C opyright 1946 by: Schw eizerische chem ische G esellschaft, B asel — Société suisse de Chimie, B âle — Società svizzera di chim ica, Basilea.
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4 2 . S te r in e a ls io n o id e S y ste m e I.
Über e in e V ita m in e D -B e stim m u n g sm eth o d e a u f C a rb en iu m salzb asis von H errn . S e h a l t e g g e r .
(20. X I I. 45.)
Bei der N achprüfung der wenigen bekannten chemischen Vitamin D-Bestim mungsmethoden zeigte es sich, dass es nicht mögüch war, m it der biologischen Methode übereinstimmende Resultate zu erhalten. Es schien daher in vieler Beziehung wünschens
wert, zu untersuchen, ob eine R eaktion zu finden ist, welche der biologischen Methode gleichwertig ist. Bis zu welchem Grade dies gelungen ist, sollen die nachstehend beschriebenen Farbreaktionen zeigen (vgl. vorläuf. M itt.1).
Von den früher beschriebenen Nachweis- und Bestimmungs
methoden der Sterine und Vitamine D 2_7) h a t nur diejenige von Brockmann und Chen8) als quantitative Vitamin D-Bestimmungs- methode Bedeutung erlangt. In der Folge ist diese Methode von verschiedenen Seiten 9_12) entsprechend den jeweiligen Verwendungs
zwecken modifiziert worden, doch blieb nach wie vor der R atten test die verlässlichste M ethode11).
Ausser den üblichen Bedingungen, wie Spezifität, Em pfindlich
keit usw. müsste eine leistungsfähige Methode im stande sein, biolo
gisch unwirksames, hauptsächlich durch Luftsauerstoff verändertes Vitamin D, von aktivem Vitamin D chemisch zu unterscheiden.
Ausgangspunkt für die vorhegende Vitam in D-Bestimmungs- methode waren die A rbeiten von G. Woher und I . Antener 4) und I. Scherrer5), sowie von L. Ekkert13). Diese Autoren fanden, dass
b H . Schaltegger, Exper. 2, 27 (1946).
2) G. E . Schwab, Ü berblick über die Chemie der Sterine und ihrer Verbreitung in der Natur. Zürich 1941.
3) W . H alden un d H . T zo n i, N aturw iss. 24, 296 (1936).
4) G. Woher und / . Antener, H elv. 22, 47, 511, 1309 (1939).
5) I . Scherrer, H elv. 22, 1329 (1939).
6) H. K ä g i und K . Miescher, H elv. 22, 683 (1939).
7) H. B rückner, Bioch. Z. 279, 346 (1934).
8) H . Brockm ann und Y . C. Chen, Z. physiol. Ch. 241, 129 (1936).
9) N . A . M ila s und R. Heggie, Ind. E ng. Chem. Anal. 13, 227 (1941).
10) L . K . W olff, Z. V itam inf. 7, 277 (1938).
n ) Ritsert, M erck's Jahresber. 1 9 3 8 ,2 7 .
12) E . H . Reerink und I . van N iek ert, V itam inf. 7, 269 (1938).
13) L. E kkert, Pharm . Zentralh. 69, 276 (1928).
H E L V E T I C A C H I M I C A A C T A .
alkoholische, m it Furfurol oder Benzaldehyd versetzte Sterin- lösungen, welche m it konz. Schwefelsäure unterschichtet wurden, charakteristische Farbringe aufwiesen. Es lag nun der Gedanke nahe, diese R eaktionen in homogener Lösung auszubilden, um dadurch k onstante Verhältnisse und reproduzierbare Färbungen zu erhalten.
Beim eingehenden Studium der Reaktionen zwischen Ergosterin
derivaten und konz. Schwefelsäure m it und ohne A ldehyde wurde festgestellt, dass diese R eaktionen auf C a r b e n i u m s a l z b i l d u n g beruhen, wie sie Dilthey und W izinger1), sowie Wizinger und Mit
arb eiter2)3) in einem anderen Zusam menhänge beschrieben haben.
Die Ü bertragung der Anschauungen von Wizinger auf das Sterin
gebiet führte nun zu ungeahnten experim entellen Möglichkeiten, über die später berichtet werden soll. Die Schwefelsäure bei den ob
genannten R eaktionen sowie auch bei den meisten Sterinreaktionen betrifft also nur die Bildung von Salzen; sie w irkt höchstens in u n te r
geordnetem Masse dehydrierend oder dehydratisierend. Die Schwefel
säure liefert lediglich das Anion und muss daher durch andere Säuren ersetzbar sein. Dies ist auch tatsächlich der Fall, wenn auch nur u n ter ganz bestim m ten Bedingungen. Das V itam in D oder auch andere ungesättigte Sterine sind im polarisierten Zustande sehr schwache Basen; sie bilden daher n u r m it starken Säuren, z. B.
Perchlorsäure, Salze. Mit Wasser erfolgt sofort Spaltung, denn dieses, als stärkere B ase4) verdrängt das organische K ation aus dem ionoiden Molekelverbande. Es sind daher alle ionisierenden Lösungs
m ittel, wie Alkohole, E ster, Ä ther usw. von vorneherein auszu- schliessen. F ü r die A usführung der R eaktion h a t sich deshalb Benzol und Eisessig als Lösungsm ittel und Perchlorsäure als anion-lieferndes Agens bisher am besten bew ährt. V ersetzt m an beispielsweise eine benzolisehe Lösung von V itam in D 2 und Vanillin in der W ärm e mit einer Perchlorsäure-Eisessigmischung, so erhält m an die genau gleiche blaue Färbung, wie sie Vanillin-Schwefelsäure m it D , in Alkohol gibt. Im ersten Fall liegt ein Carbenium perchlorat, im zweiten Fall ein Carbeniumsulfat vor. Die Lage der Schwerpunkte der beiden A bsorptionsbanden differiert um etw a 10 m g , und zwar liegt die Bande des Perchlorates bei 590 m/r und die des Sulfates bei etwa 600 m,M. Auf Zusatz von Methanol verschw indet die blaue F arbe und m an erhält eine schwach gelbe Lösung. Es gelingt nicht, das V itam in D m it Vanillin in Abwesenheit einer starken Säure auf irgend eine Weise zur R eaktion zu bringen. F ü r diese R eaktion ist also die Gegenwart einer Säure unerlässlich, wie Wizinger in einem anderen Zusammenhänge gezeigt h a t 3).
Ü W . D ilth ey und R . W izinger, J. pr. [2] 118, 321 (1928).
2) R . W izinger, J. pr. [2] 154, 1 (1939).
3) R . W izinger, J . pr. [2] 157, 129 (1941).
4) G. Schwarzenbach, Vortrag an der W intervers. d. Schw eiz. Chem. Ges. vom 25. 2. 45.
Volum en x x ix , Fasciculus n (1946). 287
Verwendet m an s ta tt Vanillin als Kondensationskomponente andere Aldehyde und s ta tt Vitam in D andere Sterine m it ionoiden C-Atomen1), so erhält m an die verschiedensten Farbeffekte (Tab. 1 und 2). Besonders die Reaktionen von Vitamin D m it aromatischen Aldehyden zeigen scharf ausgeprägte A bsorptionsbanden (Fig. 1).
F ü h rt m an hingegen die R eaktion nur mit Perchlorsäure ohne K on
densation m it Aldehyden durch, so erhält man für die Vitamine D 2 und D 3 nur stum pfe schwachgrüne F arbtöne, in grösseren K on
zentrationen stum pfblau. Es h a t sich gezeigt,' dass die grüne R eak
tionslösung aus einer blauen, dem Vitam in D-Carbeniumperchlorat, und einer gelben, der anionfreien Verbindung besteht. Durch Zusatz eines Überschusses von HC104 kann man das Gleichgewicht zugunsten des Carbeniumperchlorates verschieben; die Farbe der Lösung geht von Grün nach Blau über. Vergleicht m an die In ten sität des Vitamin- D-Vanillin-Carbeniumperchlorates m it derjenigen des Vitamin D- Carbeniumperchlorates, so fällt die intensive Farbe des ersteren auf, die ihre Ursache in der auxochromen W irkung des Vanillinrestes hat.
T a b e lle 1.
A ldehyde Ergosterin (2 mg) V it. D2 (0,2 mg) P hen ylacetald eh yd ... orange 498 gelb(grünl.) Z im m ta ld eh y d ... rot(or.) 470 530 blau 593, H aupt-
abs. im U R /R B e n z a l d e h y d ... gelb 450 (End) rot 530 p -T o ly l-a ld e h y d ... gelb(braun) 480 rot(v) 545 p -C u m in a ld eh y d ... gelb(braun) 480 rot 545 S a licy la ld eh y d ... rot(or.) 485 violett(bl) 585 o-M ethoxy-benzaldehyd . . . rot(braun) 505 blau(v) 565 p -O x y b e n z a ld e h y d ... rot(braun) 480 510 violett(blau) 560 A n isa ld eh y d ... rot(braun) 476 505 violett(blau) 565 V a n i l l i n ... rot 494 535 blau 590 I s o v a n i l l i n ... rot(v) 476 510 blau g Ä t h y l v a n i l l i n ... rot (2 M axima in
grün u. bl.)
blau 585 o - N it r o b e n z a ld e h y d ... orange(gelb) 500 rot(or) 550 m -N itr o b e n z a ld e h y d ... gelb (schwach) v io lett (schwach) p - N it r o b e n z a ld e h y d ... gelb (schwach) v io lett (schwach) p-D im ethylam ino-benzaldehyd brauner unlösl. vio letter unlösl.
Farbkörper Farbkörper
P ip e r o n a l... rot 520 blau g, nur schw a
che Bande 590 V e r a t r u m a ld e h y d ... rot 500 blau, sehr schwache
Bande 590 B e n z o y l-v a n illin ... braun(r) 500 rot 548 p -N itro-hen zoyl-van illin . . . . gelb(braun) hellrot 545 F u r f u r o l ... violett(braun)
schw. Bande 505
violett(r) 552
1) H . Schaltegger, E xper. 2, 27 (1946).
Fig. 1.
A bsorptionskurven einiger Sterin-carbenium perchlorate nach K ond en sation m it den A ldehyden CHO 1 bis 5.
K ondensiert m an Cholesterin, Ergosterin und V itam in D a der Reihe nach m it folgenden Aldehyden, welche in steigender Anzahl Auxochrome enthalten: Benzaldehyd, A nisaldehyd, Vanillin, 1,4- O xynaphtaldehyd und D im ethylam ino-benzaldehyd, so erhält man nicht nur stabile Carbeniumsalze, die auch gegen Alkohol beständig sind und worin das Perchlorat-Ion durch Anionen schwächerer Säuren ersetzt werden kann, sondern es nim m t auch der b ath o chrome Effekt z u 1). Geht m an z. B. vom 1,4-Oxybenzaldehyd zum 1,4-O xynaphtaldehyd über, so erfolgt im Falle V itam in D eine R o t
verschiebung der A bsorptionsbande um rund 100 m (u. Beim V ita
min D 2 und Dim ethylam ino-benzaldehyd beobachtet m an eine ro t
violette Färbung, die auf Zusatz von Alkohol nach B lau umschlägt m it Banden im äussersten R ot. Bei der rotvioletten F arb e handelt es sich wahrscheinlich um F arben zweiter O rdnung2). Bei den Kon-
J) H . Schaltegger, Exper. 2, 27 (1946).
2) R . W izinger, Organische Farbstoffe, F. D ü m m l e r s Verl., Bonn 1933.
V olum en x x i x , Fasciculus n (1946). 289
densationsprodukten m it schwächer positivierten Aldehyden führt Alkoholzusatz m ehr oder weniger rasch zur Entfärbung. Zu bemerken ist noch, dass Dimethylam ino-benzaldehyd sich bedeutend schwerer kondensiert als andere Aldehyde; dafür sind die K ondensations
produkte des ersteren gegen Hydrolyse bedeutend beständiger als die K ondensationsprodukte anderer Aldehyde. Es findet sich hier bestätigt, was Wizinger bei seinen positivierten Ä thylenen fand, dass die Zunahm e der H ydrolysenbeständigkeit parallel geht m it der Abnahme der Kondensationsfähigkeit der Aldehydkomponente. Dies ist wahrscheinlich auch der Grund, w arum m it aromatischen Ketonen bis jetzt noch keine K ondensationsprodukte erhalten werden konnten.
T a b e lle 2.
A ldehyde - y
f Sterine A nisaldehyd V anillin Cumin-
aldehyd Furfurol 4 -O x y -l- naphtaldeh.
Cholesterin ca. 2 0 mg
rosa-viol.
510
rosa-viol.
540
orange g 490
v io lett g 500 630
farblos
Choleste- non-(3)
Alle R eaktioiren sind negat E infl
iv. D ie Lösun uss der CO-Gr
*en sind farblo uppe.
s. N egativier.
D ihydro- v it. D 2 1
rot(v) 510 lila 530 rosa g v io lett gg 500 640
blau g 590
D2-Malein- säureaddukt
rot g 515 v io le tt g 530
orange violettrot 520
grün
Ergosterin braunrot 480 510
rot 500 550 gelb 450 500 v io le tt g 480 500
blau 600
Lumisterin rot(v) 490 520
rot(v) 490 550
gelb 490 v io le tt g 490 530
blau 600
Ergosterin b3
orange(r) 480 515
rotviolett 500 550
gelb 500 rotviolett g 490
blaugrün 600 Suprasterine rotbraun
480 550
braungrün 460 550 590
orange 460 550
v io lett g 550 620
grün 470 620
Pyrovit. D2 rosa rosa farblos rosa(v) 530 farblos
Isopyro- v it. D2
rot(v) rot(v) gelb blau gelbgrün
Vit. d2 blauviol.
L 565
blau L 590 rot L 550 violettrot L 550
grün L 650
Vit. D3 Die Farben sind die gleichen w le bei Vitam in D., O xydiertes
Vit. d2
braun(r) gg braun(v) gg or.braun gg grau(v) blau(v) g
Ergosterin
maleinsäure- addukt
Alle R eaktionen n egativ, die Lösungen sind farblos bis gelblich. Es feh lt das Carbenium-C-Atom.
Die R eaktionen wurden je nach der Farbstärke m it 1— 5 mg Substanz ausgeführt, die Vitamin D -R eaktion en nur m it 0,1 m g Substanz. D ie Zahlen geben die Lagen der Banden an. Abkürzungen (gelten auch für die anderen T ab ellen): (v) = violettstich ig, (r) = rot
stichig, (g) = grauhaltig, (gg) = stark grauhaltig, (L) = leuchtende Farbe.
Mit der Aufklärung der F unktionen der Säure und des Aldehyds bei diesen Sterinreaktionen h a t m an es nun in der H and, die b est
möglichen Bedingungen für eine q u antitativ e Bestim m ungsm ethode für V itam in D abzuleiten. D arüber hinaus bietet sich eine Fülle von Möglichkeiten, geeignete F arbreaktionen der einzelnen Sterin-,
Steroid- und G allensäurengruppen aufzufinden.
A b g r e n z u n g u n d S p e z i f i t ä t d e r n e u e n F a r b r e a k t i o n e n . Die R esultate aus zahlreichen Versuchen, von denen die w ichtig
sten in Tabelle 2 figurieren, zeigen bestim m te Gesetzmässigkeiten.
Es wurde früher bereits ang edeu tet1), dass sich die Sterine, je nach der Zahl der ionoiden C-Atome in drei Typen einteilen lassen.
T y p u s I: Alle Sterine, welche ausser der einen positivierten Äthylengruppierung keine weiteren Doppelbindungen oder aber nur solche enthalten, welche nicht in K onjugation zur koordinativen Lücke stehen, sind nur in sehr geringem Masse zur Carbeniumsalz- bildung und zur K ondensation m it arom atischen Aldehyden be
fähigt. Folgende Fälle wurden untersucht (der Carbenium-Kohlenstoff ist durch ein kleines Kreuz gekennzeichnet). Ü ber die F arbe der Reaktionen und die Lage der B anden orientieren die Tabellen 2 und 5.
h oA a Y H
H 0 / \ / * v x ° H
\ H
H O
HO
HO
C H , / \
H
T y p u s I I : Dieser Typus um fasst alle Sterine m it konjugierten Doppelbindungen m it zwei ionoiden C-Atomen, wie sie im Ergosterin und 7-Dehydro-cholesterin vorliegen. Der U nterschied in der Neigung, K ondensationsprodukte zu bilden, ist bei Typus I und I I sehr erheb
lich. D er Elektronenm angel an den A tom en ß und ß' bedingt eine starke Lockerung der Protonen, so dass leicht K ondensation mit
b H . Schaltegger, E xper. 2, 27 (1946).
V olum en x x i x , F asciculus n (1946). 291
Aldehyden eintreten kann. Wie gross der q u an titativ e Unterschied zwischen Typus I und I I in der Bildung von K ondensationsprodukten ist, zeigt Tab. 3. Die Reaktionen wurden wie im Yersuchsteil be
schrieben ausgeführt und photom etriert. (Für Ergosterin wurde 100 gesetzt.)
C « „ X H O / \ / * X H
T a b e lle 3.
Typus A ldehyde
fr Sterinderivate
O xynapht- aldehyd
Cumin- aldehyd
A n is
aldehyd Furfurol
II Ergosterin . . 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0
L um isterin . . 90 50 1 0 0 85
I
D2-Maleinsäure- add uk t . . .
36 8 16 19
Cholesterin . . 4 3 4 23
Die vertikalen Beihen beziehen sich immer auf ein und den
selben Aldehyd. W enn also der Um satz für die Sterine vom Typus I I 100% beträgt, so ist unter den gleichen Versuchsbedingungen der Umsatz für die Sterine vom Typus I nur 3—30%. Die Schwankungen der Ausbeuten sind auf die K onstitution und Eigenschaften der Sterine und Aldehyde zurückzuführen.
T y p u s I I I : Dieser um fasst alle Yitamine D und die Tachy- sterine. Diesen Verbindungen hegt ein System von drei konjugierten Doppelbindungen in offener K ette zu Grunde. Die Kondensations
geschwindigkeit der D 2- bzw. D 3-Carbeniumsalze m it aromatischen Aldehyden beträg t etwa das 10-fache derjenigen des Ergosterin- Carbeniumsalzes. Dies ist auch verständlich, denn es wirken drei negativierende Zentren (die Carbeniumatome 5, 8 und 10) auf die /9-Atome 6 und 7 ein. Fig. 2 zeigt die Intensitätsunterschiede der drei Sterintypen, hervorgerufen durch die unterschiedliche K on
densationsgeschwindigkeit m it 5 Aldehyden in einer Sterinkonzen
tration von 4
x10~5 Mol pro Liter = 16 y Sterin pro cm3 Reaktions
lösung.
c h2 I I c h3 U
A c < c * c *
! i II i II
ho
A ^ Y ? '
hoA / J V ”
i H H
E 1 cm 1,3 1,2 1,1 1.0
0 ,9 0,8 0 ,7 0.6 0.5 0,4 0 ,3 0,2 0,1
F ig. 2.
Inten sitätsunterschiede der Sterinreaktionen.
D ie In ten sitä t wurde bei allen Sterinen in der K onzen tration v o n 16 y /cm3 un d bei dem F ilter gem essen, w elches bei V itam in D2 das M axim um anzeigt.
Man erkennt daraus, dass die R eaktionen der V itam ine D gegenüber den R eaktionen der Sterine um ein Vielfaches em pfind
licher sind. Im weiteren erwies es sich, dass die R eaktionen der D-Vitamine m it den untersuchten Aldehyden in der Steringruppe in bezug auf die auftretende F arbe absolut spezifisch sind. Besonderes Gewicht wurde auf die Frage gelegt, ob biologisch unwirksames D 2 sich auch im chemischen Test anders als das V itam in D 2 verhalten würde. F ü r die Zerstörung der antirachitischen W irksam keit komm t in erster Linie der Sauerstoff in Frage.
Man liess eine benzolische Lösung v o n k rystallisiertem V itam in D2 (500 mg in 20 cm3
Benzol) 50 Tage im offenen Gefäss an der L uft stehen . N a ch dieser Z eit zeigte die Lösung keine D -R eak tion en m ehr, Tab. 4, F ig. 3.
T a b e lle 4 .
A ldehyd V itam in D2 O xydiertes V it. D2
ohne A l d e h y d ...
A n is a ld e h y d ...
V a n i l l i n ...
A ntim ontrichlorid . . . (n. Brockm ann)
schw ach grüngelb b la u v io lett (rein)
blau (rein) orange
braun stum pfes Braun stu m p fes Braun
orange
_LL_
. c * o
•t; ™ 3
i l
• Aj ^ Aj Q l ' n - s s di -3 cT51-1.1-L- Q 3 I X -a
11
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_£*» v k tj <o Q 3 -g x -a as S? ! "•-§ kJ Q O
Anisaldehyd Vanillin Cuminaldehyd Furfurol 4-O xy-l-
naphtaldehyd
Volum en x x i x , Fasciculus i l (1946). 293 E 1 cm
F ig. 3.
I. V ita m in 'D ä I !• O xydiertes V itam in D ä 1. 32 y ohne A ldehyd 1. 32 y ohne A ldehyd 2. S y m it A nisaldehyd 2. 32 •/ m it A nisaldehyd
Aus den A b sorptionskurven geh t hervor, dass offenbar keine K ondensation m it den Aldehyden stattgefu n d en h at.
R e a k t i o n e n e i n i g e r G a l l e n s ä u r e n . Wegen der geringen Löslichkeit der Gallensäuren in Benzol wurde die Reaktion in E is
essig ausgeführt. Um das Gleichgewicht stark zugunsten des Car- beniumsalzes zu verschieben, wurde ein grösser Überschuss an P er
chlorsäure zugefügt.
20 m g Substanz in 2 cm3 E isessig, dazu in der W ärme 10 Tropfen Perchlorsäure
reagens und 10 mg V anillin. N a ch 2 M inuten K ochen und 10 M inuten Stehenlassen notierte m an die Farbe. A uf M ethanolzusatz erfolgt Blaufärbung (Tab. 5).
T a b e lle 5 .
Gallensäuren ohne Vanillin m it V anillin M ethanolzusatz Tetranitro
m ethan Cholsäure
(3,7,12-T rioxy- cholansäure)
orange tief rot m it blauen A b lau f
farben
tief blau 590 m /i kochbeständig
farblos
D esoxycholsäure (3,12-D ioxy-
cholansäure
farblos bis gelblich
keine R eaktion (gelb)
farblos farblos
Apocholsäure (3,12-D ioxy- cholen-7-säure)
orange tief rot m it blauen A b lau f- färben
tiefb la u 5 9 0 m /i kochbeständig
braungelb
B ei der Cholsäure h a t offenbar W asserabspaltung stattgefun den unter Bildung eines ionoiden C-Atom s in Stellung 8. D aher die gleiche R eaktion w ie die Apocholsäuxe.
Die geschilderten Reaktionen lassen sich zur Identifizierung der drei Säuren heranziehen, wenn man zur Unterscheidung der Apochol- säure von der Cholsäure die Gelbfärbung der ersteren m it T etra
nitromethan berücksichtigt.
R e a k t i o n e n a n d e r e r V i t a m i n e . / 3- Ca r o t i n : 0,7 mg in
Benzol (Ausführung wie bei der D -Reaktion) ohne Aldehyd, stark
grauhaltige Blaufärbung m it sehr schwachen Banden bei 590 und
630 m u. Mit Vanillin und Perchlorsäure: tiefblaue graustichige
Lösung, schwache Bande bei 550
m / i .V i t a m i n A: Zur Prüfung gelangte eine V itam in A -Fraktion, welche nach der V erteilm ethode von Brockm ann1) aus einem Vitamin- A -K onzentrat am erikanischer H erkunft m it 850000 IE A /g erhalten wurde. Ü ber den Ausfall der R eaktionen gibt Tabelle 6 Auskunft.
T a b e lle 6 . B etr. CHO vgl. Tab. 7.
V itam in ohne CHO CHO 1 CHO 2 CHO 3 CHO 4 CHO 5
A -K onzentrat 1,5 m g = 1275 IE A
blaugrau keine B anden
v io le tt g 565 m/x
blau g 590 m/x
r o tv io lett gg keine Bande
blau gg keine Bande
blau (grün
stichig) 630 m/x D 2 100 y =
4000 E D
farblos v io le tt 570 m/x
blau 590 m/x
rot 545 m/x
v io le tt 550 m/x
grün 650 m/x Alle V it. D -R eak tion en zeigen fa st reine Spektralfarben; sie sind alle stark leu ch tend im G egensatz zu den V it. A -R eak tion en , w elche alle stark g ra u h a ltig sind
(optische W irkung der vielen ^-E lektronen).
Die V itamine B ^ B 2, C, E (d-a-Tocopherol, Rocke), K (Synkavit, Rocke) und Linol-Linolensäure zeigen keine nennensw erten R eak
tionen.
Zusammenfassend wird also festgestellt, dass ausser dem V ita
min A und den Carotinen keines der zahlreichen S terinderivate und Vitamine die gleichen F arbreaktionen wie die D -Vitam ine aufweisen oder deren In ten sität erreichen.
D ie V i t a m i n D - B e s t i m m u n g .
F ü r die qualitative und q uan titativ e E rm ittlu n g der D-Vitamine wurden aus 23 untersuchten Aldehyden (Tab. 1) die in der Tabelle 7 angeführten fünf Aldehyde ausgewählt.
T a b e lle 7 . Abgek.*)
Bezeichnung N am e des A ldehyd s
R k.-Farbe m it D2 bzw.
I>3
A max. **)' ca. m/x
V it. D y /c m3
CHO 1 A nisaldehyd (4-M ethoxy-
b e n z a ld e h y d )... b la u v io lett 570 40 CHO 2 V anillin (3-M ethoxy-4-
oxy-benzaldehyd) . . . blau 590 40
CHO 3 C um inaldehyd (4-Isopro-
pyl-benzaldehyd) . . . rot 545 40
CHO 4 Furfurol (oc-Furanaldehyd) ro tv io lett 552 40
CHO 5 4-O xy-l-n ap h tald eh yd grün 650 40
*) W ird im folgenden beibehalten.
**) E rm ittelt m it dem K leinspektrographen v o n Zeiss.
b H . B rockm ann, Z. physiol. Ch. 241, 104 (1936).
V olum en x x ix , Fasciculus n (1946). 295
Als Iden titätsreak tio n auf die Vitamine D eignen sich die Aldehyde CHO 1, CHO 2 und CHO 5, einerseits wegen der augen
fälligen Farbuntersehiede zwischen Vitam in D (blau bzw. grün) und den anderen Sterinen (rot bzw. blau) und anderseits wegen den scharf ausgeprägten Absorptionsbanden, welche noch in einem sehr grossen Überschuss anderer Sterine gut erkennbar sind. Bei An
wesenheit der 1000-fachen Menge Cholesterin ist die Bande von 0,1 mg V itam in I ) 2 in 5 cm 3 Beaktionslösung noch gut erkennbar.
Fig. 4 stellt die m it den fünf Aldehyden erhaltenen Eichkurven der Vitamin D 2-Reaktionen dar.
D iese E ichkurven wurden sta tistisch aus einer grossen Zahl von M essungen, welche m it krystallisiertem V itam in D2 ausgeführt wurden, erm ittelt. D ie Streuungen betrugen bis zu 20% . D er Grund hiefür lie g t in der N atu r der R eaktion selbst, z. T. bei der A u s
führung der B estim m ung. D iese wurde m öglichst einfach gestaltet. S ta tt Parallelbestim mungen m it ein und dem selben A ldehyd auszuführen, bestim m t m an den D -G ehalt mit allen 5 A ldehyden. Dadurch wird die M ethode absolut zuverlässig. Der m ittlere Fehler der Einzelm essung beträgt ±8%.
F ig. 4.
V itam in D — E ichkurven m it CHO 1 bis CHO 5.
Statt der hier dargestellten Eichkurven kann m an auch die Form eln der Tabelle 11 zur Ausrechnung benützen.
Bei der Ausführung der R eaktion is t darauf zu achten, dass m an nicht zu lange m it dem Photom etrieren w artet, w eil sich die Farblösungen ändern. E s bilden sich allmählich neue Farbstoffe aus, w elche durchwegs langwelligere A bsorption zeigen. Am B eispiel des Furfurols und des A nisaldehyds soll die R eaktion gezeigt werden. F ig. 5 gib t die A b sorptionskurven einer R eaktionslösung von V itam in D2 und Furfurol wieder, gem essen sofort nach Ausführung der R eaktion, dann nach einer Stunde und nach 4 Stunden. Man erkennt gu t den Abbau des ersten M axim um s bei 550 m / i und die A usbildung des neuen bei 655 m /i. B eim A n isald eh yd-D 2-Carbeniumperchlorat finden sich ganz ähnliche Ver
hältnisse (Fig. 6).
800 y '/.
E 1 cm
Furfurol-Vit. D2 Anisaldehyd-Vit. D2
F ig. 5. F ig. 6. B ildung des sekundären F arbstoffes.
Zusammenfassend sei auf die drei F aktoren hingewiesen, welche den q uan titativen Verlauf der R eaktion beeinflussen:
1. Gleichgewicht Carbeniumsalz gelbe Verbindung.
2. Kondensationsgeschwindigkeit zwischen D 2 und Aldehyd.
3. Bildungsgeschwindigkeit des sekundären Farbstoffes aus dem prim ären.
Demgemäss verhalten sich die fünf Aldehyde je nach ihren Eigen
schaften als positivierte Systeme einerseits und als K ondensations
kom ponenten anderseits entgegengesetzt. Dieser Antagonism us wirkt sich bei der D-Bestim mung günstig aus. E rh ä lt m an näm lich für einen oder zwei Aldehyde zu hohe W erte, dann findet m an für die anderen zu tiefe W erte und um gekehrt, je nachdem das verw endete Benzol oder der Eisessig m ehr oder weniger Spuren W asser enthalten, oder ob m an zur K ondensation kürzere oder längere Zeit kocht. Auch das A lter des Perchlorsäurereagenses spielt hiebei eine Rolle und dann natürlich auch die Zeit vom Ansetzen der R eaktion bis zum Photo- metrieren, wegen der Bildung des sekundären Farbstoffes. Alle diese F aktoren werden durch die fünf Aldehyde zum großen Teil kom pensiert.
D a die R eaktion im offenen Reagensglas ausgeführt wird, in welchem m an auch zum Kochen erhitzt, wurde der Fehler erm ittelt, der durch m ehr oder weniger starkes Verdampfen des Benzols e n t
steht. Der m ittlere Fehler der Einzelmessung (durch Auswägen be
stim m t) b eträgt bei Ausführung der Bestim m ung m it den 5 Alde
hyden ± 0,6 %.
Zur Ausschaltung des in B estrahlungsprodukten des Ergosterins
eventuell vorhandenen Tachysterins wurde die F ähigkeit desselben,
V olum en x x i x , Fasciculus n (1946). 297
D iensynthesen m it M aleinsäure-anhydrid einzugehen, benutzt. V ita
min D 2 und Tachysterin zeigen eine verschiedene Geschwindigkeit der A dduktbildung1). V itam in D 2 reagiert gegenüber Tachysterin viel langsamer m it M aleinsäure-anhydrid. Es wurde nun gefunden, dass das V itam in D 2 erst nach einstiindigem Kochen der benzoüschen Lösung m it M aleinsäure-anhydrid reagiert (Fig. 7).
7 --- in siedendem B e n zo l 2 - — — in X y lo l bei 720°
F ig. 7.
B ildung des V it. Do-Maleinsäure-adduktes.
D i s k u s s i o n d e r B e s t i m m u n g s m e t h o d e a n H a n d e i n i g e r a n a l y t i s c h e r D a t e n .
Als Beispiel für die analytische Verwendbarkeit der fünf Alde
hyde seien in der Tab. 8 die B esultate der Bestimmungen reiner
T a b e lle 8.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1
Vit. D
E in ge
setzte Menge in
gam m a
gefunden : E inzelw erte für
M ittel
wert m .F.
abs.
m .F.
% F.
bez.
Kol. 2
± %
CHO 1 ! i
CHO 2 CHO 3 CHO 4 CHO 5
I V ) 1 0 0 49,4 48,9 49,2 52,0 51,4 50,2 1,3 2 , 6 0,4
d2 50 51,9 54,4 51,1 48,2 50,2 51,1 2,3 4,5 2 , 2
d2 70 69,9 72,1 71,1 73,0 65,2 70,6 3,1 4,4 0,9
b2 50 49,0 49,5 49,7 50,0 50,5 49,7 0 , 6 1 , 1 0 , 6
D2 80 80,8 79,0 76,0 82,0 78,0 79,1 2,5 3,2 1 , 2
D2-acetat 50 50,0 48,5 52,0 47,0 46,7 48,8 2 , 2 4,6 2,4
d2- 50 52,5 47,3 50,2 50,5 45,3 49,2 2 , 8 5,6 1 , 6
d3- 30 33,2 28,3 32,0 32,5 33,3 31,7 2 , 0 6 , 1 5,7
d3- 60 58,9 57,5 60,0 64,0 64,0 60,9 3,0 4,9 1,5
Kolonne 11 gibt den relativen Fehler bezogen auf K ol. 2 (eingesetzt D 2).
*) Man findet natürlich nur die H älfte, näm lich D 2, die andere H älfte, das Lumi- sterin ist optisch und biologisch unwirksam.
1) A . W in d a u s, A . L üttringhaus und G. W eidlich, A . 492, 226 (1932).
V itam in D x-, D 2- u n d D 3-Lösungen angeführt. Die erhaltenen W erte beziehen sich immer auf die in 5 cm 3 Reaktionslösung enthaltene Menge V itam in D. Im Hinblick auf einen möglichst kleinen prozen
tualen Fehler, sowie in bezug auf die E xtinktionsm essung ist es daher am günstigsten, wenn m an die Bestim m ungen im K onzen
trationsbereich zwischen 50 und 80 y V itam in D pro 5 cm 3 Reaktions- lösung ausführt.
Zum Vergleich m it Tab. 8 findet m an in Tab. 9 A nalysenresultate von Ergosterinbestrahlungsprodukten, welche etw a folgende m ittlere Zusam mensetzung aufweisen: 50— 70% V itam in D 2, 35— 25% Lu- misterin, 10—15% Tachysterin und weniger als 1% Ü berbestrah
lungsprodukte und Ergosterin. Zur K ontrolle w urden von allen Vitam in D-Lösungen die biologischen Bestim m ungen im er
nährungsphysiologischen Laboratorium der Dr. A . Wander A.G. aus
geführt.
T a b e lle 9.
Präp.
Nr.
gefunden gam m a V it. D2 M ittel
w ert
m .F . abs.
m .F . CHO 1 CHO 2 CHO 3 CHO 4 CHO 5 %
19*) 67,0 68,7 67,4 74,0 62,5 67,9 ± 4 ,1 6 , 0
19*) 44,7 48,4 41,1 47,1 41,6 44,6 3,1 7,0
2 0*) 59,7 60,2 60,4 55,0 59,7 59,0 2,3 3,9
2 0*) 33,9 33,8 31,0 33,3 32,3 32,9 1 , 2 3,6
2 2 48,5 47,4 49,1 47,2 49,3 48,3 0,96 2 , 0
23*) 55,2 52,8 61,6 50,5 53,9 54,8 4,2 7,7
25 80,8 79,0 76,1 80,8 78,7 79,0 1,9 2,4
25 68,5 67,0 70,3 72,5 64,8 6 8 , 6 3,0 4,4
26 59,7 60,2 61,5 64,7 63,2 61,9 2 , 1 3,4
26 46,0 46,5 44,7 45,0 44,6 45,4 0,84 1,9
*) Ölige L ösungen m it 1000000 IE D pro Gramm, direkt im Öl bestim m t. D ie üb
rigen: alkoholische Lösung in B enzol übergeführt.
Z u s a m m e n f a s s u n g .
Ausgehend von den F arbringreaktionen von G. Wolter und Mit
arbeitern wurde erkannt, dass es sich bei dieser A rt von Reaktionen
um Carbeniumsalzbildung handelt. Auf dieser Erkenntnis beruht die
vorhegende V itam in D -Bestim mungsmethode. Es konnte gezeigt
werden, dass m an die Sterine analog den einseitig positivierten
Ä thylenen von Wizinger als verschieden stark positivierte Systeme,
je nach der Zahl der koordinativ ungesättigten C-Atome auffassen
kann. Die relativ geringe F arb stärk e der Sterincarbenium salze wird
durch K ondensation m it arom atischen Aldehyden um ein Vielfaches
erhöht. J e nach der Zahl und A rt der positi vier enden Auxochrome
kann die Aldehydkom ponente die verschiedensten optischen Effekte
hervorbringen. F ü r die V itam in D -Bestim mung w urden auf Grund
V olum en x x r x , Fasciculus n (1946). 299
der Eigenschaften der Carbem um-Kondensationsreaktionen fünf verschieden stark positivierte Aldehyde ausgewählt. Die E x tin k tionen der erhaltenen Färbungen werden m it dem Pulfrich’’sehen Stufenphotom eter gemessen.
Fräulein Prof. Dr. G. W oher danke ich für die H inw eise betreffend ihrer Farbring- reaktionen. D a s Stu dium der zahlreichen R eaktionen wurde sehr erleichtert durch den verw endeten K leinspektrographen v o n Zeiss, für dessen Benützung ich der W an d erstif
tung m einen b esten D an k ausspreche.
D ie A u sfü h ru n g der V itam in D -B estim m u ng.
R e a g e n t i e n u n d A p p a r a t e :
B e n z o l : Man koch t dieses 2 Stunden m it wasserfreiem Alum inium chlorid technisch am R ü ck flu ssk üh ler1). N ach dem A bdestillieren, W aschen m it W asser und Trocknen mit N atrium su lfat wird rektifiziert. D as so gereinigte Benzol zeigt m it den fünf Aldehyden keine B lindfärbungen.
E i s e s s i g : D er käufliche E isessig w ird durch Ausfrieren vom W asser b e fr e it2).
A l d e h y d e : vo n diesen ste llt m an sich 0,1-proz. L ösungen in Benzol her; vom Cuminaldehyd eine 0,15-proz. Lösung. D as Furfurol m uss auf jeden F all vorher destilliert werden. D er 4 -O x y -l-n a p h ta ld eh y d w ird nach der H erstellu n g 2) aus B enzol um kry- stallisiert. A lle A ldehydlösungen, m it A usnahm e der Furfurollösung sind m indestens
8 Tage bei tiefer Tem peratur haltbar. A lte A ldehydlösungen geben abgesehen vo n grau
farbigen B lindw erten in E isessig schwer lösliche K ondensationsprodukte, die beim Photo- metrieren n icht erfasst werden.
P e r c h lo r s ä u r e - R e a g e n s : Man se tzt zu einer M ischung vo n 2 cm3 E ssigsäure
anhydrid und 2,5 cm3 E isessig langsam unter Schü tteln 0,5 cm3 70-proz. Perchlorsäure (Kahlbaum). D ie schw ach gelbliche Lösung erwärmt m an unter Ausschluss von F eu ch tig
keit eine halbe Stunde im Ölbad von 95— 100°. D as Reagens ist braun gefärbt und raucht anfangs an der L uft. Man fü llt es noch warm in eine kleine P ipettenflasche. D as verjüngte Ende des Pipettenrohres is t so bem essen, dass 2 Tropfen des Reagens ca. 39 mg wiegen.
Zur Ausführung der R eaktion werden 2 Tropfen verw endet. E s ist gu t verschlossen m in
destens 8 Tage haltbar.
M a le i n s ä u r e - a n h y d r id : D ieses wird vor der Verwendung mit gleichen Teilen Phosphorpentoxyd 3) im Apparat F ig. 8, S. 300, destilliert.
M i k r o v a k u u m - d e s t i l l a t i o n s a p p a r a t u r (Fig. 8): Der von C. M a rb u rg 4) beschriebene Sublim ationsapparat wurde etw as m odifiziert, so dass er auch zur D estilla tion verw endet w erden kann. Für die D estillation der A ldehyde verw endet m an das Kölbchen a m it der Vorlage c; für feste Substanzen das K ölbchen b. Zur D estillation der A ldehyde beschickt m an das K ölbchen a m it reinem Quarzsand und tränkt diesen mit 0,5— 1 cm3 der zu destillierenden Flüssigkeit. Man destilliert im Vakuum (12 mm Hg) und bei W asserbadtem peratur. N ötigenfalls tau ch t m an das Vorlagekölbchen in kaltes Wasser.
R e a g e n s g l ä s e r : Für eine K onzentrationsbestim m ung werden entsprechend den 5 Aldehyden 5 Gläser 16/160 m m Grösse verwendet . Reagensgläser m it eher längerem H als sind vorzuziehen.
3) E . Clar, Arom atische K ohlenw asserstoffe, Verl. S p r i n g e r 1941, S. 8 8. 2) V a n in o , H and buch d. präp. Chemie, B d. II.
3) N . A . M ila s und R . Heggie, Ind. E ng. Chem. Anal. 13, 227 (1941).
4) C. M . M arburg, Am . Soc. 60, 509 (1938).
Q u a r z k ü v e t t e : ca. 6— 7 cm3 In h a lt, B estrahlungsfläche v o n ca. 10 cm 2. Durch einen Schliff lä sst sich die K ü v e tte m it einem V akuum hahn verbinden. Sie d ien t zum spezifischen N achw eis der P rovitam ine durch B estrahlung un d N ach w eis des gebild eten V itam ins D .
F ig. 8.
Mikro -Vakuum - D estillation sap p aratu r.
S t u f e n p h o t o m e t e r v o n P u lfr ic h : D ie für die B estim m u n g zu verwendenden Spektralfilter sind in Tab. 10 zusam m engestellt. Zum Photom etrieren verw end et man K ü v etten m it 1 cm Schichtdicke.
T a b e lle 10.
CHO A- 1 2 3 4 5
F ilter . . . S 57 S 57 S 55 S 55 S 6 6
D e r q u a l i t a t i v e N a c h w e i s d e r P r o v i t a m i n e u n d V i t a m i n e D . A lle vier P rovitam in e (E rgosterin, 7-D ehydro-cholesterin, L um isterin2, u n d Luini- sterin3), sowie deren Ester zeigen die gleichen Farbreaktionen. F ür den N achw eis verw endet m an die A ldehyd e CHO 1, CHO 2 und CHO S. Ü ber die auftretend e Farbe siehe Tab. 2.
D ie A usführung is t die gleiche w ie bei der q u a n tita tiv en D -B estim m u n g. E s lassen sich noch 0,1 m g P rovitam in e neben 10 m g C holesterin nachw eisen. D ie Sp ezifität un d E m p findlich keit kann m an bedeutend erhöhen, w enn m an die Sterinlösungen in einer flachen Q uarzküvette 10— 15 M inuten im V akuum der B estrahlung einer H anauer Quarzlampe a u ssetzt. N a ch der B estrahlung erh ält m an bei A n w esenheit v o n 10— 20 y P rovitam in pro cm3 R eaktionslösung die charakteristischen Färbungen für die V itam ine D . Liegen noch schw ächere Provitam in -Sterinm ischu ngen vor, so adsorbiert m an aus benzolischer Lösung an A lum iniu m oxyd I I I . D ie obersten Säulenbezirke en th a lten das Pro vitam in in der 4—6-fachen Anreicherung.
V olum en x x i x , Fasciculus n (1946). 301 A ls I d e n t i t ä t s r e a k t i o n a u f a l l e V i t a m i n e D (frei oder verestert) eignen sich die F arbreaktionen m it CHO 1, CHO 2 und CHO 5. Zur sichereren Identifizierung stellt m an die Lage der A bsorptionsbanden in einem kleinen H andspektroskop fest (Tab. 7).
B ei A n w esenheit von 100 y V itam in D2 in 5 cm3 R eaktionslösung erhält m an neben der 1000-fachen Menge ö l oder Sterine vom Typus I die charakteristischen D -R eaktionen.
Linol-Linolensäuregem ische (V itam in F) stören in der 100-fachen K onzentration noch nicht. Ü ber die Ausführung der R eak tion sei auf die q u antitative Bestim m ung verwiesen.
D i e q u a n t i t a t i v e B e s t i m m u n g d e r V i t a m i n e D .
A lle D -V itam ine oder deren E ster geben die gleichen R eaktionen und zeigen die gleichen In ten sitä ten für ein und denselben A ldehyd. Zur V itam in D -B estim m ung in Bestrahlungsprodukten des Ergosterins bzw. des 7-D ehydro-cholesterins verfährt m an folgenderm assen: D as bestrahlte Ergosterin wird zur A bscheidung der H auptm enge des unveränderten E rgosterins in A lkoh ol gelöst und nach A bkühlung auf 0° vom auskrvstalli- sierten Ergosterin abgesaugt. V on der alkoholischen V itam in D-Lösung entnim m t man eine Menge, w elche 0,2— 0,3 g Trockensubstanz entspricht, dam pft sie zur Trockne ein und evakuiert hernach 2 Stunden im E xsik kator. D en genau gewogenen Trockenrück
stand lö st m an m it Benzol auf das Volum en von 20 cm 3. 2 cm3 dieser Lösung versetzt man m it 0,1— 0,15 cm3 E ssigsäure-anhydrid, spült m it 5 cm3 Benzol nach und h ält das Gemisch eine halbe Stunde bei 75°. D as acetylierte Bestrahlungsprodukt wird zur In ak tivierung des even tu ell vorhandenen T achysterins m it 10— 15 m g frisch destilliertem M aleinsäure-anhydrid und 5 cm3 B enzol versetzt und 20— 30 M inuten auf 75° erwärmt.
Es ist daruf zu achten, dass die Lösung nicht ein du nstet, allenfalls ergänzt man m it Benzol auf das ursprüngliche Volum en. N ach der Adduktbildung kü hlt man ab und füllt m it Benzol auf 20 cm3 auf. D ie so erhaltene V itam in D -Lösung ist m eist noch zu stark, man verdünnt deshalb auf das 10-fache m it Benzol. V on der zuletzt erhaltenen Verdün
nung, w elche a /2 y bestrahltes Ergosterin pro cm3 en th ält, erm ittelt m an in einer V or
bestimmung den ungefähren V itam in D -G ehalt: 1 cm3 der Lösung, 1 cm3 CHO 5 und 1,5 cm3 Benzol erh itzt m an zum K ochen, fü gt 2 Tropfen Perchlorsäure-Reagens zu, kocht noch ca. 1 M inute und lässt bei Zim m ertem peratur erkalten; danach versetzt m an die trübe grüne Lösung m it 1,5 cm3 E isessig un d m isst die E xtin k tio n bei 1 cm Schicht
dicke gegen eine m it W asser gefüllte K ü v ette m it F ilter S 6 6. Aus der Tabelle 11 b e rechnet m an den V itam in D -G ehalt. Für die H auptbestim m ung w äh lt m an dann d ie
jenige Menge der letzten benzolischen Verdünnung, welche 50— 80 y V itam in D enthält, setzt 1 cm3 CHO 1 zu und ergänzt m it Benzol auf 3,5 cm 3. Man erh itzt zum K ochen, setzt 2 Tropfen Perchlorsäure-Reagens zu, kocht m axim al 1 M inute und lässt höchstens 10 Minuten bis zum E rkalten stehen. D anach ergänzt m an m it 1,5 cm3 E isessig auf 5 cm3
Volumen und photom etriert. Für die anderen 4 A ldehyde g ilt das Gleiche. D ie jeweils zu verwendenden Spektralfilter sind in Tab. 10 angeführt. Aus den abgelesenen E x tin k tionswerten berechnet m an nach F ig. 4 oder Tab. 11 die V itam in D -W erte.
T a b e lle 11.
Formeln zur Berechnung der V it. D -G ehalte aus den abgelesenen E xtinktionsw erten.
CHO-}. gam m a V it. D — k = abgelesene Extinktionsw erte
1 = 62,1 k + 2,5
2 = 106,5 k + 2,75
3 = 113,4 k + 2,5
4 = 69,3 k - 1,3
5 = 150,0 k + 1 0
B e s t i m m u n g d e s T a c h y s t e r i n s .
D ieses wird erh alten aus der Differenz der W erte: B estim m ung ohne M aleinsäure
anhydrid-B ehandlung m inus B estim m ung m it M aleinsäure-anhydrid-B ehandlung.
B e s t i m m u n g d e r V i t a m i n e D in ö l .
Liegen V itam in D -K on zen trate vor, w elche m indestens 500 0 0 0 IE D /c m3 = 12,5 mg V itam in D , en thalten, so kann m an das V itam in D direk t ohn e vorherige V erseifung b e
stim m en. H iefür ist es aber notw en dig, den B lin dw ert des Öles zu erm itteln. B ei n iedri
geren V itam in D -K onzentration en wird nach den V orschriften des Schw eiz. L ebens
m ittelbu ch es verseift un d das V itam in D im U nverseifbaren in der angegebenen W eise erm ittelt.
W issenschaftliche Forschungsabteilung
der Dr. A . Wander A.G. Bern, und L aboratorium für physikalisch-chemische Biologie der U niversität Bern.
4 3 . Über die R ed u k tion v o n D ip h e n y l-te tr a k e to n un d v o n B e n zo y l-fo rm o in
(S yn th esen in der 1,4-D ip henyl-bu tan-R eihe I I I 1)) vo n P a u l R u g g li f , H a n s D a h n un d P e t e r F r i e s .
(21. I. 46.)
W ährend die R eduktion von vic. D iketonen2) und vic. Tri- ketonen3) bereits ausführlich bearbeitet worden ist, fehlen noch entsprechende U ntersuchungen über die R eduktion von vic. T etra
ketonen. Um festzustellen, an welcher K etongruppe die R eaktion einsetzt, unternahm en wir Reduktionsversuche m it dem einfachsten Tetraketon der arom atischen Reihe, dem D ip hen yl-tetraketo n4) (I), dessen mögliche R eduktionsprodukte uns auch in anderem Zu
sammenhang interessierten.
D as T etraketon (I) lä sst sich aus dem ausführlich un tersu ch ten und ein fach zu
gänglichen B enzoyl-form oin6) (II) durch O xydation m it Salpetersäure leich t darstellen.
W ir verw endeten zu den w eiteren Versuchen das dabei en tsteh en d e Tetraketon-M ono- hydrat.
Bei Einw irkung von W asserstoff in Gegenwart von P latin als K ataly sator wird das T etrak eto n-H y drat leicht zum Benzoyl- formoin (II) reduziert. Dass die R eduktion an einer der m ittleren
b II. M itt. P . R uggli, P . Zeller, H elv . 28, 741 (1945).
2) R ed u k tion von B enzil: J . ü . P earl, W. M . D ehn, A m . Soc. 60, 57 (1938).
3) H ydrierung von D ip h en y l-tr ik eto n : L . A . Bigelow, H . G. R ule, W . A . P . Black, Soc. 1935, 83.
4) P . W . A benius, I I . G. Söderbaum , B . 24, 3034 (1891). V gl. A . H . B la tt, W . L.
H a w kin s, A m . Soc. 58, 1894 (1936).
5) P . W . A ben iu s, H . G. Söderbaum , loc. cit.
V olum en x x i x , F asciculus n (1946). 303
Carbonylgruppen einsetzt, stebt in Einklang m it der Reduktion von D iphenyl-triketon, die in erster Stufe Dibenzoyl-earbinol
. „ C6H5— CO— CHOH— CO— C6H5
liefert1).
Setzt m an die H ydrierung des Tetraketons nach Aufnahme von 2 H fort, so werden in viel langsamerer R eaktion alle verbliebenen Carbonylgruppen in einer Stufe reduziert und m an erhält 1,4-Di- phenyl-butantetrol (III). Mit B<mei/-Mckel an Stelle von P latin setzt diese H ydrierung erst oberhalb von 65° ein, geht dann aber rasch u n ter Aufnahme der berechneten Menge Wasserstoff vor sich.
In beiden Fällen lässt sich leicht in 20—25% Ausbeute ein einheit
liches D iphenyl-butantetrol vom Smp. .176° isolieren. Der Rest des Reaktionsproduktes besteht aus einem öligen Gemisch von v er
mutlich stereoisomeren2) D iphenyl-butantetrolen. Es gelang, durch langwierige fraktionierte K rystallisationen aus diesem Gemisch vier weitere Tetrole in sehr geringen Ausbeuten (aus 40 g Ausgangs
material nur wenige Zehntelgramm) zu isolieren und, m it einer
— durch M aterialmangel bedingten — Ausnahme, durch D erivate zu charakterisieren. D as Ergebnis ist in der folgenden Tabelle zu
sammengefasst, in der die Tetrole in der Reihenfolge ihrer Schmelz
punkte geordnet sind.
Tetrol Smp. A cetat Smp. A cetonid Smp.
B 249° 252° 89° (Di-ip.)
C 196° 170° 128° (M ono-ip.)3)
E 181° 175° 128° (M ono-ip.)3)
A 176° 1 2 1° 232° (Di-ip.)
D 163°
Die so gewonnenen Tetrole sind krystallographisch einheitlich und deutlich voneinander verschieden. W ährend die Tetrole A, B, C und E auch konstanten Schmelzpunkt aufweisen, kann der wahre Schmelzpunkt des Tetrols D noch um 1—2° höher liegen, da aus Materialmangel nicht bis zur völligen K onstanz des Schmelzpunktes umkrystallisiert werden konnte; immerhin ist auch diese Fraktion einheitlich krystallisiert und in ihrem K rystallhabitus deutlich von den anderen verschieden.
0 L . A . Bigelow, H . G. Rule, W . A . P . B lack, Soc. 1935, 83. P. Ruggli und W . F rey (unveröffentlichte Versuche) haben festgestellt, dass die H ydrierung auch m it Raney- Nickel gelingt und leicht an der Stufe des Dibenzoyl-carbinols aufzuhalten ist. Es wurden aber nur 40% an diesem Körper gefunden neben 10% an — durch Umlagerung en tstan denem — Phenacyl-b en zoat und 30% eines unlöslichen, nicht näher untersuchten Körpers.
2) Bei D iph en yl-b utan tetrol sind wie bei den H exiten 6 Stereoisomere m öglich, von denen 2 M esoformen und 4 R acem ate sind.
3) D as Gemisch der beiden auch im H abitus verschiedenen M ono-acetonide C und E zeigt deutliche Schmelzpunktserniedrigung.
Wie weit diese 5 K örper auch stereochemisch einheitlich sind, lässt sich nur schwer beurteilen. So ist z. B. vom H ydrobenzoin1) bekannt, dass das Gemisch der beiden Stereoisomeren einheitlich krystallisiert und scharf und ko n stan t bei 95° schm ilzt; erst nach häufigem U m krystallisieren trennen sich die Isom eren vom Smp. 138°
und 119—120°. F ü r eine so weitgehende Beinigung standen n u r bei Tetrol A genügende Mengen zur V erfügung; bei ihm blieb der Schm elzpunkt konstant. F ü r die Einheitlichkeit der anderen sprechen zwar ihre scharf und k o n stan t schmelzenden D erivate; doch genügt dies nicht, um das Vorliegen von M ischkrystallen völlig auszu- schliessen, zum al in dieser Beihe die Schm elzpunktserniedrigung von Gemischen (besonders zwischen sehr entfernt schmelzenden Kompo
nenten) ausbleiben kann.
c6h 5— c o — c o — c o — c o — c6h5 c6h 5— c o — c h o h — c o — c o — c6h5
C6H5-C H O H -C H O H -C H O H -C H O H -C6H5 C6H5-C O -C H O H -C H O H -C O -C6H5
D a das T etraketon (I) zunächst im mer zu Benzoyl-formoin (II) reduziert wird, unternahm en wir die weiteren Beduktionsversuche m it dieser Verbindung. Mit P latin als K ataly sator nim m t Benzoyl- formoin noch m ehr als 3 Mol W asserstoff auf. Aus dem Produkt liess sich ein nach der Analyse wasserstoffreicherer Tetra-oxykörper isolieren. Die erhaltenen D aten legen die Annahm e nahe, dass einer der Benzolkerne hydriert und l-Phenyl-4-cyclohexyl-butantetrol (IV) gebildet worden ist. Der K örper konnte durch sein A cetat charak
terisiert werden.
Die Einwirkung geringerer Mengen als 3 Mol W asserstoff auf Benzoyl-formoin führte dagegen nicht zu den erw arteten Zwischen
p ro d u kten2). U nterbricht m an vor Ende der H ydrierung, so findet m an im P rod uk t nur die entsprechende Menge unum gesetztes Ben
zoyl-formoin.
V on den als Z w ischenprodukten der H ydrierung m öglichen O xyketonen der Di- p h en yl-b utan -R eih e ist ausser Benzoyl-form oin (II) nur eines bekan nt: D ibenzoyl-äthylen - glykol (V). F u so n 3) erhielt diesen K örper aus P h e n y lg ly o x a l durch eine Pinakonsynthese m ittels M agnesium und M agnesium jodid in einem Benzol-Ä ther-G em isch. In w enig guter
b A . Breuer, T h . Z incke, A. 198, 152 (1879); C. P aal, B. 16, 637 (1883).
2) Im G egensatz zu D iph en yl-triketon, bei dem Bigelow, R ule u n d B la ck (loc. cit.) durch V ariation der K atalysator- und W asserstoffm engen verschiedene Z w ischenstufen isolieren konnten.
3) R. C. F uson, C. H . M c B u r n e y , W . E . H olland, Am . Soc. 61, 3248 (1939).
I I I
III V
C6H U— CH O H — CHOH— CHOH— CHOH— CeH, IV
V olum en x x r x , F asciculus 11 (1946). 305 A u sb eu te en tstan d hierbei eine M ischung der beiden Stereoisom eren, die er durch frak
tionierte K rystallisation trennte. D as niedriger schm elzende Isom ere en tstan d auch aus trans-D ib en zoyl-äth ylen durch H ydroxylierung m it K alium perm anganat1) oder W asser
stoffp eroxyd-O sm ium tetroxyd in tert. B u ta n o l2). D a bei dieser R eaktion stets A ddition der beiden H vd roxyle in cis-Stellun g erfolgt3), m uss in dieser niedriger schm elzenden Form das R acem at vorliegen. D em gem äss wäre das höher schm elzende Isomere die Mesoform.
W ir versuchten, durch O xydation des D iphenyl-butantetrols (III) zu O xyketonen zu gelangen, jedoch ohne Erfolg. Selbst die für die O xydation von H exiten usw. zu Zuckern empfohlenen milden Oxydationsm ittel griffen entweder die Substanz nicht an (Wasser - stoffperoxyd-Eisen(II)-sulfat4) oder w irkten, ebenso wie stärkere O xydationsm ittel, spaltend (Bleidioxyd-Salzsäure5)). Bei der Spal
tung wurde (neben unverändertem Ausgangsmaterial) stets nur Benzaldehyd gefasst; dieser Ort der K ettensprengung steht in E in
klang mit der 0 . Schmidt1 sehen Spaltungsregel6).
V ersuche, eines der gew ünschten O xyketone durch chem ische R eduktion von B en zoy 1-formoin zu erh alten, wurden zunächst m it Zinkstaub und E isessig unter verschie
denen Bedingungen durchgeführt. Man erhielt ein Gemisch von öligen und harzigen P ro
dukten, aus dem m an eine R eihe v o n krystallisierten Substanzen in kleinen M engen iso lieren k on nte; zur A ufklärung ihrer Struktur reichte das M aterial nicht a u s7). D iese Schwierigkeit, zu ein h eitlich en P rodukten zu kom m en, wird verständlich, wenn man bedenkt, dass B enzoyl-form oin in W irklichkeit nicht nur in der O xy-triketon-Struktur vorliegt (II), sondern dass ein tautom eres G em isch von (II) m it einer Cyclo-halbacetal- form (VI) un d E ndiolform en w ie (V II) anzunehm en is t 8).
OH OH
I I
C6H5— C = C— CO— c — c6h5 c6h5— c = c —c o — c o —c6h5
I ! I I
V I 0 --- V II OH OH
Zu einem Zwischenprodukt führte schliesslich die Einwirkung von Magnesium-Magnesiumjodid9) auf Benzoyl-formoin. Dieses re
agiert zunächst m it der ätherischen Magnesiumjodidlösung unter Abgabe von Jodwasserstoff säure und Bildung eines intensiv roten, öligen, in Ä ther unlöslichen Komplexes.
Ä hnliche K om plexe bilden sich aus B enzoyl-form oin (II) m it Magnesiumbromid, an der Oberfläche vo n A lum inium oxyd oder wasserfreiem Calciumchlorid10). B la tt11) hat
1) M ethode von F . Straus, A . Rohrbacher, B. 54, 69 (1921).
2) M ethode von N . A . M ilas, S . S u ssm a n , Am. Soc. 58, 1302 (1936).
3) N . A . M ila s, S . S u ssm a n , loc. c it .; siehe auch W . H ückel, Theoret. Grundlagen, Band I, S. 405 (1940).
4) H . J . Fenton u. M., Soc. 75, 1 (1899); K . Neuberg, Z. ph ysiol. Ch. 36, 219 (1902).
5) E . Fischer, B. 27, 1528 (1894).
6) 0 . Sch m id t, Z. physikal. Ch. [A] 159, 349 (1932); Z. E l. Ch. 39, 969 (1933).
7) D iese Körper sind in der D iss. P. F ries, B asel 1943, ausführlich beschrieben.
8) A . H . B latt, Am . Soc. 58, 1894 (1936); P . K arrer und M itarbeiter, H elv . 18, 273, 1140 (1935); 19, 829 (1936).
9) M ethode vo n M . Gomberg, W . B achm ann, Am . Soc. 49, 241 (1927).
10) A . W erner, B. 41, 1070 (1908), stellte fest, dass Benzoyl-form oin ein ausgeprägter Beizenfarbstoff ist. 71) Am . Soc. 58, 1894 (1936).
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