H e l v e t i c a
C h i m i c a A c t a
E D I T A A S O C I E T A T E C H I M I C A H E L V E T I C A
V O L U M E N X X I X
P A R S II
F A S C I C U L U S VI—VIII
PAG. 1 3 7 2 - 2 0 7 4
V E N E U N T BASILEAE ET GE NAVA E A P U D G E O R G & CO. LIBRARIOS MCMXLVI
FR. F I C H T E R , Präsi dent
R ealpstrasse 69, B a s e l . ,
E. B R I N E R,Vice- prés. , Lab. deC h im .tech n ., th éo r et d ’Electrochim ie de l’U niv., G e n è v e .
H. d e D I E S B A C H , In stitu t de chimie de l’U niversité, F r i b o u r g .
P* K A R R E R , Chem . Institut d e r U niversität,
Z ü ric h .
H. R U P E , Chem ische A nstalt d e r U niversität,
B asel.
L. R U Z I C K A , L abor, fü r organische Chem ie, Eidg. Techn. H ochschule, Z ü r i c h .
W . D. T R E A D W E L L , Lab. für anorgan.
Chem ie, E idg. Techn. H ochschule, Z ü r i c h .
Sekretär: E. GOETZ, Basel. — Secrétaire: J. DRUEY, Riehen-Bäle.
Schweizerische chemische Gesellschaft Basel.
Copyright 1946 b y : Société suisse de chimie, Bâle.
Società svizzera di chimica, Basilea.
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D ruck von E . B irkhäuser & Cie.. A. G., Basel.
fél;^6 ^ oniité de la S o ciété su isse de C him ie p ré s e n te ses c h a le u re u se s Cïtations à
Monsieur le professeur Hans Rupe
Bâle*1 C l a i r e d e la c h a ire de ch im ie o rg a n iq u e de l ’U n iv e rs ité de
^ ^ t e r a le 9 o c to b re 1946
so n 80me a n n iv e rs a ire ,
e t lu i exnv'
q u ’il a r 1116 sa p ro fo n d e g r a t it u d e p o u r les in e s tim a b le s services sa re m a rn^US * n o tr e so c ié té p e n d a n t p rè s d ’u n d em i-siècle, t a n t p a r m p n t a ^ Ua^ e a c tiv ité s c ie n tifiq u e q u e p a r son in la ssa b le d é v o u e -
Membr affaireS a d m n ir tr itiv e î.
r a ir e dès 1Q ^ notre so c ié té d e p u is sa fo n d a tio n e t m e m b re h o n o - d a c tio n §d P ré sid e n t en 1907— 1909, m e m b re d u c o m ité de
ré
organisé
]CS ^ ch im . a c ta d e p u is le u r c ré a tio n , le ju b ila ire a i '- .. . es arcbives e t a ré d ig é l ’h is to ire d es 40 p re m iè re s a n n é e s d e n o tr e société.a c tiv ité SC ^ ^m *nent s a v a n t p o u rs u iv re lo n g te m p s encore sa féconde . ’ e n t°u ré de l ’a d m ir a tio n e t de la re s p e c tu e u s e affectio n de se_ co egues et de ses a n c ie n s élèv es!
H . G o ld ste in ff . K u h n M . H a rtm a n n F r. Fichier
P. K a rrer L . C hardonnens
L a u s a n n e , B â le , Z u ric h e t F rib o u rg , le 1er o c to b re 1946.
D a s R e d a k tio n s k o m ite e h a t d ie grosse F re u d e , sein em M itg lied
Herrn Prof. Dr. Hans Rupe
E h r e n m itg lie d d e r S chw eiz. C hem . G ese llsc h a ft
d e r s e it d e r G rü n d u n g d e r H e lv . ch im . a c ta im J a h r e 1918 d em K o m ite e a n g e h ö r t , u n d d e r d u r c h sein e z a h lre ic h e n g ed ieg en en A b h a n d lu n g e n sow ie d u r c h sein e w o h ld u rc h d a c h te n R a tsc h lä g e in e n t s c h e id e n d e r W eise a u f d ie E n tw ic k lu n g d e r H e lv . ch im . a c ta e in g e w ir k t h a t , z u m s e lte n e n F e s t des
a c h tz ig s te n G e b u r ts ta g s am 9. O k to b e r 1946
sein e h e r z lic h s te n G lü c k w ü n sc h e u n d zu g leich d e n w ä rm s te n D a n k f ü r d ie h e r v o r r a g e n d e n D ie n s te a u sz u s p re c h e n , u n d d a b e i d er H o ffn u n g A u s d r u c k zu g e b e n , d a ss u n s e re m J u b i la r n o c h la n g e J a h r e d ie g e is tig e F ris c h e u n d L e b e n d ig k e it g e s c h e n k t w e rd e n , die ih m bis h e u te e ig e n s in d !
E . B r in e r H . de D iesbach Fr. F ichter P . K arrer L . R u z ic k a W . D . Treadivell
G e n è v e , F r ib o u r g , B a se l u n d Z ü ric h , d en 1. O k to b e r 1946.
86a
Société suisse de Chimie, Bâle — Società svizzera di chim ica, Basilea.
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179. Über G allensäuren und verw a n d te Stoffe.
41. M itteilung1).
Derivate der 3 a , 11,12-T rioxy-eholansäuren*) von E. B e r n e r und T. Re i e h s t e i n .
(20. I I I . 46.)
3 a-A ceto x y -lla,1 2 a -o x y d o -c h o lan sä u re-m eth y lester (IV )*)e)k)')2) liefert bei der D ru ck h ydrieru n g m it R aney-'Siekel in M eth an o le) ein Gemisch von 3a-A cetoxy-12a-oxy-cholansäure-m ethylester (I)*) u n d A cetyl-lithocholsäure-m ethylester (II). D er isom ere /J-Oxydo-ester (V)f)*) g ib t u n te r denselben Bedingungen*) ein Gemisch von (II) u n d (III). Aus dem 9,11-O xydo-ester (V I)C) endlich k o n n te neben u n v e rä n d e rte m A usgangsm aterial n u r wenig eines H y d rieru n g sp ro d u k tes erh alten werden, dessen S tru k tu r n ich t aufgek lärt i s t c). W ir p rü fte n n u n das V erh alten der drei O xyde (IV), (V) u. (VI) bei der H y d rieru n g m it P la tin o x y d in Eisessig3) ohne Ü berdruck. D abei ergab sich, dass aus (IV) wieder (I) u n d (II) u n d aus (V) w ieder (II) u n d (III) n eb st Spuren einer w eiteren S ubstanz erh a lte n w e rd e n 4).
(VI) blieb fa st vollständig u n v e rä n d e rt. W eiter u n te rsu c h te n w ir die E in w irk un g von kochender m ethanolischer H 2S 0 4 au f die 3 O x y d e 5).
Aus (IV) u n d (VI) Hessen sich nach B e a c e ty h e ru n g u n d c h ro m a to g ra p h i
scher T rennung n u r am orphe F ra k tio n e n gew innen6) 7). N u r der /3-Oxv- do-ester (V) gab ein Gemisch, aus dem sich zwei offenbar einheitüche Stoffe isolieren Hessen, deren A nalysenw erte auf T riol-m onoacetate der F orm el C27H 440 6 stim m ten. MögHcherweise Hegen 2 Isom ere (X Ia )
J) 40. M itt. vgl. M . Sorkin, T . Reichstein, H elv. 29, 1218 (1946).
*) Bezeichnung der räum lichen Stellung der S ubstituenten an den R ingen C u nd D entsprechend H elv. 29, 1218 (1946). Die m it *) bezeichneten Stoffe sind dabei anders form uliert als in den Originalabhandlungen.
2) Alle m it B uchstaben bezeichneten L ite ra tu rz ita te siehe bei den Form eln.
3) U n te r diesen Bedingungen sind andere Oxyde der Sterinreihe inzwischen m it E rfolg h y d riert worden. Vgl. L. Ruzicka, A . G. M uhr, H elv. 27, 503 (1944); PL A . Plattner, T h . Petrzilka, W. Lang, Helv. 27, 513 (1944).
4) Die H ydrierung von (IV) m it P t 0 2 in Eisessig u nd wenig HCl ist von Kendall u. M itarb .’1) beschrieben w orden; dabei w urde (I) isoliert.
5) Ähnliche Versuche vgl. f).
6) Dagegen gab der in 3-Stellung nich t substituierte 9 ,11-Oxydo-cholansäure- m ethylester u n te r diesen B edingungen ein k ryst. P ro d u k t (H. B . Alther, T . Reichstein, H e lv .'26, 492 (1943)).
7) N ach Behandlung von (IV) m it H 2S 0 4 in Eisessig bei 25° gelang es Gallagher u.
Longk), sowie Long u. Gallagher1), krystallisierte P rodukte zu erhalten. W allis u. M itarb.s) k onnten auch aus (IV) und (VI) m it flüssigem H F einheitliche R eaktionsprodukte ge
winnen.
Volumen x x ix , Fasciculus v i (1946). 1375
u n d ( X l b ) 1) v o r 2) oder tlm lag eru n g sp ro d u k te. Die schlechte A usbeute, die zudem schwer rep ro d uzierbar w ar, v erhin d erte jedoch eine weitere U n tersuchung.
W ir w an d ten uns d a ra u f der H ydrox ylierun g von 3a-Oxy- c h o le n -(ll)-sä u re (V III) m it K M n 0 4 z u 3). W ie sich aus folgenden R e su lta te n ergibt, e n ts ta n d dabei zur H au p tsach e (X II) und wenig (XV). Z ur T ren nu ng w urde das rohe O x y d ationsp rodukt m it Diazo- m e th a n m eth y lie rt u n d das Gemisch der M ethylester chrom ato- g rap h ie rt. W ir erhielten als H a-uptprodukt den am orphen Dioxy- k eto -ester ( X I I I ) n). A cetylierung m it A cetan h y d rid -P y rid in gab d a ra u s ein k ry st. D ia c eta t vom Sm p. 153°, das sich nach Analyse, Sm p., D reh un g u n d M ischprobe als 3a, lla-D iacetoxy-12-keto-cholan- säu re-m eth y lester (X IV )n)p) erwies. I n geringer Menge lieferte die C hrom atographie einen k ry st. T rioxy-m ethylester, der nach Smp., D reh un g u n d M ischprobe m it 3a, lla,1 2 a-T rio x y -ch o lan säu re-m eth y l- e ster (X V I)
p)identisch w ar. D urch A cetylierung bei 18° gab er eben
falls ein D ia c eta t (Sm p. 1290)4), dem Form el (X V II) zukom m t, da es sich d u rc h D eh yd rieru ng m it C r0 3' g la tt in (X IV ) überfüh ren liess.
E in e Säure der Form el (XV) hab en Marlcer u n d Mitarb.*) beim E rh itz e n von 3 a, 12^-D ioxy-l 1-keto-cholansäure (entspr. Form el (X ))5) m it H y d ra z in u n d N a triu m ä th y la t erhalten. D a ausser dem Smp.
(136°, Zers.) keine D a te n angegeben u n d auch keine D erivate be
schrieben sind, h ab en wir die H erstellung nach ihrer Vorschrift w iederholt, lediglich die A u farb eitu n g w urde etw as m odifiziert. Auf die W iedergabe dieser V ersuche k an n verzich tet werden, da kürzlich von Gallagherq) sowie von W intersteiner u n d M itarb. p) sehr sorg
fältige U ntersuch un g en ü ber diese R eak tio n ausgeführt w urden.
D a n a c h e n ts te h t d abei ein Gemisch, das neben anderen Stoffen alle vier raum isom eren 3 a ,ll,1 2 -T rio x y -c h o la n sä u re n e n th ä lt. W ir haben uns au f die Isolierung der 3a, lla ,1 2 a -S ä u re (XV) beschränkt. Der M ethy lester (X V I) schmolz bei 133— 135°, w ar nach M ischprobe id en tisch m it dem aus (V III) m it K M n 0 4 erhaltenen Trioxy-ester u n d gab bei der A cetylierung bei 18° ein D iacetat (X V II) vom Smp.
1) D urch die A rbeiten von Gallagherp sowie Wintersteiner u. Mitarb.P) sind alle vier raum isom eren 3a, 11,12-Trioxy-cholansäuren bekannt.
2) D a bei der A ufspaltung von Oxyden die Bildung von trans-Verbindungen begün
stig t ist, wäre am ehesten m it dem Vorliegen von 11a, 12/3- und 11(3,12a-Derivaten zu rechnen. E s ist a l l e r d i n g s fraglich, ob letztere u n ter den angew andten Bedingungen be
ständig sind.
3) Ü ber ähnliche Versuche m it C holen-(ll)- und 3-K eto-cholen-(ll)-säure vgl.
H . Reich, Helv. 29, 581 (1946). Mit K M n04 in Eisessig erhielten Wallis u. M itarb.8) aus (IX ) das Oxyd (IV).
4) Wintersteiner u. Mitarb.P) erhielten u n ter ähnlichen Bedingungen aus (XVI) ein T riacetat. Das R ohprodukt war aber ein Gemisch wie bei uns. Es ist offenbar Zufall, dass sie das Tri-, wir das D iacetat isolierten.
5) Die Feststellung der richtigen Form el erfolgte durch Gallagher<*), vgl. auch Wintersteiner u. Mitarb.P).
D ie Form ulierung der Stoffe (V II) und (X I) ist unsicher.
A oO '
I F . 128° [ + 66] a)°
/ \ / COOCH3
I I I F. 146° [ + 71]d) [ + 56 C hf]r)
.
/ COOCH, A oO'
IV F. 140° [ + 5 3 ] e)k) ') ‘) s)
HO ,
ho \ A _ A
H O '
V F . 154° [ + 62]f) V I F. 121° [ + 44]c) s)
HO
V lla u. V H b (nicht isoliert) V III (R = R '= H) \ X F . 157° [ + 6 4 A1]s)p)Q) F. 165° [ + 33 Al]e)')
Acetyl.
AcO*
IX ( R - A c ; R '= C H 3) F. 120° [+ 52]e)m)
COOCH, R O '
COOR'
X Ia F . 101° [+ 84]h) X I I (R = R /= H )F .197°[ + 66Al]n) XV (R = R + :H ) F .1310 (Z )17301)p)Q)H) X lb F. 150° [+ 71]h) X I I I (R = H ; R '= C H 3) X V I (R = H ; R '= C H 3)
am orph11)») F . 133° [+ 1 6 Chf]P)») X IV (R = Ac; R '= C H 3) X V II (R = A c; R '= C H 3) F. 129°»)
F. 153° [ + 3 4 C hf]“)P)»)
Ac = CH3CO— . Die Zahlen in eckigen K lam m ern geben die a u f ganze Grade auf- oder a b gerundete spez. D rehung fü r N a-L icht in folgenden Lösungsm itteln an : ohne Angabe = Aoeton, Al = Alkohol, Chf = Chloroform.
Volumen x x ix , Fasciculus vi (1946). 1377
129— 130°. Bei der M ischprobe m it dem gleich schm elzenden, aus 0 I I I ) m it K M n 0 4 erh alten en P rä p a ra t zeigte es keine Schm elz
punktsern iedrigu n g. Die O xyd atio n m it 0 rO 3 gab wieder (X IV ).
D a die O x y d atio n von (V III) m it K M n 0 4 zur H au p tsach e (X II) u nd n u r wenig (XV) liefert, ist es m öglich, dass die kürzlich von R eich1) beschriebene, aus C ho len -(ll)-säu re m it K M n 0 4 erhaltene Säure ebenfalls eine lla -O x y -1 2 -k e to -c h o la n sä u re u n d nicht wie a n genom m en eine 1 1 ,12-D ioxy-cholansäure d arstellt.
W ir v ersu ch ten schliesslich noch die H y d rieru n g von (X) sowie diejenige von (X IV ) m it P t 0 2, erhielten aber in beiden Fällen das A u sgangsm aterial z u rü c k 2).
D er eine von uns (E. B.) d a n k t der Ciba A . G. fü r ein Stipendium , das ihm die A us
führung dieser A rbeit erm öglichte.
E x p e r i m e n t e l l e r T e i l .
(Alle Schm elzpunkte sind auf dem Kofler-Block bestim m t un d k orrigiert; F ehler
grenze ± 2°. W enn nichts anderes bem erkt, erfolgte Trocknung der Substanzproben zur Analyse im H ochvakuum 2 S td. bei 80°, zur spez. D rehung bei 60°. Ü bliche A ufarbeitung b ed eu te t: E indam pfen im V akuum , Aufnehm en in Ä ther, W aschen m it verd. HCl, N a2C 0 3 u. W asser, Trocknen über N a2S 0 4 u. Eindam pfen.)
H y d r i e r u n g v o n
3 a - A c e t o x y - l l / 3 , 1 2 ^ - o x y d o - c h o l a n s ä u r e - m e t h y l e s t e r (V)*) m i t P t 0 2.
100 mg (V)f) vom Sm p. 155—156° in 7,5 cm 3 Eisessig m it 18,7 mg P t 0 2 • H 20 19 S td. bei 17° ohne D ru ck h y d riert. T otalaufnahm e inkl. event. Verluste 11,6 cm 3 (ber.
T . Reichstein, M . Sorkin, H elv. 25 , 797 (1942).
8. Bergström, G. A . D. Haslewood, Soc. 1939, 540.
E . Seebeck, T . Reichstein, H elv. 26, 536 (1943).
A . Lardón, T . Reichstein, Helv. 26, 586 (1943).
J . Press, T . Reichstein, H elv. 25, 878 (1942).
G. H . Ott, T . Reichstein, H elv. 26, 1799 (1943).
B . B . Longwell, O. Wintersteiner, Am. Soc. 62, 200 (1940).
Vgl. exper. Teil dieser A rbeit.
R . E . M arker, A .C .S h a b ic a , E . M . Jones, H . M . Crooks, J r ., E. L. Wittbecker, Am. Soc. 64, 1228 (1942).
T . F . Gallagher, W. P . Long, J . Biol. Chem. 162, 495 (1946).
B . F . M cK enzie, W. F . M cGuckin, E . C. Kendall, J . Biol. Chem. 162, 555 (1946).
L. L. Engel, V. R. M attox, B . F . M cKenzie, W. F . McGuckin, E . C. Kendall, Chem. 162, 565 (1946).
T . F .Gallagher, V. P . Hollander, J . Biol. Chem. 162, 533 (1946).
T . F . Gallagher, W. P . Long, J . Biol. Chem. 162, 521 (1946).
O. Winter steiner, M . Moore, K . Reinhardt, J . Biol. Chem. 162, 707 (1946).
T . F. Gallagher, J . Biol. Chem. 162, 539 (1946).
0 . Winter steiner, M . Moore, J . Biol. Chem. 162, 725 (1946).
E . H . Hicks, J r ., C. J . Berg, E . S . Wallis, J . Biol. Chem. 162, 645 (1946).
W. P- Long, T . F . Gallagher, J . Biol. Chem. 162, 511 (1946).
H . Reich, Helv. 29, 581 (1946).
Die H ydrierung von ll-O xy-12-keto-cholansäure-m ethvlester m it Aaney-Nickel un ter D ruck beschrieben J . Barnett, T . Reichstein, Helv. 21, 926 (1938). Aus Analogie- ,rründenq) h a t es sich bei dem erw ähnten Stoff jedoch vielleicht um einen 12-O xy-ll-
“ eto-cholansäure-m ethylester gehandelt.
87 J . Biol
für 1 Mol + P t 0 2 9,5 cm 3). N ach F iltra tio n u nd üblicher A ufarbeitung w urde wie frü h er1) a n 4 g A120 3 chrom atographiert. A n reinen K ry stallen w urden e rh a lte n : 6 mg A cetyl- lithoeholsäure-m ethylester (II), Smp. 130—132° (Mischprobe), 6 mg A usgangsprodukt (V), 26 mg 3a-A cetoxy-ll/S-oxy-cholansäure-m ethylester (III), Smp. 147—149° (M ischprobe) u n d aus den schw erst eluierbaren A nteilen 3 mg K ry stalle, Smp. 102—105°.
H y d r i e r u n g v o n
3 a - A c e t o x y - l l a , 1 2 a - o x y d o - c h o l a n s ä u r e - m e t h y l e s t e r (IV)*) m i t P t 0 2.
100 mg (IV)e), Smp. 143—144°, in 7,5 cm 3 Eisessig m it 21,3 mg P t 0 2 • H 20 22 Std.
bei 17° h y d riert. T otalaufnahm e inkl. event. V erluste 13 cm 3 (ber. fü r 1 Mol + P t 0 2 10 cm 3). A ufarbeitung wie oben gab a n reinen K ry stallen : 4 mg (II), Smp. 130— 132°
(Mischprobe), 30 mg unverändertes A usgangsm aterial (IV), Smp. 142— 144° (Mischprobe) sowie 14 mg 3a-A cetoxy-12a-oxy-cholansäure-m ethylester (I)a), Smp. 126—127° (Misch
probe).
V e r s u c h z u r H y d r i e r u n g v o n
3 a - A c e t o x y - 9 , l 1 - o x y d o - c h o l a n s ä u r e - m e t h y l e s t e r (VI) m i t P t 0 2.
122 mg (VI)C), Smp. 116—117°, in 8 cm 3 reinstem Eisessig m it 24 mg P t 0 2 • H aO 46 Std. bei 17° h y d riert. N ach x/2 Std. w aren 5,95 cm 3 H 2 aufgenom m en (für das P t 0 2 ber. 5,9 cm 3); d an n betrug die G asaufnahm e n u r noch 0,2 cm 3 pro Stunde (V erluste).
A ufarbeitung wie oben, aber ohne C hrom atographie gab sofort K rystalle, Smp. 116—
117°; Mischprobe m it A usgangsprodukt (VI) ebenso.
3,786 mg Subst. gaben 9,942 mg C 0 2 un d 3,201 mg H 20 C27H 420 5 (446,61) Ber. C 72,61 H 9,48%
Gef. „ 72,62 „ 9,59%
E i n w i r k u n g v o n H 2S 0 4 in M e t h a n o l a u f d a s ß - O x y d (V)*).
285 mg 3a-A cetoxy-ll/?,12/i-oxydo-cholansäure-niethylester (V) m it 17 cm 3 eines Gemisches von 9 G ewichtsteilen M ethanol u n d 1 G ewichtsteil konz. H 2S 0 4 2 1/2 Std. u n te r Rückfluss gekocht. Zugabe von W asser, A usschütteln m it Ä ther. M it H 20 gewaschene Ä therlösung m it etw as D iazom ethan nachm ethyliert u. eingedam pft. R ü ck stan d m it 1,5 cm 3 abs. P y rid in un d 0,9 cm 3 A cetanhydrid über N ach t bei 18° stehen gelassen. Die übliche A ufarbeitung gab 290 mg R ohprodukt. Aus Ä th er-P etro läth er 65 mg K rystalle, Smp. 126—150°. Diese für sich an 3 g A120 3 chrom atographiert. B enzol-P etroläther (3:7) eluierte zunächst 8 mg vom Smp. 96—100°. Es folgten Gemische, d a n n m it abs. Benzol sowie Benzol-Äther 25 mg vom rohen Smp. 146—149°. Die M utterlauge (225 mg) w urde für sich a n 8 g A120 3 chrom atographiert. Die ersten m it B enzol-Petroläther (1: 9) eluierten Anteile gaben K rystalle vom rohen Smp. 127—135°, die n ich t w eiter u n tersu ch t w urden.
Es folgte (m it B enzol-Petroläther 3:7) viel Öl, d an n m it demselben Gemisch sowie m it reinem Benzol noch 34 mg vom rohen Smp. 96—100°.
N ach U m krystallisieren aus Ä th er-P etro läth er w urden erh alten : 28 mg (X I a), Smp. 100,5—101,5°, farblose N adeln, [a]j5 = + 8 4 ,3 ° ± 2° (c = 1,198 in Aceton),
12,004 mg Subst. zu 1,0020 cm 3; 1 = 1 dm ; = + 1,01° + 0,02°
3,780 mg Subst. gaben 9,667 mg C 0 2 und 3,196 mg H 20 C27H 440 6 (464,62) Ber. C 69,79 H 9,55%
Gef. „ 69,79 „ 9,46%
sowie 19 mg (X I b), farblose N adeln vom Smp. 149,5— 150,5°; [a ] j| = + 7 1 ,1 ° ± 2 ° (c = 1,421 in Aceton).
14,235 mg Subst. zu 1,0020 cm 3; 1 = 1 dm ; a 1^ = + 1,01° + 0,02°
3,767 mg Subst. gaben 9,654 mg C 0 2 und 3,198 mg H 20 C27H 440 6 (464,62) Ber. C 69,79 H 9,55%
Gef. „ 69,94 „ 9,50%
T etranitrom ethanprobe bei (X I a) u n d (X I b) negativ.
Volumen x x ix , Fasciculus v i (1946). 1379 E i n w i r k u n g v o n H 2SÖ 4 i n M e t h a n o l a u f d a s a - O x y d (IV)*).
97 mg 3a-A cetoxy-lla,12a-oxydo-cholansäure-m ethylester (IV)e) m it 0,4 cm 3 einer Mischung gleicher Gewichtsteile H 20 un d H 2S 0 4 un d d an n m it so viel M ethanol versetzt, dass in der Siedehitze eben klare Lösung ein trat. 2 Std. u n ter Rückfluss ge
kocht. A ufarbeitung wie im vorigen Versuch gab bei der Chrom atographie aus Benzol- P etro läth er-E lu aten 3 mg K rystalle, Smp. 138—140°, un d aus w eiteren B enzol-Petrol
äther- sowie B enzol-Eluaten noch 1,5 mg, Smp. 116—136°. Auf die weitere U ntersuchung w urde verzichtet.
E i n w i r k u n g v o n H 2S 0 4 in M e t h a n o l a u f d a s 9 ,1 1 - O x y d (VI).
100 mg 3a-A cetoxy-9,ll-oxydo-cholansäure-m ethylester (VI)C) vom Smp. 116—117°
wie bei (IV) angesetzt u nd 1 Std. gekocht. A ufarbeitung wie bei Versuch m it (V), R oh
p ro d u k t krystallisiert. N ach Chrom atographie 72 mg A usgangsm aterial, Smp. 115—117°
(Mischprobe). In einem 2. Versuch w urde 2 Std. gekocht. 16% Ausgangsm aterial re generiert, R est Sirup.
E i n w i r k u n g v o n K M n 0 4 a u f 3 a - O x y - c h o l e n - ( 1 1 ) - s ä u r e (V III).
0,6 g 3a-O xy-cholen-(ll)-säure (V III)e), R ohprodukt vom Smp. 130—160°, g e
wonnen durch alkalische Verseifung von reinem 3a-A cetoxy-cholen-(ll)-säure-m ethylester (IX ) vom Sm p. 120— 122°e), in 16,5 cm 3 0,1-n. wässriger N aO H ( = ca. 1,06 Mol) gelöst, bei 24° u n te r R ü h ren innerhalb von 2 Std. 22 cm 3 1-proz. K M n04-Lösung zugetropft u.
bis zur E n tfärb u n g stehen gelassen. Auf 0° abgekühlt, m it H 2S 0 4 angesäuert, m it N a H S 0 3- Lösung versetzt, bis M n 0 2 gelöst, d ann vorsichtig K M n 0 4-Lösung zugetropft, bis eben braune W olke bestehen blieb. Kongosaure Lösung mehrmals m it to ta l 3 1 Ä ther ausge
sch ü ttelt. M it wenig H 20 gewaschene u. über wenig N a2S 0 4 kurz getrocknete Lösung etw as eingeengt, m it ätherischer D iazom ethanlösung versetzt u. nach 15 Min. eingedam pft.
R ü ck stan d (650 mg) a n 22 g A120 3 chrom atographiert. B enzol-Petroläther (6 Fraktionen) eluierte 100 mg Sirup. Die erste m it reinem Benzol erhaltene F rak tio n (Nr. 7) (65 mg) gab aus Ä th er-P etro läth er 50 mg K rystalle, Smp. 100— 105° (siehe unten). W eitere 5 m it Benzol sowie Benzol-Äther eluierte F rak tio n en (Nr. 8— 12) gaben 309 mg am orphes M aterial (siehe unten). Die folgenden m it reinem Ä ther abgelösten F raktionen (Nr. 13 u.
14) (67 mg) gaben aus wenig Ä ther 57 mg rohen Trioxyester (XVI) vom Smp. 76—85°
(H y d ra t ?) (siehe unten). Mit Ä ther-M ethanol liess sich aus der Säule nur noch eine Spur Öl eluieren.
Die 50 m g K rystalle aus F rak tio n 7 vom Smp. 100—105° gaben bei der Mischprobe m it 3a-O xy-cholen-(9,ll)-säure-m ethylesterc) vom Smp. 105—107° keine Schmelz- punktsem iedrigung. A cetylierung und U m krystalüsieren aus Ä ther-Petroläther gab sechseckige B lättchen, Smp. 134— 135°; Mischprobe m it 3a-A cetoxy-cholen-(9,ll)- säure-m ethylesterc) vom Smp. 138—140° ebenso. T etranitrom ethanprobe positiv.
3,675 mg Subst. gaben 10,095 mg C 0 2 und 3,374 mg H 20 C27H 420 4 (430,61) Ber. C 75,30 H 9,83%
Gef. „ 74,96 „ 10,27%
Möglicherweise en th ielt das verwendete Ausgangsm aterial (V III) bereits eine kleine Menge der zf 9 :11 -Säure, deren Anwesenheit der isolierte E ster seine E ntstehung v erd an k t.
Die 309 mg am orphes M aterial aus F rak tio n 8—12 w urden m it 4 cm 3 abs. Pyridin u n d 2 cm 3 A cetanhydrid 16 Std. bei 20° stehen gelassen. N ach üblicher A ufarbeitung w urde an 9 g A120 3 chrom atographiert. Die m it Petroläther-B enzol (9:1) eluierbaren Anteile (30 mg) gaben aus Ä ther-P etroläther 25 mg 3a-A cetoxy-cholen-(ll)-säure- m ethylester (IX ), Smp. 120— 122° (M ischprobe); T etranitrom ethanprobe positiv.
Die w eiteren F rak tio n en (eluiert m it Petroläther-B enzol, abs. Benzol und Benzol- Ä ther (9:1) (195 mg) gaben aus Ä ther-P etroläther 150 mg 3a,lla-D iacetoxy-12-keto-
cholansäure-m ethylester (X IV ), Smp. 153—154°. [a]'p' = + 3 3 ,7 ° ± 2 ° (c = 1,066 in CHClj). Mischprobe m it authentischem (XIV) schmolz ebenso1).
10,814 mg Subst. zu 1,0141 cm 3; 1 = 1 dm ; a ^ = + 0,36° + 0,02°
3,633 mg Subst. gaben 9,183 mg C 0 2 und 2,852 mg H 20 C ^H ^O , (504,63) Ber. C 69,00 H 8,78%
Gef. „ 68,98 „ 8,78%
D er Stoff w urde d urch 16-stündiges Stehen m it C r0 3 in Eisessig bei 18° nich t ange
griffen.
D er rohe T rioxy-ester (XVI) schmolz bei 76— 85° und zeigte [a] jj’ = + 16° ± 2° (in Chloroform). Beim Animpfen der Schmelze m it authentischem 3a, 11a, 12a-Trioxy-cholan- säure-m ethylester (X VI)P)2) vom Smp. 135—136° e rsta rrte sie sofort un d schmolz w ieder bei 133— 136°. Mischprobe ebenso. Z ur A cetylierung w urden die 57 mg roher T rioxyester (X VI) vom Smp. 76— 85° (aus F rak tio n 13— 14) m it 0,45 cm 3 abs. P y rid in und 0,25 cm 3 A cetanhydrid 18 Std. bei 20° stehen gelassen. Übliche A ufarbeitung u nd U m krystalli- sieren aus Ä th er-P etro läth er bei 0° gab 13,5 mg D iacetat (X V II) als feine N adeln, Smp.
129—130°. Die am orphe M utterlauge gab auch nach Chrom atographie keine K rystalle m ehr.
3,732 mg Subst, gaben 9,402 mg C 0 2 und 3,062 mg H 20 C29H 460 7 (506,64) Ber. C 68,74 H 9,15%
Gef. „ 68,75 „ 9,18%
I n einem zw eiten Versuch w urden zu 810 mg 3a-O xy-cholen-(ll)-säure (V III) in 23 cm 3 0,1-n. N aO H bei 0° u n ter R ühren w ährend i y 4 Std. 25 cm 3 1-proz. K M n 0 4- Lösung zugetropft un d anschliessend bis zur E n tfärb u n g noch 14 Std. bei 0° stehen ge
lassen. A ufarbeitung, M ethylierung un d C hrom atographie wie beim ersten Versuch gab gar keine K rystalle. D aher alle F rak tio n en vereinigt, acetyliert un d chrom atographiert.
R ein w urden erh alten : 150 mg (IX ), Smp. 120—122° (+ 1 0 0 mg M utterlauge) u n d 238 mg (X IV ), Smp. 153— 154° ( + 130 mg M utterlauge).
3 a , l l a - D i a c e t o x y - 1 2 - k e t o - c h o l a n s ä u r e - m e t h y l e s t e r (X IV ) a u s (X V II).
7,5 mg 3a,lla-D iacetoxy-12a-oxy-cholansäure-m ethylester (X V II), Smp. 130— 131°, in 2 cm 3 reinstem Eisessig m it 0,22 cm 3 0,5-proz. C r0 3-Eisessig-Losung 16 S td. bei 18°
stehen gelassen. Übliche A ufarbeitung u. U m krystallisieren aus Ä th er-P etro läth er gab 6,9 mg feine N adeln, Smp. 153— 154°; Mischprobe m it A nalysenpräparat (X IV ) ebenso.
V e r s u c h z u r H y d r i e r u n g v o n
3 a, 1 l a - D i a c e t o x y - 1 2 - k e t o - c h o l a n s ä u r e - m e t h y l e s t e r (X IV ).
50 mg E ster (X IV ), Smp. 153—154°, in 0,5 cm 3 reinstem Eisessig m it 30 mg P t 0 2 17 Std. bei Z im m ertem peratur h y d riert. 48 mg A usgangsprodukt, Smp. 153—154°
(Mischprobe), liessen sich regenerieren.
3 a , l l a , 1 2 a - T r i o x y - c h o l a n s ä u r e u n d N e b e n p r o d u k t e a u s (X).
1,9 g 3a,12/?-D ioxy-ll-keto-cholansäure-m ethylester ( X p ) P ) q ), Smp. 157— 158°, m it d er Lösung von 2,64 g N atriu m in 53 cm 3 abs. A lkohol u n d 6,1 cm 3 H y d razin h y d rat 8 S td.
im A utoklaven auf 195° e rh itz t. Mit H 20 v erd ü n n t, A lkohol im V akuum en tfern t, Lösung m it Ä th er ausgeschüttelt (Auszug verworfen), m it H 2S 0 4 bei 0° kongosauer gem acht u nd m ehrm als m it insgesam t 3 1 Ä th er ausgeschüttelt. Lösung m it wenig H 20 gew aschen,
*) W ir danken H errn D r. Gallagher fü r die A usführung dieser Mischprobe. E r w ar ausserdem so freundlich, die spez. D rehung unseres P räp arates in A l k o h o l zu bestim m en u nd fand [a]^ = + 38,2° (c = 0,225 in Alkohol im 2 dm -R ohr), also denselben W ert wie Gallagher un d Holländern).
2) W ir danken H errn Prof. Wintersteiner fü r dieses M aterial. Ausserdem w ar er so freundlich, die spez. D rehung seines P räp arates in CHC13 zu bestim m en, und fand M l ) = + 14,8° (c = 0,7473) in g u ter Ü bereinstim m ung m it unserem W ert.
Volumen x x ix , Fasciculus v i (1946). 1381 über wenig N a2S 0 4 getrocknet, eingedam pft. R ü ckstand (1,9 g) in wenig M ethanol m it überschüssigem D iazom ethan in Ä ther 10 Min. bei 0° m ethyliert und rohen M ethylester m it 5,5 cm 3 abs. P y rid in und 3,5 cm 3 A cetanhydrid 16 Std. bei 18° stehen gelassen.
Übliche A ufarbeitung gab 2,2 g A cetatgem isch. An 66 g A120 3 (nach Brockmann) chrom a
to g rap h iert (für jede F ra k tio n 220 cm 3 Lösungsm ittel).
Die m it B enzol-Petroläther sowie die erste m it Benzol erhaltene F raktion (total 95 mg) gaben aus Ä th er-P etro läth er 55 mg 3a-A cetoxy-cholen-(ll)-säure-m ethylester (IX ), Smp. 120— 122° (Mischprobe). Die w eiteren m it abs. Benzol sowie die erste m it Benzol-Ä ther (9:1) erhaltene F rak tio n (total 75 mg) gaben Krystallgem ische, aus denen sich nach nochm aliger C hrom atographie noch 7 mg (IX ) sowie 63 mg Substanz vom rohen Smp. ca. 153— 166° abtrennen Hessen (vergl. unten). Die H auptm enge des Materials (1,974 g) w urde erst m it w eiteren Benzol-Äther-Gemischen, reinem Ä ther sowie Chloro
form eluiert (vgl. unten).
Die 63 mg vom Smp. ca. 153— 166° gaben nach w iederholtem U m krystallisieren aus P etro läth er 20 mg K rystalle, Smp. im m er noch unscharf 160— 166°. [a]J| = + 3 3 ,0 ° ± 2° (c = 1,211 in Chloroform).
12,105 mg Subst. zu 0,9995 cm 3; l = 1 dm ; = + 0,40° + 0,02°
3,273 mg Subst. gaben 8,103 mg C 0 2 u nd 2,671 mg H 20 C3iH 480 8 (548,70) Ber. C 67,85 H 8,81%
Gef. „ 67,56 „ 9,13%
Der A nalyse nach h an d elt es sich um einen Triacetoxy-cholansäure-m ethylester.
D er Stoff ist gegen C r0 3 in Eisessig bei 18° beständig.
Die 1,974 g am orphes H a u p tp ro d u k t w urden m it 75 cm 3 2-proz. K O H in M ethanol 2 S td. gekocht. W asser zugegeben, M ethanol im V akuum entfernt, m it Ä ther ausgeschüt
te lt (E x tra k t verw orfen). W ässrige Phase bei 0° m it HCl bis zur kongosauren Reaktion v ersetzt u. m ehrm als m it to ta l ca. 3 1 Ä ther ausgeschüttelt. Mit wenig H 20 gewaschene und kurz über wenig N a 2S 0 4 getrocknete Ätherlösung auf ca. 200 cm 3 eingeengt. Viel am or
phes M aterial scheidet sich aus. G ut verschlossen bei 18° stehen gelassen. N ach 2 Wochen begann K rystallisation, nach w eiteren 2 W ochen Ä therlösung abgegossen. K rystalle m it wenig Essigester von 0°, dann m it Ä ther gewaschen. 130 mg vom Smp. ca. 126—132°
u n te r G asentw icklung. Die vereinigten M utterlaugen im V akuum eingedampft, R ück
sta n d (1,693 g) in 5 cm 3 feuchtem Essigester gelöst u. m it Ä ther nicht ganz bis zur T rü bung v ersetzt. N ach m ehreren T agen noch 100 mg K rystalle, die unscharf, teilweise bis 160° schm olzen un d sep arat behandelt w urden. Die 130 mg erstes K rystallisat gaben aus E ssigester 110 mg farblose D rusen aus N adeln, Smp. 127—133° u n ter Gasentwicklung.
M e t h y l e s t e r (X V I). 45 mg Säure vom Smp. 127—133° in wenig Methanol bei 0°
m it D iazom ethan in Ä ther versetzt. N ach 5 Min. übliche A ufarbeitung. Aus Ä ther-P etrol
ä th e r 33 mg farblose Prism en, Smp. 133—135°, [oc]j| = +16,4° ± 2 ° (c = 1,640 in Chloroform). Mischprobe m it authentischem (X V I)p) ebenso.
16,395 mg Subst. zu 0,9995 cm 3; 1 = 1 dm ; a 1^ = + 0,27° ± 0,02°
3,752 mg Subst. gaben 9,742 mg C 0 2 und 3,308 mg H 20 C25H 420 5 (422,50) Ber. C 71,05 H 10,02%
Gef. „ 70,86 „ 9,86%
Das zweite K ry stallisat, das teilweise höher schmolz, gab bei der M ethylierung einen am orphen E ster, der auch nach C hrom atographie und Im pfen nicht krystallisierte.
M e t h y l e s t e r - d i a c e t a t (X V II). 27 mg M ethylester (XVI), Smp. 133— 135°, in 0,4 cm 3 abs. P y rid in u nd 0,2 cm 3 A cetanhydrid 16 Std. bei 18° stehen gelassen. A ufar
beitung gab 29,5 mg R ohprodukt. Aus Ä ther-P etroläther 26 mg farblose Nadeln, Smp.
129— 130°. Mischprobe m it analysiertem P rä p a ra t aus (V III) ebenso.
K e t o - e s t e r (X IV) a u s o b ig e m P r ä p a r a t . Die 26 mg M ethylester-diacetat, Smp. 129— 130°, in 0,7 cm 3 Eisessig m it 0,94 cm 3 0,5-proz. C r0 3-Eisessig-Lösung 16 Std.
bei 18° stehen gelassen. A ufarbeitung u nd U m krystallisieren aus Ä ther-Petroläther gab 22 mg N adeln, Smp. 153—154°; Mischprobe m it (XIV) aus (V III) ebenso.
V e r s u c h z u r H y d r i e r u n g v o n
3 a , 1 2 jS -D io x y -1 1 - k e t o - c h o l a n s ä u r e - m e t h y l e s t e r (X).
46 mg E ster (X), Smp. 157—158°, in 0,6 cm 3 Eisessig m it 30 mg P t 0 2 ■ H 20 17 Std.
bei Z im m ertem peratur h y d riert. N ach üblicher A ufarbeitung w urde n u r u n verändertes A usgangsm aterial erhalten.
Die M ikroanalysen w urden im m ikroanalytischen L aboratorium d er E idg. T ech
nischen H ochschule, Zürich (Leitung W . Manser), ausgeführt.
P h arm azeu tisch e A n sta lt der U n iv e rsitä t B asel.
180. Über die Kinetik der P ektinase von G. W e i t n a u e r .
(18. VI. 46.)
I. E i n l e i t u n g .
Seit etw a zwei J a h rz e h n te n spielen p ek tin aseh altig e P rä p a ra te bei der H erstellun g von F ru c h tsä fte n eine w ichtige Bolle. Die P e k tinase, das w irksam e E n zy m dieser K lär- u n d F iltratio n sen zy m e, sprengt die glucosidische B indung der P ektinm akro m olekel. D er M ethylester der G alakturon säu re b ild et das E n d p ro d u k t dieser P ektolyse.
I n dieser A rbeit w ird au f die ziemlich um fangreiche bisherige P e k tin a se lite ra tu r n ich t eingetreten. D ie W irkung der P e k tin a se ist bisher n u r q u a lita tiv u n tersu c h t w orden, da keine b rau c h b a re M e
th o d e fü r die q u a n tita tiv e B estim m ung der P ek tin asew irk u n g a u s
g earb eitet w erden kon n te. Zusam m enfassende A ngaben ü b er die b is
herigen E rgebnisse sind vor allem in den V eröffentlichungen von M eh lü z1), H . B ock1) sowie Beuel u n d W eber2) zu finden.
I I . E i g e n e U n t e r s u c h u n g e n . A) P r i n z i p i e l l e s .
F ü r die Verfolgung des P ek tin ab b au es h a t sich die viscosime- trisch e M essung am m eisten b ew äh rt. A uch in dieser A rb eit w ird der en zym atische P e k tin a b b a u viscosim etrisch erfasst u n d aus den e r
m itte lte n V iscositäten w erden q u a n tita tiv e R ückschlüsse auf die P e k tin d e g rad a tio n gezogen.
B) M e t h o d i s c h e s d e r e n z y m a t i s c h e n A b b a u v e r s u c h e .
1. V i s c o s i t ä t s m e s s u n g . Die V iscositäten w urden in einem Ostwald’’sehen V iscosim eter bestim m t.
1) B am ann un d MyrbäcJc, Meth. Ferm entforschung (1941).
2) M itt. Lebensm ittelunters. H yg. 36, 368 (1945).
Volumen x x ix , Fasciculus vi (1946). 1383
Als Mass fü r die rela tiv e V iscosität
V iscosität der Lösung A usflusszeit der Lösung
^rel V iscosität des Lösungsm ittels Ausflusszeit des Lösungsm ittels
w urde d ire k t die A usflusszeit genom m en, da w ir im m er m it dem selben V iscosim eter arb eiteten .
Die A bbau- u n d M esstem peraturen b etrag en , w enn keine anderen A ngaben g em acht w erden, 20,0° C.
E s sei auf die T atsache hingewiesen, dass bei rasch aufeinand er
folgenden M essungen derselben P ek tin lösun g die A usflusszeiten oft sinken. D as h ä n g t d a m it zusam m en, dass die Pektinm olekel als Fad enm o lekel beim D u rch strö m en durch die V iscosim eter-K apillare zum Teil zerrissen w erden, wobei die V iscosität der Lösung sinkt.
Die A usflusszeiten sind also im m er m it kleinen F eh lern b e h a ftet, die a b e r au f die Ergebnisse von geringem Einfluss sind.
2. P e k t i n . Als P e k tin p rä p a ra t verw endeten wir, wenn nichts anderes erw äh n t w ird, das von der U nipektin AG. hergestellte G rün b a n d p e k tin . W ir hab en auch verschiedene andere P e k tin p rä p a ra te u n te rs u c h t u n d festg estellt, dass die Lösungen aller u n tersuch ten P rä p a ra te , un ab h än g ig von ihrer H e rk u n ft u n d von ihrem R einheits
g rad bei gleicher A nfangsviscosität, ab er je nach P rä p a ra t von v e r
schiedener G ew ichtskonzentration, u n te r sonst gleichen B edingungen bei enzy m atisch en A bbauversu ch en dieselbe V iscositätserniedrigung erleiden.
3. H e r s t e l l u n g d e r P e k t i n l ö s u n g . Die Pektinlösung wird auf folgende W eise h ergestellt:
Die notw endige Menge G rünbandpektin wird m it wenig Ä thylalkohol gut verrieben u n d u n te r R ü h ren bei 20° zum L ösungsm ittel (W asser, Pufferlösung, abgebaute Lösung) zugegeben. Zugabe von 2°/00 N atrium benzoat (zur H altbarm achung), hierauf u n ter U m rü h re n aufw ärm en auf 70°, 5 M inuten bei 70° h alten und bei Z im m ertem peratur abkühlen lassen. N achdem abgekühlt ist, auf bestim m te Marke auffüllen, um gewünschte K o n zen tratio n herzustellen. T rotz gleicher Pektinm enge und praktisch gleicher H erstellungs
weise w erden selten Lösungen von gleicher Anfangsviscosität erhalten. Auf jeden Fall v erän d ert sich die V iscosität einer frischbereiteten Pektinlösung nach den ersten 24 S tu n den zum Teil ziem lich stark . N ach 1 %—2 Tagen (nachdem das innere Gleichgewicht hergestellt ist) bleiben die W erte k o n stan t. F ü r A bbauversuche wurden immer nur Lösungen verw endet, die wir zuerst auf K onstanz der V iscosität geprüft hatten.
4. P e k t i n a s e . F ü r unsere U ntersuchungen verw endeten wir die 3 folgenden P rä p a ra te : F iltraz y m (Schweizer F a b rik a t), P ektinol (deutsches F a b rik a t) u n d P ectasin (am erikanisches P ro d u k t).
J e nach dem Zweck der U ntersuch u ng w urden die P ro d u k te in fester F o rm oder Auszüge aus ihnen verw endet. F ü r die in dieser A rbeit d u rchg efü h rten w issenschaftlichen U ntersuchungen w urden
ausschliesslich Auszüge verw endet.
C. K i n e t i k d e r P e k t i n a s e .
a) B e z i e h u n g z w i s c h e n Y i s c o s i t ä t u n d P e k t i n g e h a l t e i n e r L ö s u n g .
U m ein klares B ild der zeitlichen P e k tin d e g rad a tio n , des E in flusses v o n E nzym - un d S u b stra tk o n z e n tra tio n , des p H und. der T e m p era tu r au f die W irkung der P e k tin a se zu e rh a lte n , m u sste z u n ächst die B eziehung zwischen der Y iscosität u n d dem P e k tin geh alt einer Lösung festgestellt werden.
Zu diesem Zweck w urden, ausgehend v o n einer w ässerigen L ö
sung v on ca. 3°/00 P e k tin , V erdünnungen hergestellt.
E s w urden u n te rsu c h t:
1. V erdünnungen einer wässerigen Lösung von ca. 3°/00 P ek tin m it W asser.
2. V erdünnungen einer gepufferten 3-prom. Pektinlösung (gleiche Teile 0,2-n. N a triu m acetatlösung un d 0,2-n. Essigsäure) m it W asser.
3. V erdünnungen dieser gepufferten Pektinlösung m it einer Lösung, die aus dieser ge
pufferten Pektinlösung durch vollständigen enzym atischen A bbau des P ektins u nd darauffolgender Zerstörung der P ektinase d urch A ufkochen erh alten w orden w ar.
In allen drei F ällen w urde festgestellt, dass die P e k tin k o n z e n tra tio n p rak tisc h linear m it dem L o g arithm u s der A usflusszeit a n steigt. (Es w urde n ich t u n tersu c h t, wie w eit oberhalb 3°/00 diese G e
setzm ässigkeit noch G eltung h a t.) (Fig. 1.)
A usflusszeiten in Sekunden
Fig. 1.
b) B e a k t i o n s k o n s t a n t e K d e r P e k t i n a s e .
N achdem diese Beziehung festg estellt w ar, k o n n te a n die q u a n ti
ta tiv e Verfolgung des P e k tin a b b a u es g esch ritten w erden.
D a die A k tiv itä t der Pektinase m it dem p H sich etw as nach der sauren Seite hin verschiebt, m usste die Lösung gepuffert werden. F ü r die im folgenden aufgeführten A bbauversuche w urde eine gepufferte 3-prom . G rünbandpektinlösung (gleiche Teile 0,2-n. N atrium acetatlösung und 0,2-n. Essigsäure) von p H 4,7 verw endet. Die gepufferte
Volumen x x ix , Faseiculus v i (1946). 1385 Pektinlösung oder V erdünnungen davon m it W asser w urden m it verschiedenen Mengen Pektinaselösungen bei genau 20,0° C enzym atisch abgebaut. In beliebigen Zeitabständen w urden die A usflusszeiten der Lösungen bei genau 20,0° gemessen. Um den der e rm it
telten Ausflusszeit genau entsprechenden Zeitm om ent zu bestim m en, wurde der zu Beginn der V iscositätsm essung auf einer U h r m it Sekundenzeiger festgestellte Z eitpunkt um die halbe A usflusszeit erhöht.
I n Tabelle 1 sind fü r verschiedene S u b strat- u n d E nzym konzen
tra tio n e n die n ach verschiedenen Zeiten gefundenen A usflusszeiten angegeben. F ü r die A ufstellung einer F o rm el fü r die K in etik der P ek tin ase n ah m en w ir zun äch st an, dass es sich beim enzym atischen P e k tin a b b a u , wie bei vielen and eren enzym atischen A bbaureaktionen, u m eine m onom olekulare R ea k tio n han d elt.
H ä tte n w ir genau einen m onom olekularen R eaktionsverlauf vor uns, so m üsste
l °A
sein, wobei k x die m onom olekulare R eak tio n sk o n stan te, CA die A n
fan g sp ek tin k o n zen tratio n , Cx die jeweilige K o n zen tratio n der a b g e b a u te n P ektinm o lek el b e d e u te t.
W enn w ir n u n p rü fen wollen, ob es sich beim P e k tin a b b a u durch die P e k tin a se ebenfalls u m eine reine m onom olekulare R eaktion h a n d e lt, so m üssen w ir zu näch st die K o n zen tratio n en durch die e n t
sprechenden V iscositäten (resp. A usflusszeiten) ausdrücken. K achdem die P ro p o rtio n a litä t zwischen P e k tin k o n z e n tra tio n un d dem L o g arith m us der A usflusszeit festg estellt w orden ist, können wir die Bezie
h un g zw ischen A usflusszeit u n d P e k tin k o n z e n tra tio n m athem atisch form ulieren.
W ir fü h ren folgende Bezeichnungen ein:
V v : A usflusszeit der Pektinlösung vor dem A bbau (Anfangsviscosität)
V x : A usflusszeit der R eaktionslösung in einem beliebigen Z eitpunkt des Abbaues y ; A usflusszeit der Pektinlösung nach vollständigem A bbau (Endviscosität)
b W ir können n un folgende Gleichung aufstellen:
C A l° g V A- l o g V E CA- C X log Vx - log VE
Ta b e l l e 1.
Versuch 1 Versuch 2
S u b stra t: 200 cm 3 gepufferte 3-prom.
P ek tin lö su n g ; pH 4,7 VA = 226,2
S u b stra t: 200 cm 3 gepufferte 3-prom.
P ektinlösung; p H 4,7 VA = 226,2 Enzym m enge: Auszug ~ 5 mg P rä p a ra t E nzym m enge: Auszug ~ 25 mg P rä p a ra t
Zeit in Min.
nach Zugabe
Ausfl.- zeit in Sek.
Vx
kr K Ca- Cx
in %o Zeit in Min.
Ausfl.- zeit in Sek.
v x
K ' V x
in °/oo
22,1 50,4 63,3 103,2 166 286 361 421 1380
189,1 168,4 157.3 140.8 116.9 108,0 101.4
97,9 80,2
0,00286 0,00220 0,00210 0,00187 0,00181 0,00125 0,00112 0,00104 0,00049
0,00331 0,00284 0,00304 0,00292 0,00362 0,00284 0,00288 0,00283 0,00224
2,600 2,330 2,180 1,930 1,500 1,320 1,175 1,100 0,640
3,65 8,47 14,3 26,15 41 63,9 85,8 114.7 205.7 300.7 314.7 373.7 1320
198.0 176,6 156.5 137.4 121.6 110.0 101.4
97,9 86,0 81.3 79.4 77.0 69.1
0,0123 0,0106 0,0098 0,00785 0,0067 0,00535 0,00475 0,0038 0,00276 0,00222 0,00227 0,00198 0,000746
0,01365 0,01305 0,01355 0,0126 0,0126 0,0118 0,0121 0,0103 0,0102 0,00985 0,0109 0,0107 0,00740
2,70 2,44 2,16 1,87 1,59 1,36 1,18 1,10 0,808 0,687 0,625 0,553 0,308 VE = 60,4
VB = 60,2
Versuch 3 V ersuch 4
S u b stra t: 200 cm 3 gepufferte, m it H 20 a u f l ,5 °/00 verdünnte 3-prom. P ek tin
lösung; pH 4,7 VA = 117,2
S u b strat: 200 cm 3 gepufferte, m it H 20 a u f 0,75% o verdünnte 3-prom. P e k tin
lösung; pH 4,7 VA = 81,1 Enzym m enge: Auszug ~ 10 mg P rä p a ra t Enzym m enge: Auszug — 10 mg P rä p a ra t
Zeit in Min.
nach Zugabe
Ausfl.- zeit in Sek.
v x
k i K Ca- Cx
in 7oo Zeit in Min.
nach Zugabe
Ausfl.- zeit in Sek.
v x
kr K C A
in 7oo
7,13 12,83 20,8 40.7 65.7 90,6 124,6 1075
106,6 100,4 94,1 85,9 79,7 75.4 74,3 63.5
0,00900 0,00875 0,00813 0,00562 0,00556 0,00505 0,00388 0,00094
0,01045 0,01135 0,0120 0,0104 0,0129 0,0143 0,0118 0,0094
1,29 1,16 1,02 0,81 0,65 0,59 0,49 0,15
9,36 15,58 35,6 60,5 1010
73.0 70,5 66,7 64.0 58,3
0,01610 0,01375 0,00950 0,00768 0,00104
0,0227 0,0225 0,0207 0,0223 0,0110
0,53 0,46 0,34 0,26 0,07
V £ = 56,5
V E = 59,4
Volumen x x ix , Fasciculus v i (1946). 1387 W enn w ir n un aus den Versuchsergebnissen für jede A bbaukurve die monomole
kulare R eaktionskonstante 1
,
t ' ° g C A- C ,
! log V A - log V E
= T °g
- A - - X “ lo g V x - l o g V E
berechnen, so sehen wir zunächst (Tabelle 1), dass der P ektinabbau nicht diesem ein
fachen monom olekularen R eaktionsverlauf folgt. k x nim m t m it fortschreitendem Abbau im m er m ehr ab.
W enn wir k j graphisch als F u n k tio n von
lo g V x - l o g V E x " A- log VA —log V E
auftragen, so m achen w ir die überraschende Feststellung, dass k, m it zunehmendem A bbau innerhalb der Versuchsfehler praktisch linear fällt, um bei CA = C x , d. h. beim vollständigen A bbau N ull zu w erden (Fig. 2).
Fig. 2.
Diese experim entell festgestellte B eziehung erlau b t uns nun, für die K in e tik der P ek tin ase ebenfalls eine B eak tio n sk o n stan te aufzu
stellen. A u s 'd e r leicht abzuleitenden Gleichung:
erh a lte n wir du rch U m form en die Form el fü r die B eaktionsk on stante
K ^der P ek tin ase:
W ir k önnen auch in dieser G leichung die K o n z e n tra tio n du rch die A usflusszeiten ersetzen, u n d wir bekom m en:
1 lo g V A- l o g V E lo g V A- l o g V E t ' log Vx - log VE ' 10g log Vx - log VE
I n Tabelle 1 sind fü r die verschiedenen A b b a u k u rv e n die b e rech n eten Grössen k x, K u n d CA — Cx angegeben.
Z ur B erechnung dieser Grössen w urden die Z eit in M inuten, die A usflusszeiten in Sekunden eingesetzt. Die P e k tin k o n z e n tra tio n w urde, d a deren m olare K o n z e n tra tio n nich t genau angegeben w erden k an n , in G ew ichtsprom ille eingesetzt.
D ass der W ert von K fü r die verschiedenen Z e itp u n k te einer A b b au k u rv e zum Teil ziem lich s ta rk sch w an kt, liegt d a ra n , dass schon kleine A bw eichungen in den A usflusszeiten zu re la tiv grossen U nterschieden des W ertes von K führen. D ie W erte fü r K schw anken in den an g efü h rten V ersuchen jedoch n u r unregelm ässig um einen m ittle re n W ert, so dass, vom m ath em atisch en S ta n d p u n k t aus b e tra c h te t, n ich t von einer funktioneilen A bhängigkeit der Grösse K von Cx oder t die B ede sein k an n . W ir hab en lediglich, wie bei den m eisten enzym atischen U ntersu chu n gen , eine grosse S tre u u n g vo n einer K o n sta n te n .
I n Fig. 3 sind nach F orm el (3) die errech n eten th eo retischen A b b a u k u rv en sowie die experim entell e rm itte lte n P u n k te eingezeichnet.
Aus p rak tisch en G ründen w urde die Zeit in logarithm ischem M aßstab
eingetragen.
Volumen x x ix , Fasciculus v i (1946). 1389
W ie aus der graphischen D arstellu n g hervorgeht, stim m en die experim entell gefundenen P u n k te m it der theoretischen K u rv e (kon
stan tes K ) ziem lich g u t überein.
c) R e a k t i o n s g e s c h w i n d i g k e i t .
W enn wir nu n die R eaktionsgeschw indigkeit (Zerfallgeschwindig
k e it, resp. Bildungsgeschw indigkeit) des enzym atischen P e k tin a b baues d u rch die P ek tin ase als F u n k tio n von Cx , resp. CA — Cx , e r
m itte ln wollen, so m üssen wir F orm el (2) so um form en, dass wir Cx als F u n k tio n von t bekom m en und hierauf nach der Zeit differenzieren.
Da wir Cx ohne R eihenbildung nicht explizit als Funktion von t angeben können, schreiben wir t als F u n k tio n von Cx :
C A C A
K t = -h p— log —r— — D urch Differenzierung der Gleichung erh ält m an d t/d C .
Der reziproke W ert davon, d C /d t, gibt uns die Form el der Reaktionsgeschw indigkeit:
v = ^ l = J £ _ _______( ° a - c x)2 (4)
d t CA log CA - log (CA- C x j + io g e w
Aus F o rm el (4) k önnen wir leicht die Anfangsgeschwindigkeit d e r R e a k tio n berechnen.
W enn wTir fü r Cx = 0 einsetzen, so erh a lte n wir:
K C , t_>0 lö g e (5)
W ir k ön nen m it H ilfe von F orm el (2) auch leicht berechnen, welche Zeit b en ö tig t w ird, um in einer m it einem P ek tin asep räp arat v e rse tz te n P ektin lö su n g das P e k tin bis auf einen bestim m ten W ert ab zu b au en .
F ü r die p ra k tisc h e V erw endung von P ek tin a se p rä p a ra ten bei d e r H erstellu n g von O b stsäften ist die T atsache, dass dies berechnet w erden k a n n , von grösser B edeutung, weil schon ein ganz kleiner G eh alt an P e k tin (ca. 0,005°/00) die L eistung der F ilter merklich h e ra b se tz t. Z udem w ird das P e k tin durch das F ilterm aterial zum Teil ad so rb iert, was ein V erstopfen der F ilte r zur Folge hat.
d) A b h ä n g i g k e i t d e r R e a k t i o n s k o n s t a n t e n K v o n d e r E n z y m k o n z e n t r a t i o n .
Bei den m eisten enzym atischen R eak tio n en ist fü r die kleinen E n zy m k o n zen tratio n en , die prak tisch in Frag e kom m en, die Reak- tionsanfangsgeschw indigkeit der E nzy m ko n zen tration genau propor
tio nal, som it ist auch die jeweilige R eak tio n sk onstan te K pro p o r
tio n a l der E n zy m k onzentratio n .
Bei dem A bbau des P ek tin s durch die P ektinase ist diese P ro p o r
tio n a litä t n ich t unb ed in g t zu erw arten, da wir es hier m it sehr kleinen
m olaren S u b stra tk o n ze n tra tio n e n zu tu n haben.
W enn w ir fü r P e k tin ein ap p ro x im atives M ol.-G ew icht v on 90 000 annehm en u n d bei u n sern A bbauversuchen P ek tinlö sungen von 0,75— 3 Gew.°/00 verw enden, so ist die m olare P e k tin k o n z e n tra tio n von d er G rössenordnung IO-5.
N ach bew ährter Anschauung in der E nzym kinetik tre te n E nzym E un d S u b stra t S praktisch m om entan zu einer unbeständigen Enzym -Substrat-V erbindung E S zusam m en, u nd die experim entell beobachtete Reaktionsgeschw indigkeit ist abhängig einerseits v on der jeweibgen K onzentration dieses Komplexes, andererseits von der Geschwindigkeit, m it welcher sein Zerfall in die A bbauprodukte u n ter R ückbildung des Enzym es erfolgt.
Die Bildung der E nzym -Substrat-V erbindung w ird vom M assenwirkungsgesetz geregelt.
E s gilt
S f r e i ' E fre i _ v / ( u
E S ~ (6)
K m bedeutet die D issoziationskonstante der E nzym substratverbindung. S ta t t Gleichung (6) können w ir auch schreiben:
( S - E S ) - ( E - E S ) __
E S - m
D urch Um form en e rh ält m an
■— w b
I n den m eisten F ällen ist das V erh ältn is der K o n z e n tra tio n S des S u b strates zu r G esam tko n zen tratio n E des E nzym es sehr gross, so dass Gleichung (7) in die klassische Gleichung von M ichaelis1) :
___ S __ /OY
E S + K m ( >
ü bergeht.
D en W ert E S / E bezeichnet m an als relativ e A k tiv itä t.
Solange also die E n z y m k o n zen tratio n im V ergleich zur S u b stra tk o n z e n tra tio n sehr klein bleibt, ist bei gleichbleibender S u b s tra tk o n z e n tra tio n E S , som it auch die R eaktionsgeschw indigkeit (im m er A nfangsgeschw indigkeit gem eint) u n d d aher auch (siehe Form el (5)) die R ea k tio n sk o n sta n te K p ro p o rtio n al der E n z y m k o n z e n tratio n E .
Solange w ir a b er E gegenüber S n ich t vernachlässigen kö n n en , gilt n u r F orm el (7), aus der wir durch U m form en G leichung (9) erh a lte n :
— - l = - — m— (9)
E S S - E S w
K m (die D issoziationskonstante der V erbindung P e k tin -P e k - tinase) ist, wie sp ä te r noch zu zeigen sein w ird, von der G rössen
ordn un g IO-4 bis IO-5.
W enn w ir die P e k tin k o n z e n tra tio n S v o n der G rössenordnung IO-5 w ählen, so k ö nnen wir aus G leichung (9), w enn wir fü r E / E S beliebige W erte einsetzen, die Grösse von E S u n d E berechnen.
x) L . Michaelis und M . L . Menten, Bioch. Z. 49, 333 (1913).
Volumen X X IX , Fasciculus V I (1946). 1391
I n Tabelle 2 sind die W erte von E S / E , resp. E / E S , so gew ählt worden, dass die E n zy m k o n ze n tra tio n kleiner als diejenige des S u b strates w ird.
T abe l l e 2.
s
= 1 xIO-6;
K m = 1 xlO -4ES
E- E E S E
E S E ES
lim fü r E -> 0 hi
13,0 2,16 x 10~5 0,0784 0,863
12,0 1,09 xlO " 5 0,0833 0,917
11,8 0,875 x IO“ 5 0,0847 0,932
11,5 0,547 xlO " 5 0,0870 0,957
11,4 0,438 x IO“ 5 0,0877 0,966
11,2 0,219 x IO" 5 0,0893 0,982
11,1 0,100 x IO' 5 0,0901 0,991
11,01 0,010 x IO" 5 0,0908 0,999
11,001 0,001 xlO " 5 0,0909 1,000
- > 11,00 - > o ->0,0908 1,000
s
= 1 X10~5 ; K ra == 1 xlO -5 ESE E ES E
E S E PC
lim fü r E -> 0 hi
3,00 1,500 xlO " 5 0,3333 0,667
2,50 0,835 xlO " 5 0,4000 0,800
2,40 0,686 x IO“ 5 0,416 0,834
2,30 0,531 xlO -6 0,435 0,870
2,20 0,367 x IO“ 5 0,445 0,910
2,10 0,191 xlO " 6 0,476 0,952
2,08 0,154 xlO “ 5 0,481 0,961
2,06 0 ,1 1 6 x l0 -6 0,486 0,970
2,04 0,078 xlO " 5 0,490 0,980
2,02 0,040 x IO“ 6 0,495 0,990
-> 2,0 -> 0 ->0,500 1,000
W enn w ir die rela tiv e A k tiv itä t als F u n k tio n der E nzym konzen
tra tio n b e tra ch te n , so sehen wir, dass, solange die S ub stratk o n zen tra tio n m ehr als lOOOmal grösser ist als die des Enzym es, die relativ e A k tiv itä t p rak tisch k o n s ta n t bleibt, d. h. die R eaktionsgeschw indig
k e it ist genau pro p o rtio n al E . Sobald ab er die E n zym konzen tratio n
grösser wird, so w ird der Q uo tien t aus relativ er A k tiv itä t fü r die
u n tersu ch te E n z y m k o n zen tratio n u n d relativ er A k tiv itä t für die
E nzym grenzk o nzentratio n 0 im m er kleiner. Bei grossen E n zy m
H E L V E T I C A C H iM lC A A C T A .
k o n z e n tratio n en
istE S u n d som it auch die
R e a k tio n sg e sc h w in d ig k e iu n d die R e a k tio n sk o n sta n te n ich t
m e h r p ro p o rtio n a l d e rE nzy m ko n zen tratio n .
Diese B erechnungsm ethode erm öglicht übrigens bei irgend w elchen enzym atischen R eak tio n en bei b ek an n tem K m, bekannte]
R eak tio n sk in etik u n d b e k a n n te r m olarer S u b stra tk o n z e n tra tio n e n t w eder bei b ek an n tem R ein h eitsg rad des E n z y m p rä p a ra tes das Mol.
Gew icht des E nzym s oder u m gek ehrt, bei b ek an n tem Mol.-Gewichi den absolu ten R ein h eitsg rad des P rä p a ra te s zu bestim m en. W h m üssen n u r für die enzym atischen V ersuche die K o n z e n tra tio n e n des E n z y m p rä p a ra tes so w eit steigern, bis w ir eine A bw eichung zwüschei E n zy m k o n zen tratio n u n d R e a k tio n sk o n sta n ten feststellen kön n en Falls, wie zu erw arten ist, bei so grossen E n z y m k o n ze n tra tio n e n die R ea k tio n zu rasch a b lä u ft, so k a n n sie leicht durch W ahl des p H der T em p eratu r oder durch Z usätze so s ta rk gehem m t w erden, dasf der R eaktio n sab lauf noch m essbar bleibt.
V oraussetzung der ganzen M ethode ist aber, dass bei der B e stim m ung der R e a k tio n sk o n stan ten die F ehlergrenze n ic h t allzu gross ist.
U m festzustellen, ob bei unsern V ersuchen P ro p o rtio n alität zw ischen E u n d K besteht, hab en w ir gleiche Portionen einer gepufferten 3-prom. P ektinlösung von p H 4,1 m it von 1—1000 mg variierenden Mengen E n zy m p rä p arat (in F orm von Auszug) v ersetzt
F ü r jeden A bbauversuch w urden in beliebigen Z eitabständen 2—3 Viscositäts- bestim m ungen durchgeführt und daraus die Grösse K berechnet. Die R esu ltate sind in Tabelle 3 zusam mengestellt.
Die E rgebnisse zeigen, dass wir fü r das u n te rsu c h te E n z y m k o n zen trationsg ebiet von 1 : 1000 in n erh alb der F ehlerg renze P ro p o rtio n a litä t zwischen K u n d E haben. U m eine A bw eichung der P ro p o rtio n a litä t zwischen E n zy m k o n zen tratio n u n d R e a k tio n sk o n s ta n te festzustellen, m üsste die E n z y m k o n ze n tra tio n noch weiter gesteigert werden.
Die T atsache, dass zwischen K u n d E P ro p o rtio n a litä t h e rrsc h t, erla u b t uns nun, m it H ilfe der F orm el fü r die R e a k tio n sk o n sta n te die W irksam k eit von P e k tin a se p rä p a ra te n q u a n tita tiv zu bestim m en.
W ir schlagen vor, die q u a n tita tiv e B ew ertu ng von P e k tin a s e p rä p a ra te n u n te r folgenden B edingungen d u rc h z u fü h re n :
S u b s t r a t : Gepufferte Pektinlösung von p H 3,1 (1 Teil 0,2-n. N atrium hydrogen- ta r tr a t u nd 1 Teil 0,2-n. W einsäure), Zusatz von 2 °/00 N atrium benzoat.
V iscosität der gepufferten Pektinlösung
^ rei V iscosität des W assers —
Diese Lösung entspricht einer gepufferten Lösung von ca. 3°/00 G rünbandpektin.
F ü r diese Standardpektinlösung w ird ein für allem al der V iscositätsendw ert b e stim m t.
D urchführung der B estim m ung. 100 cm 3 der gepufferten P ektinlösung w erden genau bei 20,0° m it 20— 100 mg E n zy m p rä p arat (oder äquivalenter Menge Enzym auszug) versetzt. In A bständen von ca. 60, 90, 120 und 240 M inuten w erden die V iscositäten
Tabel l e 3.
A b h
au einer gepufferten 3-prom. Pektinlösung von p H 4,1 m it variierenden Enzymmengen.
Je 300 cm3. VA = 208,2 Sekunden.
Volumen x x ix , Fasciculus vx (1946). 1393
Enzyrameugg
in mg t in Min.
Ausflusszeit in Sekunden
V x
v E
1000 2,63
27,5
75,5
62,7 59,4
250
IOC
11,73 30,1
75,4
67,8 59,2
19,7 42.6 75.6
80,9 70,4 68,2
58,5
10 37,0
60,9 84,8
127,2 110,4 101,8
58,4
5 112,9
197 219
110,5 94,7 91,2
58,4
1 191
271
151,3
135,0 58,4
E n zy m menge in mg
1 log VA- l o g VE lo g V A- l o g V E
K berechnet fü r P roportionalität
zw. K und E t l o g V x - l o g V E log Vx - log VE Als Massstab fü r
E = 250
K = 0,300 gewählt
1000 1,41
1,18 1,20
250 0,320
. 0,298 0,300
100 0,117
0,132 0,0995
0,120
10 0,0094
0,00985 0,0097
0,0120
5
1
0,0053 0,0057 0,0059
0,0060
0,000865
0,00102 0,0012
bei 20,0° bestim m t. Aus den gefundenen Ausflusszeiten w ird m it H ilfe von Form el (3) die Grösse von K berechnet. Aus den 4 W erten w ird das arithm etische M ittel genomm en.
D er lOOOfache W ert davon, dividiert durch die angew andte Menge E n zy m p rä p a ra t in mg soll als Mass der W irksam keit des u n tersuchten P räp arates gelten. Die pektolytische K ra ft eines P räp arates w ird also nach folgender Form el bestim m t:
P f = — -xlOOO (10)
1 mg L n zy m p ra p arat
Es sei darauf hingewiesen, dass für die B ew ertung von technischen P ek tin ase- präp araten , wie sie in der O bstsaftindustrie V erwendung finden, als S u b stra t ungeschönter O bstsaft verw endet werden muss, da sich die verschiedenen technischen P rä p a ra te gegen die in natürlichen Säften vorkom m enden aktivierenden un d hem m enden Stoffe v e r
schieden verhalten.
e) A b h ä n g i g k e i t d e r E e a k t i o n s k o n s t a n t e K v o n d e r S u b s t r a t k o n z e n t r a t i o n S.
F ü r die theoretische A bleitung der Beziehung zwischen K u n d S können wir ebenfalls Form el (9) verw enden. W ir wollen ab er n u r den F all b e tra ch te n , in dem die verw endeten E nzym m engen im V e r
gleich zur S u b stra tk o n ze n tra tio n sehr klein sind. In diesem F a ll g ilt die F orm el von M ichaelis.
E S = E . ^ -
Die E eaktionsanfangsgeschw indigkeit ist p ro p o rtio n al E S.
F ü r k o n stan tes E hab en wir also:
Anfangsgeschwindigkeit = v A = const.- -=— ==—S b + K m
W ir hab en ferner gesehen (Form el (5)), dass fü r eine b e stim m te S u b stra tk o n ze n tra tio n
k -c a
Va log e
ist.
D urch G leichsetzung der beiden G leichungen erh a lte n w ir:
K = const. • -°,v - - = K onstante • -
S + K m S S + K m
W enn S sehr gross ist im V erhältnis zu K m, also bei r e la tiv hoher S u b stra tk o n ze n tra tio n , w ird K u m g ek eh rt p ro p o rtio n a l d e r S u b stra tk o n ze n tra tio n sein. I s t S sehr klein im V erhältn is zu d e r Grösse von K m, d . h . bei kleinen S u b stra tk o n z e n tra tio n e n , is t K unab h än g ig von S.
In Tabelle 4 sind die W erte von K für variierende S ub stratk o n zen tratio n u n d v e r
schiedene W erte von K m , wie sie aus der Form el K = 1 /S + K rn errechnet w urden, ein
getragen. F ü r die B erechnung w urde angenom m en, dass eine K onzen tratio n v o n 3 °/00 G rünbandpektin einer m olaren K onzentration von 3 x 10~6 en tsp rich t. D a u n s fü r diese B etrachtung n u r die relativ e Grösse von K interessiert, haben w ir für die K o n sta n te den W ert 1 eingesetzt.
Volumen x x ix , Fasciculus v i (1946).
Ta b e l l e 4.
1395
P ek t in - konzentration
i n % o
Molare P e k tin konzentration
K ,n = l x l ° - K
K f « r S —3°/c
3 2.5 2 1.5 1,0 0,75 0,5 0,2
3.0 x IO-6 2.5 x 10~6 2.0 x IO-5 1.5 x IO-5 1.0 x IO-5 0,75 x IO“ 5 0,5 x 10~5 0,2 x IO-6
7700 8000 8340 8700 9090 9300 9530 9800
1,0 1,04 1,08 1,13 1,18 1,208 1,238 1,27
K, = 3 x 1 0 - K K fü rS ^3°/oc
16670 18180 20000 22200 25000 26650 28600 31200
1,0 1,09 1,20 1,33 1,50 1,60 1,72 1,87 P ektin- I Molare
konzentration i P e k tin in °/uo konzentration
3 2.5 2 1.5 1,0 0,75 0,5 0,2
3.0 x lO - 5 2.5 x IO-5 2.0 x lO “ 5 1.5 x IO-5 1.0 x IO-5 0,75 x 10~ 5 0,5 x lO “ 5 0,2 x IO-5
= l x l O “ 5 K
K = 0 , 3 x 1 0 - 5
K
K f ü r S = 3°/oo
K K
■^Tür S = 37„„
25000 28600 33300 40000 50000 57000 66700 83300
1,0 1,14 1.33 1,60 2,0 2,28 2,67 3.33
30300 35700 43500 55500 77000 95300 125000 200000
1,0 1,18 1,435 1,83 2,54 3,14 4,13 6,6
Fig. 4.
