i t f ä h i g k e i t s m e s s u n g e n .
Von besonderem In te resse w ar die F rag e nach dem zeitlichen Verlauf der L eitfähig keit vom M om ent der E inw irkung des F o rm a l
dehyds an gerechnet. W enn näm lich die S äu rev erstärk u n g au f der Bildung einer S c h iff sehen B ase b eru hen w ürde, so w äre m it R ü c k sicht auf die m eist viele S tu n d en dau ern d e B ildung derselben in verdünnter Lösung ein entsp rech end langsam er A nstieg der L e it
fähigkeit zu erw arten. B e ru h t dagegen die S äu rev erstärk u n g auf der reversiblen A nlagerung der E nolform des F orm aldehyds an die A m ino
gruppe, so sollte ein entsp rech end rascher A nstieg der L eitfähigkeit eintreten.
Diese Frage w urde bei Glykokoll, /J-Alanin u nd d-Arginin ge
prüft und dabei gefunden, dass die L eitfäh ig keit auch in sta rk v e r
dünnter Lösung schon n ach wenigen M inuten zu einem statio n ären Endw ert ansteigt.
Messungen bei 25° C ergaben, dass 0,3-m. G lykokoll in 5,57-proz.
Form aldehyd nach 85 Sek. eine k o n sta n te L eitfähigkeit auf weist.
In dieser Zeit t r a t ein A nstieg der anfänglichen L eitfähigkeit um das 8,46-faehe ein. Bei 0,05-m. ß-A lanin, in 8,27-proz. F o rm aldehyd, war K onstanz der L eitfähigk eit nach 90 Sek. erreicht. I n dieser Zeit trat ein A nstieg der anfänglichen L eifähigkeit um das 3,63-fache ein.
0,05-m. d-Arginin zeigte u n te r denselben V ersuchsbedingungen wie /J-Alanin eine Sonderstellung. Schon n ach 16 Sek. w ar ein M axim um der L eitfähigkeit erreicht, wobei dieselbe auf den 1,71-sten B etrag des A nfangsw ertes anstieg. D an n folgte eine langsam e A bnahm e, welche nach 360 Sek. k o n s ta n t w urde u n d n u n noch das 1,28-fache des Anfangswertes b etrug. Diesem V erh alten entsprechend zeigt auch das d-Arginin bei der p o tentio m etrischen T itra tio n eine Sonderstellung, indem auch hier die S ä u rev erstärk u n g m it F o rm aldehyd fü r die potentiom etrische T itra tio n versagt.
In k o n zentrierteren Lösungen, jedoch m it re la tiv geringerem Gehalt an F orm aldehyd, h a t E . B a u r 1) bei G lykokoll u n d A lanin einen ähnlichen zeitlichen A nstieg der L eitfähig keit b eo b ach tet wie
b Helv. 24, 1024 (1941).
—
1078
—in T ab. 6. B a u r d e u te t diese raschen Ä nd erungen der L eitfähigkeit als B ildung u n d Z erfall v o n M ethinkom plexen ( S c h iffsehe Basen), was nach W adsworth u n d Pangborn1) u n d n ach den B efunden in u nserer v orh ergeh en den M itteilu n g n ic h t zu treffend ist.
T a b e lle 6.
Z e i t l i c h e Ä n d e r u n g d e r L e i t f ä h i g k e i t e i n e r w ä s s r i g e n L ö s u n g v o n C H 20 d u r c h Z u g a b e v o n f e s t e r A m i n o s ä u r e b e i 2 5 ° C .
Am inosäure konz. CH 20 0/!0
Zeit
Sek. f l - i x io ~ 4
0 0,8
20 3,30
35 3,92
47 5,4
62 6,25
0,3-m. Glykokoll 5,57 72 6,45
85 6,77
92 6,77
107 6,77
125 6,77
140 6,77
0 0,79
20 2,52
45 2,78
0,05-m. /J-Alanin 8,27 64 2,82
90 2,86
114 2,87
130 2,87
180 2,87
0 0,79
16 1,35
28 1,30
45 1,25
62 1,21
81 1,17
107 1,16
0,05-m. d-Arginin 8,27 125 1,12
165 1,09
190 1,08
210 1,07
240 1,05
287 1,02
360 1,01
430 1,01
b J . Biol. Chem. 116, 425 (1936).
—
1079
—Z ur B erechnung der D issoziation sk o n stanten sind die obigen R elativm essungen der L eitfähigk eit n ich t ausreichend. Bei den durch F orm aldehyd v e rs tä rk te n A m inosäuren liefert indessen die k ondukto- m etrische T itra tio n auch noch m it 0,05-m. Lösungen bei T itratio n m it 0,1-n. N aO H g u te R e su lta te .
Z u s a m m e n f a s s u n g .
Es w urde die scheinbare D issoziationskonstante von Glykokoll in wässrigem A ceton von 47,7 Yol.proz. u n d in P ropionaldehyd von 10 Gew.proz. m it der G laselektrode gemessen.
In gleicher W eise w urden die scheinbaren D issoziationskon
stanten einiger A m inosäuren in w ässrigem Alkohol und in W asser- Alkohol-Form aldehyd-M ischungen b estim m t.
Es w urde der T em peraturkoeffizient der scheinbaren D issozia
tionskonstanten von einigen A m inosäuren in w ässrigem F orm aldehyd erm ittelt u nd der zeitliche V erlauf der L eitfähigkeit beim E in träg en von Glykokoll, /J-Alanin u n d d-A rginin in v erd ü n n te wässrige F o rm a l
dehydlösungen gemessen. Die hierbei gew onnenen R esu ltate stü tzen die A nnahm e, dass die S äu rev erstärk u n g von A m inosäuren durch Form aldehyd in einer reversibel erfolgenden, raschen A nlagerung des Form aldehyds an die A m inogruppe erfolgt.
L ab o rato riu m fü r anorganische Chemie E idg. Techn. H ochschule, Zürich.
139. Zur K en n tn is des A bbaues der A m in osäu ren im tie r isc h e n O rgan ism u s.
7. Über B e la stu n g sv ersu ch e m it d - und /-A m in osäu ren v o n S. E d lb a e h e r u n d K arl S eh m id .
(18. V II. 45)
Ü ber das Schicksal der verschiedenen A m inosäuren der d- und
Z-Reihe im tierischen Organism us w urden hauptsächlich U n tersu ch
ungen auf enzym chem ischer G rundlage d urchgeführt. Ausgehend von
den ersten Versuchen von A . Krebs u n d 0 . Warburg ü ber die F u n k tio n
der d- und Z-Aminosäure-oxydasen im tierischen O rganism us, sowie
ausgehend von U ntersuchungen über das Schicksal des A rginins und
Histidins, die speziell von dem E in en von uns in einer A nzahl von
Abhandlungen beschrieben w urden, stellten wir uns die F rage, wie
sich diese verschiedenen o xydativen und hydrolytischen E n zy m
systems am G esam torganism us ausw irken. Die em inente A k tiv ität
—
1080
—d er d-A m inosäure-oxydase s te h t im W idersp ru ch zu B elastu ng sv er
suchen verschiedener A u to ren , welche zeigten, dass ein grösser Teil der d-A m inosäuren den O rganism us u n v e rä n d e rt passieren kann.
Diese D iskrepanz zwischen E n z y m a k tiv itä t in v itro u n d dem V er
h a lte n der d-A m inosäuren in vivo b ed arf also einer K läru n g . In den vorangegangenen A rb e ite n 1) dieser R eihe h a b en w ir das V erhalten der d- u nd Z-Am inosäure-oxydasen au sführlich beschrieben. U n ter
suchungen ü b er B elastu n g m it d- u n d Z-Aminosäuren w urden unseres W issens zu erst von J . W ohlgemuth2) m itg ete ilt. E r injizierte K an in chen racem ische A m inosäuren wie T yrosin, Leucin, A sparaginsäure und G lutam insäure u n d k o n n te aus dem H a rn der Tiere d a n n den grössten Teil der d-Form en w ieder isolieren. Die A usbeute an d-G lutam insäure erreichte niem als auch n u r a n n ä h ern d den theo retisch en W ert.
W eiterh in h a b en Neubauer u n d M ita rb e ite r3) V ersuche m it phenyl
su b stitu ie rte n racem ischen A m inosäuren d u rch g e fü h rt u n d dabei die d-Form en im H a rn w iedergefunden. D a es sich bei letzteren um A m inosäuren h a n d e lt, die keine E iw eissbausteine sind, sagen diese U n tersuch u ngen w enig ü b e r das V erh alten der d-A ntipoden der n a tü rlic h e n A m inosäuren im O rganism us aus. Abderhalden u n d Weil*) h ab en an K an in ch en einen B elastu ng sv ersuch m it d,Z-Histidin be
schrieben, u n d k o n n ten d abei aus dem H a rn optisch reines d-Histidin isolieren. G em einsam m it H anson h a t Abderhalden5) d an n sp äter Be
lastung sv ersu che an K an in ch en w iederholt, indem er m ehrere Tage h in d u rch d-H istid in sp ritzte , u m eine A npassung des tierischen O rganism us im Sinne eines gesteig erten d-A bbaues zu beobachten, doch gelang dieser N achw eis n ich t. E n d lich h ab e n Abderhalden und Tetzner6) B elastungsversuche m it racem ischem A lanin an verschie
denen Säugern u n d an der T au b e d u rch g e fü h rt. Sie fanden bei In je k tio n von d-A lanin speziell bei der T aube das von uns als ,,A b derhalden-Schock“ bezeichnete P h än o m en . Ü b er dieses w urde in der 3. M itteilun g dieser R eihe gem einsam m it 0 . W is s 7) b e ric h te t. Ge
m einsam m it H . B a u r u n d R . Staehelin8) h a t der E in e von uns B elastungsversuche am M eerschw einchen m it d- u n d Z-Histidin u n tern o m m en , die zu dem E rgebnis fü h rte n , dass n u r sehr geringe M engen des d-H istidins bei diesen Tieren re tin ie rt w urden. Im A n
schluss an diese U n tersu ch u n g en h a b en d an n Holtz u n d Gredner9) solche B elastungsversuche m it d -H istidin am M eerschw einchen und
b H elv. 27, 151, 928, 1060, 1824, 1831 (1944); 28, 797 (1945).
2) B. 38, 2064 (1905).
3) A reh. klin. Med. 95, 211 (1919).
4) Z. physiol. Ch. 77, 435 (1912).
5) F erm entf. 15, 374 (1937).
6) Z. physiol. Ch. 232, 81 (1935).
7) H elv. 27, 1070 (1944).
8) Z. physiol. Ch. 270, 165 (1940).
9) Z. physiol. Ch. 280, 1 (1944).
r p
an der E a tte w iederholt u n d k o n n ten d abei das E rgebnis unserer Versuche am M eerschweinchen bestätigen , w ährend sie nachw eisen konnten, dass die E a tte einen viel grösseren A n teil an d-H istidin retiniert. W ie w ir sp ä te r zeigen w erden, k o n n ten auch w ir diese Ergebnisse von Holtz reproduzieren. Die U ntersuchungen über die Belastung m it d- u n d Z-Histidin stehen in innigem Zusam m enhang mit den F ü tte ru n g sv ersu c h en am erikanischer A utoren. Als E rste haben Cox u n d Bose1) gezeigt, dass E a tte n , die m it einer k ü n s t
lichen M ischung von A m inosäuren g e fü tte rt werden, auch d ann weiter fortkom m en können, wenn s ta tt Z-Histidin n u r d-H istidin zur
®8Üt Kost zugesetzt w ird. D ie Tiere beginnen d a n n auch zu w achsen, n u r etwas langsam er als diejenigen, die m it der n atü rlich en A m inosäure gefüttert w urden. In F o rtse tz u n g dieser U ntersuchungen haben dann litptc Schönheimer un d Rittenberg2) auch ü ber U ntersuchungen b erich tet, iddabeit nach denen bei gleichzeitiger V e rfü tteru n g von d-Hist.idin u nd N 15
(als A m m onium citrat) sich im K örpereiw eiss n u r N 15-haltige H istidin- sagenfr formen vorfinden sollen. E ndlich h ab en Totter u nd Berg3) E a tte n
mit histidinfreier D iä t g e fü tte rt u nd d- bzw. Z-Histidin der K ost zu- imil gefügt. Sie k o n n ten d an n zeigen, dass G ew ichtszunahm e e in tra t, Histidin ■ wenn H istid in in der D iä t e n th a lte n w ar. Bei der H ydrolyse des tsd-HI: Körpereiweisses fanden sie d ann n u r die Z-Eorm des H istidin s. Zur nspjtttl Ergänzung sei hier noch erw äh n t, dass ausserdem U ntersuchungen lebffll? über die V erw ertb ark eit verschiedener d- u n d Z-Aminosäuren durch s tierc Hefe durch gefü hrt w urden. Es sei hier auf die V ersuche von F. Elir-
beotafc lieh1) und Neubauer u n d From herz5) hingew iesen,
erlifti® Ü berblickt m an diese vorliegende L ite ra tu r, so ergibt sich daraus, anventl» dass system atische U n tersuchungen über das V erhalten von d-A m ino
säuren im tierischen O rganism us noch n ich t ausgeführt w urden. W ir flisaU1 haben uns daher die F rag e vorgelegt, wie sich der tierische Organism us nrjeii bei der p aren teralen V erabreichung verschiedener d-A m inosäuren ierifltet.fr verhält, und zw ar insbesondere d ann , w enn ihm solche d-Amino-
;If ioiü säuren w ährend längerer Zeit zug efü h rt werden. Als erste Amino- lliil säure w urde das V erhalten der A sparaginsäure u n tersu c h t. D azu jelr «tß war es zunächst notw endig, eine M ethode zur Isolierung der A sparagin- [(jeI1,imf säure aus dem H a rn auszu arb eiten .
md eiucbeD® M e t h o d e z u r I s o l i e r u n g d e r A s p a r a g i n s ä u r e a u s H a r n . J . Wolügemuth (1. c.) g ib t ein V erfahren zur Isolierung der Asparaginsäure aus dem H a rn an, indem aus dem m it B leiacetat geklärten H a rn die A sparaginsäure als K upfersalz isoliert wird.
b J . Biol. Chem. 68, 78 (1926).
2) J . Biol. Chem. 127, 385 (1939).
3) J . Biol. Chem. 117, 351 (1935) u nd 127, 375 (1939).
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5) Z. physiol. Ch. 70, 326 (1910).
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