Acta Scientiarum Polonorum. Biotechnologia 3, 2008

Pełen tekst

(1)ACTA SCIENTIARUM POLONORUM Czasopismo naukowe zaoone w 2001 roku przez polskie uczelnie rolnicze. Biotechnologia Biotechnologia 7(3) 2008. Bydgoszcz Kraków Lublin Olsztyn Pozna Siedlce Szczecin Warszawa Wrocaw.

(2) Rada Programowa Acta Scientiarum Polonorum Kazimierz Banasik (Warszawa), Janusz Falkowski (Olsztyn), Florian Gambu (Kraków), Franciszek Kluza (Lublin), Edward Niedwiecki (Szczecin), Janusz Prusiski (Bydgoszcz), Jerzy Sobota (Wrocaw) – przewodniczcy, Stanisaw Socha (Siedlce), Waldemar Uchman (Pozna) Rada Naukowa serii Biotechnologia Danuta Witkowska (Wrocaw) – przewodniczca, Wodzimierz Bednarski (Olsztyn), Wodzimierz Grajek (Pozna), Anna Maraz (Budapeszt, Wgry), Zdzisaw Targoski (Lublin), Vesna Zechner-Krpan (Zagrzeb, Chorwacja). Korekta: Janina Szydowska mgr Elbieta Winiarska-Grabosz amanie Halina Sebzda Projekt okadki Daniel Morzyski. ISSN 1644–065X Wydanie publikacji dofinansowane ze rodków Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocawiu. © Copyright by Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocawiu, Wrocaw 2008. Redaktor Naczelny – prof. dr hab. Andrzej Kotecki ul. Sopocka 23, 50–344 Wrocaw, tel./fax (71) 328–12–77 e-mail: wyd@up.wroc.pl http://www.up.wroc.pl Nakad 200 + 16 egz. Ark. druk. 2,75 Druk i oprawa: Wydawnictwo Tekst Sp. z o.o. ul. Kossaka 72, 85–307 Bydgoszcz.

(3) Acta Sci. Pol., Biotechnologia 7(3) 2008, 3-16. OCENA ZDOLNOCI DRODY SACCHAROMYCES CEREVISIAE DO FERMENTACJI MONOSACHARYDÓW POCHODNYCH LAKTOZY Magorzata Lewandowska, Agnieszka Piotrowicz-Cielak Uniwersytet Warmisko-Mazurski w Olsztynie1 Streszczenie. Przeprowadzono charakterystyk przemysowych drody gorzelniczych Saccharomyces cerevisiae pod wzgldem zdolnoci do fermentacji monosacharydów, pochodnych laktozy. Oceniono ich naturalne predyspozycje do fermentacji podó z udziaem hydrolizatów laktozy (12%), jak równie szybko zuywania cukrów w testowym podou fermentacyjnym (6%glu+6%gal) w zalenoci od sposobu wstpnej propagacji drody: na typowym podou z glukoz lub na podoach adaptacyjnych: z galaktoz albo mannoz. Stwierdzono, e stenie alkoholu w uzyskanych po fermentacji pochodnych laktozy z udziaem badanych drody nie przekroczyo 4% v:v. Dziki przeprowadzonej analizie chromatograficznej sacharydów oceniono szybko ich wykorzystania w fermentujcej mieszaninie. Stwierdzono efekt opónienia wykorzystania galaktozy przez drode, wywoany zjawiskiem represji glukozy. Wstpna propagacja badanych drody na podoach adaptacyjnych przed procesem fermentacji spowodowaa przyspieszenie momentu asymilacji galaktozy, skutkujc zwikszeniem kocowego stenia alkoholu do 4,2–4,4% v:v. Sowa kluczowe: drode gorzelnicze, laktoza, fermentacja, etanol, represja glukozy. WSTP W ostatnich latach obserwuje si denie do rozwoju energetyki odnawialnej. Jest ono zwizane z ukierunkowaniem zainteresowa badawczych na wykorzystanie nadwyki podów rolnych czy te produktów ubocznych przemysu spoywczego, jak równie z intensywnym zmniejszaniem si zasobów kopalnych surowców energetycznych. Sporód biotechnologicznych metod sucych pozyskiwaniu energii mona wymieni. fermentacj alkoholow, której produkt – etanol moe by dodatkiem do benzyn. Gównym produktem ubocznym przemysu mleczarskiego jest serwatka, stanowica bogate ródo laktozy – dwucukru wykorzystywanego w ograniczonym zakresie, ze wzgldu na sab rozpuszczalno , nisk sodko i nietolerancj przez niektóre organizmy [Szczodrak 2000]. Adres do korespondencji – Corresponding author: Magorzata Lewandowska, Katedra Biotechnologii ywnoci, Uniwersytet Warmisko-Mazurski w Olsztynie, ul. Heweliusza 1, 10–718 Olsztyn; e-mail: malgorzata.lewandowska@uwm.edu.pl.

(4) 4. M. Lewandowska, A. Piotrowicz-Cielak. W wielu krajach rozwinitych gospodarczo, np. Irlandii, USA, Nowej Zelandii serwatk stosuje si jako surowiec do produkcji etanolu. Zainteresowanie otrzymywaniem etanolu z tego produktu ubocznego jest uzasadnione wzgldami takimi, jak moliwo. zaoszczdzenia tradycyjnych surowców (melasa, ziemniaki), koniecznoci ochrony rodowiska (BZT5 serwatki wynosi 30 g O2·dm-3); dobr jakoci kocowego produktu – nie odbiegajcego od jakoci alkoholu otrzymanego z tradycyjnych surowców [Molska 1985]. Ze wzgldu na coraz powszechniejsze wykorzystanie procesów membranowych w przetwórstwie mleka i serwatki spora ilo laktozy koniecznej do zagospodarowania pozostaje w permeacie, odcieku po ultrafiltracji [Gonzalez Siso 1996]. Pozbawiony biaek, bogaty w laktoz permeat moe by dobrym substratem do fermentacji alkoholowej. Wan przeszkod utrudniajc powszechne wykorzystanie wymienionych produktów odpadowych w gorzelnictwie jest mao atrakcyjna wydajno fermentacji etanolowej laktozy przez drode tzw. laktozowe, np. Kluyveromyces fragilis [Golubev i Golubev 2004]. Nie bez znaczenia jest równie poziom stenia wymienionego cukru w serwatce lub w permeacie decydujcy o wydajnoci procesu fermentacyjnego. Zawarto innych skadników, takich jak kwasy organiczne oraz zwizki azotowe i fosforowe – niezbdnych do prawidowego funkcjonowania drody, mona odpowiednio modyfikowa . Ze wzgldów ekonomicznych celowe wydaje si wic wykorzystanie permeatu lub serwatki w formie 2–3-krotnie skoncentrowanej. Takie dziaanie prowadzi z kolei do nadmiernego wzrostu cinienia osmotycznego obniajcego aktywno drody. Niezbdne wydaj si wówczas zabiegi powodujce czciowe odmineralizowanie koncentratu serwatki do zawartoci co najwyej 0,7–1,0% popiou [Popko i in. 1992]. Wród typowych drody gorzelniczych wystpuje wiele szczepów o wysokiej osmotolerancji, jednak nie s one z kolei w stanie bezporednio fermentowa laktozy ze wzgldu na brak odpowiedniego aparatu enzymatycznego. Warunkiem ich wykorzystania w fermentacji laktozy jest jej wspomaganie enzymatyczn hydroliz z udziaem

(5) -galaktozydazy. Powstajce w wyniku tego zabiegu cukry proste: glukoza i galaktoza nie podlegaj jednak fermentacji w efektywny sposób: zwizane jest to z powszechnym zjawiskiem represji katabolicznej, które towarzyszy wszelkim reakcjom zachodzcym w rodowisku zawierajcym kilka konkurencyjnych róde wgla. Glukoza jako substrat najatwiej przyswajalny wywiera inhibujcy wpyw na ekspresj genów odpowiedzialnych za aktywacj enzymów umoliwiajcych wykorzystanie konkurencyjnej galaktozy. Daje to efekt sekwencyjnego wykorzystywania dostpnych cukrów i skutkuje wydueniem procesu fermentacyjnego. Wikszo szczepów z gatunku S. cerevisiae charakteryzuje si wanie takimi waciwociami. Zdarzaj si jednak wyjtki, które w wikszym lub mniejszym stopniu s odporne na represj glukozy. Moe to by spowodowane zarówno naturalnymi cechami danego szczepu, jak i przypadkowymi mutacjami [Keating 2004]. Doniesienia literaturowe dotyczce zakresu bada prowadzonych nad problemem represji katabolicznej wskazuj, e nadal jest to problem nie rozwizany. Stosowanie adaptacji drobnoustroju na odpowiednim podou w celu indukcji biosyntezy zakodowanych w jego genomie enzymów moe prowadzi do wzrostu zdolnoci degradacyjnych okrelonego ksenobiotyku. Tego typu zabieg moe by porednio przyczyn mutacji prowadzcych do rozszerzenia szlaku metabolicznego (ekspansja horyzontalna) [Fiedurek 2007]. Techniki inynierii genetycznej pozwalaj na efektywne modyfikowanie podanych cech drobnoustrojów poprzez przenoszenie odpowiednich genów i ich amplifikacj [Olsson i Nielsen 2000, Rodriguez i wsp. 2003, Beccerra i in. 2002, Sedlak i Ho 2004, Rubio-Texeira 2005]. Badania prowadzone od szeregu lat. Acta Sci. Pol..

(6) Ocena zdolnoci drody .... 5. w tym kierunku wskazuj na czsto spotykan niestabilno mitotyczn konstruowanych szczepów bd te osabienie innych wanych cech (np. szybko wzrostu) [Rubio-Teixeira i in. 2000]. Niemniej jednak s to dziaania najbardziej obiecujce. Nieliczne literaturowe przykady bada dotyczcych poprawy zdolnoci fermentacyjnych drody S. cerevisiae bez ingerencji w DNA wiadcz o tym, e nie jest to atwe zadanie. Jednak skrining, adaptacja i mutacje naturalne s atwiej akceptowane przez potencjalnych producentów, ze wzgldu na panujc ogólnie niech do genetycznie modyfikowanych organizmów, a take z powodu skomplikowanych procedur legislacyjnych wymaganych do ich stosowania. Celem pracy bya charakterystyka naturalnych zdolnoci przemysowych drody Saccharomyces cerevisiae do fermentacji pochodnych laktozy oraz ocena wpywu zabiegów wstpnej propagacji na dynamik wykorzystania konkurencyjnych cukrów w podou fermentacyjnym. MATERIA I METODY BADA Surowcami do bada byy: zboowy zacier gorzelniczy pochodzcy z gorzelni w Bartku k. Morga, suszony permeat po ultrafiltracji serwatki pozyskany z Zakadu Mleczarskiego w Ostrowii Mazowieckiej oraz cukry – róda wgla do podó fermentacyjnych pochodzenia handlowego: laktoza (POCh), glukoza (POCh), D+galaktoza (Fluka), D+mannoza (Fluka). W dowiadczeniach wykorzystano ponadto handlowy preparat

(7) -D-galaktozydazy z A. oryzae (SIGMA). Materia badawczy stanowiy dwa szczepy przemysowych termofilnych drody gorzelniczych Saccharomyces cerevisiae AS4 oraz Sccharomyces cerevisiae D2 pozyskane z kolekcji SPG-IBPRS w Bydgoszczy. Drode hodowano na skosach YPG w temp. 38oC, przeszczepiajc co 30 dni na nowe podoe. Skad podoa YPG: 20 g glukozy, 20 g peptonu, 10 g ekstraktu drodowego, 20 g agaru rozpuszczono w 1 dm3 wody, ustalajc kwasowo na poziomie pH 5,0 przy udziale 1M roztworu HCl. Inoculum do procesu fermentacyjnego przygotowano na pynnym podou YPG. Dowiadczenia charakteryzujce zdolnoci fermentacyjne badanych szczepów drody prowadzono metod okresow w warunkach beztlenowych, stosujc nastpujce parametry: temp. 38oC, czas 72 h, dodatek inoculum – 10% (w postaci 24-h hodowli wstrzsanej na podou YPG), wykorzystujc nastpujce podoa fermentacyjne: zacier zboowy 16oBlg (próby kontrolne), podoe z permeatem (12% laktozy), podoe z laktoz (12%), podoe z glukoz i galaktoz (6%+6%). Kade z ww. podó uzupeniano ródami azotu i fosforu (9g (NH4)3PO4 i 3,75 g ekstraktu drodowego w 1 dm3), natomiast podoa z permeatem lub z laktoz uzupeniano dodatkiem preparatu

(8) -D-galaktozydazy w proporcji 1:100 (g:g) wzgldem laktozy. W trakcie fermentacji (co 24 h) oznaczano kwasowo (pH), ekstrakt rzeczywisty (oBlg), zawarto alkoholu (% v:v) oraz ilo wydzielonego CO2 (g). Na podstawie zawartoci alkoholu wyznaczono nastpujce wskaniki biotechnologiczne fermentacji: wydajno procesu – wyraon iloci wytworzonego 100%-procentowego alkoholu ze 100 kg dostpnego cukru [dm3A100·10-2 kg skrobi, laktozy lub heksozy] oraz sprawno fermentacji – jako % wydajnoci teoretycznej ze 100 kg skrobi, laktozy lub heksozy [%]. Na podstawie wielkoci emisji CO2 w kolejnych dobach procesu – okrelano energi fermentacji, wyraajc j w % wzgldem cakowitej. Biotechnologia 7(3) 2008.

(9) 6. M. Lewandowska, A. Piotrowicz-Cielak. iloci CO2 wydzielonego w trakcie caej fermentacji (w tym wypadku: 72 godz.). [Saek 1989]. Dowiadczenia charakteryzujce zdolnoci badanych drody do fermentacji pochodnych laktozy prowadzono na podou testowym z glukoz i galaktoz (6%glu+6%gal) w warunkach jw., stosujc inoculum w postaci 24-h hodowli wstrzsanej na podou YPG lub na podou adaptacyjnym, w którym glukoz zastpiono odpowiednim cukrem: galaktoz (YPGal) albo mannoz (YPMan). Oznacze charakteryzujcych zdolnoci fermentacyjne badanych drody dokonywano: w odstpach 2-godzinnych, oznaczajc zawarto cukrów (glukozy i galaktozy) w fermentujcym podou metod chromatografii gazowej, oraz w odstpach 3-godzinnych, mierzc ilo wydzielonego CO2 (wagowo) i na tej podstawie wyznaczajc energi fermentacji. W tym celu przeprowadzono 2 serie równolegych dowiadcze zainicjowane z 12-godzinnym przesuniciem czasowym. OMÓWIENIE I DYSKUSJA WYNIKÓW Charakterystyka szczepów drody gorzelniczych Szczep Saccharomyces cerevisiae As4 otrzymano w wyniku hybrydyzacji pciowej. Cechuje go dua trwao i atwo aklimatyzacji w lokalnych warunkach gorzelni. W trakcie fermentacji drode tego szczepu mog by stosowane przez wiele miesicy pod warunkiem, e zachowana jest czysto mikrobiologiczna. Komórki drody As4 s odporne na wysokie stenia alkoholu (do 12%) oraz na podwyszone cinienie osmotyczne rodowiska fermentacji spowodowane zwikszonym steniem cukrów w podou. Drode Saccharomyces cereviasiae D2 wyizolowano pod koniec lat osiemdziesitych. Charakteryzuj si odpornoci na kocowe stenie alkoholu do 12–14%. W gorzelniach stosowane s w postaci suszonej, co upraszcza proces technologiczny wytwarzania spirytusu, umoliwiajc rozpoczcie fermentacji w dowolnym czasie bez koniecznoci sporzdzania inoculum. Oba szczepy charakteryzuj si ponadto wysok dynamik tworzenia etanolu [Czupryski i in. 2004]. Przed rozpoczciem waciwych dowiadcze przeprowadzono kontrolne fermentacje z udziaem badanych drody, wykorzystujc do tego celu typowy zboowy zacier gorzelniczy o gstoci 16oBlg. Stwierdzono, e badane szczepy charakteryzoway si zblionymi zdolnociami fermentacyjnymi: wysoka energia fermentacji (74–79%) pozwolia na uzyskanie 6,4–6,7% v:v alkoholu w zacierze ju po 24 h. Kocowa zawarto alkoholu w zacierze wyniosa 7,88% (szczep D2) i 8,12% v:v (szczep As4), a cakowita sprawno procesu przekroczya warto 80% (tab. 1). Niewielkie rónice zaobserwowane pomidzy 2 i 3 dob fermentacji zarówno w wielkoci emisji CO2 (0,06– 0,07g·10-2 g podoa), jak i w steniu uzyskanego alkoholu w zacierze (0,05–0,21% v:v) dowiody, e proces dobieg koca. Byo to zgodne z charakterystyk opisow badanych szczepów wskazujc na ich predyspozycje do prowadzenia fermentacji 2–3-dobowych [Czupryski i in. 2004].. Acta Sci. Pol..

(10) Ocena zdolnoci drody .... 7. Tabela 1. Charakterystyka fermentacji zacieru zboowego (16oBlg) przez przemysowe szczepy drody gorzelniczych Saccharomyces cerevisiae As4 i D2 Table 1. Characteristics of cereal mash (16oBlg) fermentation by industrial strains of distillery yeast Saccharomyces cerevisiae As4 and D2 Szczep drody Strain of yeast Czas fermentacji Time of fermentation Wydzielony CO2 CO2 emission Energia fermentacji Fermentation energy Kwasowo. Acidity Ekstrakt rzeczywisty Real extract Zawarto alkoholu Alcohol concentration Wydajno. Productivity Sprawno cakowita fermentacji Total fermentation efficiency. S. cerevisiae As4. S. cerevisiae D2. 24 h. 48 h. 72 h. 24h. 48 h. 72 h. 4,46. 5,97. 6,03. 4,85. 5,99. 6,06. [%]. 74,05 98,97. 100. 79, 97. 98,84. 100. [pH]. 4,22. 4,17. 4,07. 4,27. 4,27. 4,01. [oBlg]. 3,27. 1,90. 1,43. 2,70. 1,68. 1,60. [% v:v]. 6,43. 7,91. 8,12. 6,76. 7,83. 7,88. -2. [g·10 g podoa] [g·10-2 g medium]. [dm3 A100 ·10-2 kg skrobi] [dm3 A100 ·10-2 kg starch]. 46,37 57,07 58,61 48,77 56,49 56,88. [%]. 64,56 79,46 81,61 67,91 78,66 79,20. Ocena naturalnych zdolno ci drody S. cerevisiae do fermentacji monosacharydów pochodnych laktozy W pierwszej czci bada przeprowadzono fermentacj podó zawierajcych laktoz lub jej pochodne. Dowiadczenia, w których ródem wgla bya czysta laktoza albo jej koncentrat (permeat), wspomagano dodatkiem preparatu enzymatycznego

(11) -D-galaktozydazy. Oba szczepy badanych drody wykazyway si ograniczonymi zdolnociami do fermentacji pochodnych laktozy, czego efektem by niski poziom alkoholu w podoach po 72 h procesu: od 3,17 do 3,70% v:v, co odpowiadao 42–48% sprawnoci procesu (tab. 2). Nie stwierdzono istotnego wpywu rodzaju cukru w podou na przebieg procesu (rys. 1). Szczep drody D2 wykazywa si minimalnie korzystniejszymi zdolnociami do odfermentowania cukrów prostych: glukozy i galaktozy ni szczep As4. Fermentacja etanolowa podoa z permeatem z udziaem tego ostatniego przebiegaa równie mniej wydajnie: zawarto alkoholu po 72 h procesu bya o ok. 0,5% nisza ni w analogicznym dowiadczeniu z udziaem drody D2. Wynikao to zapewne z faktu, e permeat oprócz laktozy zawiera frakcje niskoczsteczkowych biaek oraz zwizki mineralne, które mogy utrudnia przebieg hydrolizy i fermentacji laktozy. Wydajno procesu mierzona iloci pozyskanego alkoholu (w przeliczeniu na EtOH 100-procentowy) ze 100 kg dostpnego cukru miecia si w granicach 26,5–27,9 dm-3 (szczep As4) oraz 29,5–30,5 dm-3 (szczep D2) i w adnym z dowiadcze nie przekroczya 50% wydajnoci teoretycznej (tab. 2). wiadczyo to niewtpliwie o sabych zdolnociach badanych drody do fermentacji pochodnych laktozy – a w szczególnoci do wykorzystania galaktozy – cukru objtego problemem represji. Podoe 6%glu+6%gal wybrano do dalszych dowiadcze jako podoe testowe do przeledzenia szybkoci odfermentowywania kadego z zawartych w nim cukrów w zalenoci od zastosowanych zabiegów zmierzajcych do ograniczenia represji katabolicznej glukozy.. Biotechnologia 7(3) 2008.

(12) M. Lewandowska, A. Piotrowicz-Cielak. 8. Tabela 2. Charakterystyka 72-h fermentacji podó zawierajcych pochodne laktozy z udziaem drody Saccharomyces cerevisiae As4 lub D2. Table 2. Characteristics of 72-h fermentation of media containing lactose derivatives with yeast Saccharomyces cerevisiae As4 or D2 Szczep drody Strain of yeast. S. cerevisiae As4. S. cerevisiae D2. z permeatem (12% 12% z permeatem 12% laktozy) laktozy 6% glu (12% laktozy) laktozy 6% glu with 12 % +6% gal with permeate 12% +6% gal permeate lactose (12% lactose) lactose (12% lactose). Rodzaj podoa Kind of medium. Wydzielony CO2 [g·10-2 g podoa] CO2 emission [g·10-2 g medium] Energia fermentacji [%] Fermentation energy Kwasowo. [pH] Acidity Ekstrakt rzeczywisty [oBlg] Real extract Zawarto alkoholu [% v:v] Alcohol concentration Wydajno. [dm3 A100 ·10-2 kg laktozy lub heksozy] Productivity [dm3 A100 ·10-2 kg lactose or hexose] Sprawno cakowita fermentacji [%] Total fermentation efficiency. 2,34. 2,53. 2,45. 2,51. 2,56. 2,61. 89,89. 93,38. 94,99. 92,34. 94,07. 95,03. 4,6. 4,07. 3,95. 4,54. 4,11. 3,87. 7,30. 6,47. 6,45. 7,73. 6,40. 6,55. 3,18. 3,35. 3,41. 3,66. 3,54. 3,70. 26,53. 27,92. 26,99. 30,50. 29,50. 29,28. 41,94. 44,14. 42,60. 48,22. 46,68. 46,23. Czas fermentacji Fermentation time 4. 24. 48. 72. Zawarto alkoholu [% v:v] Alcohol content. 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 As4. D2. As4. D2. As4. D2. 2% laktozy. permeat (12% laktozy). 12% lactose. permeate (12% lactose). 6% glu+6% gal. Rys. 1. Zmiany zawartoci alkoholu w trakcie 72-h fermentacji podó z laktoz lub jej pochodnymi z udziaem drody Saccharomyces cerevisiae As4 lub D2 Fig. 1. Changes in alcohol content during 72-h fermentation of media containing lactose and its derivatives with yeast Saccharomyces cerevisiae As4 or D2. Acta Sci. Pol..

(13) Ocena zdolnoci drody .... 9. Wpyw adaptacji na szybko wykorzystania monosacharydów pochodnych laktozy Postanowiono przeledzi cay zakres czasowy 72-h procesu fermentacyjnego, analizujc jego przebieg na podstawie pomiarów energii fermentacji oraz szybkoci wykorzystywania dwóch konkurencyjnych cukrów w podou. Drode przed fermentacj poddano wstpnej adaptacji na podoach z dodatkiem galaktozy lub mannozy. Celowo stosowania adaptacji drobnoustrojów do odpowiednich substratów przed waciwym procesem biotechnologicznym – zostaa potwierdzona w wielu badaniach [Fiedurek 2004, Belinchón 2003, Ostergaard i in. 2001]. Indukcyjny wpyw substratu lub jego analoga wyzwala wczeniejsz sekrecj odpowiednich enzymów, powodujc tym samym przyspieszenie procesu. W omawianych dowiadczeniach badane szczepy inkubowano wstpnie na podou z glukoz (próba kontrolna: cukier-represor), galaktoz (cukier-induktor) oraz z mannoz (cukier neutralny). Neutralne oddziaywanie mannozy wzgldem glukozy w procesie fermentacyjnym sygnalizowali w swoich badaniach Smith i in. [1999]. Wykazali, e mieszanina glukozy z mannoz bya wykorzystywana przez badane drode w tempie nieomal identycznym, jak kontrolne podoe z sam glukoz. Dwutlenek wgla i alkohol stanowi gówne produkty fermentacji etanolowej. Intensywno wydzielania CO2 jest zatem adekwatna do szybkoci tworzenia etanolu. W dowiadczeniach, w których zastosowano drode Saccharomyces cerevisiae As4, wczeniej poddane adaptacji na podou z dodatkiem galaktozy lub mannozy, emisja CO2 od 6 h fermentacji bya wiksza ni w próbach kontrolnych. (rys. 2A). Zdecydowanie intensywniej przebiegaa fermentacja z udziaem szczepu As4 adaptowanego na podou z mannoz – po pierwszej dobie procesu rónica w iloci wydzielonego CO2 wzgldem próby kontrolnej wyniosa ponad 0,5g·10-2g podoa. Od 36 h procesu zwikszon intensywno odfermentowania zaobserwowano w próbach, w których zastosowano drode po wstpnej adaptacji na galaktozie. Ostatecznie, wanie w tym przypadku po 72 h procesu uzyskano najwiksze rónice w iloci wytworzonego alkoholu: 4,21% (v:v) wobec 3,63% (adaptacja drody na mannozie) oraz 3,41% (brak adaptacji – podoe standardowe YPG) (tab. 2 i 3). Drode S. cerevisiae D2 okazay si mniej podatne na adaptacj w wyej wymienionych warunkach. Ilo CO2 wydzielonego w trakcie fermentacji z ich udziaem bya zbliona we wszystkich trzech dowiadczeniach . Zaobserwowano niewielki wpyw zabiegu adaptacji na podou z mannoz – w odniesieniu do próby kontrolnej emisja CO2 od 33 h do koca fermentacji bya wysza o ok. 0,3 g·10-2g. Mogo to jednak wynika z ich naturalnych, korzystniejszych ni u drody As4, predyspozycji do wykorzystywania obu konkurencyjnych cukrów, o czym wiadcz wyniki prezentowane na rysunku 1. Szybko wykorzystania glukozy i galaktozy w podou testowym w trakcie 72 h fermentacji kontrolnej, z udziaem obu szczepów, oceniona na podstawie pomiarów chromatograficznych zostaa zobrazowana na rysunku 3. Obydwa szczepy drody wykorzystay glukoz zawart w podou przed 30 h fermentacji. Galaktoza w nieznacznym stopniu zostaa wykorzystana przez drode As4 ju od 28 h procesu, natomiast w fermentacji z udziaem S. cerevisiae D2 zaobserwowano wyrane zjawisko „diauksji”, charakteryzujce si przeduonym okresem fazy spoczynkowej (do 52 h) potrzebnej zapewne drodom do zaindukowania syntezy enzymów galaktolitycznych. Podobne rezultaty odnotowali Rønnow i in. [1999], analizujc zuycie glukozy i galaktozy w podou fermentowanym przez przemysowe drode S. cerevisiae DGI342. Obserwowane stadium opónienia w wykorzystaniu galaktozy potwierdzili równie zmniejszeniem przyrostu biomasy oraz zwolnieniem tempa wytwarzania etanolu.. Biotechnologia 7(3) 2008.

(14) Wydzielony CO2 [g · 10 g] CO2 emission. 30. 36. 42. 48. 54. 60. 66. 72. glukoza. galaktoza. mannoza. 0. 24. 0. 18. 0,5. 0,5. 12. 1. 1. 6. 1,5. 1,5. 0. 2. 2,5. 3. 2. 2,5. A. 0. 6. B. 12. 24. glucose. 18. 36. 42. galactose. 30. 48. 60. mannose. 54. 66. 72. Rys. 2. Intensywno wydzielania CO2 w trakcie fermentacji podoa testowego (6%glu+6%gal) z udziaem drody S. cerevisiae As4 (A) lub D2 (B) wstpnie adaptowanych na podou z udziaem galaktozy lub mannozy (glukoza – próba kontrolna) Fig. 2. Intensity of CO2 emission during fermentation of test medium (6%glu+6%gal) with yeast S. cerevisiae As4 (A) or D2 (B) subjected to preliminary adaptation on medium containing galactose or mannose (glucose – control sample). -2. 3. 10 M. Lewandowska, A. Piotrowicz-Cielak. Acta Sci. Pol..

(15) Ocena zdolnoci drody .... 11. Tabela 3. Charakterystyka 72-h fermentacji podoa testowego (6%glu 6%gal) z udziaem drody S. cerevisiae As4 lub D2 poddanych wstpnej propagacji na podoach adaptacyjnych Table 3. Characteristics of 72-h fermentation of test medium (6%glu 6%gal)with yeast S. cerevisiae As4 or D2 subjected to preliminary propagation on adaptive media Szczep drody S. cerevisiae AS4 Strain of yeast Rodzaj podoa adaptacyjnego z galaktoz z mannoz Kind of adaptive medium with galactose with mannose Wydzielony CO2 [g·10-2 g podoa] 2,78 2,64 CO2 emission [g·10-2 g medium] Energia fermentacji po 48 h [%] 89,57 93,56 Fermentation energy after 48 h Kwasowo. [pH] 3,91 3,92 Acidity o Ekstrakt rzeczywisty [ Blg] 5,5 7,1 Real extract Zawarto alkoholu [% v:v] 4,21 3,63 Alcohol concentration Wydajno. [dm3 A100 ·10-2 kg heksozy] 33,32 28,73 Productivity [dm3 A100 ·10-2 kg hexose] Sprawno cakowita fermentacji [%] 52,17 44,99 Total fermentation efficiency. S. cerevisiae D2 z galaktoz with galactose. z mannoz with mannose. 2,61. 2,68. 93,56. 91,88. 3,53. 3,78. 6,8. 5,06. 3,87. 4,37. 30,63. 34,58. 47,96. 54,16. 70. Zawarto cukrów -3 [g·dm ] Sugars content. 60 50 40 30 20 10 0 12. 18. 24. 30. As4-glu. 36. 42. As4-gal. 48. 54. D2-glu. 60. 66. 72. D2-gal. Rys. 3. Wykorzystanie glukozy i galaktozy w podou testowym (6%glu+6%gal) w trakcie 72-h fermentacji z udziaem drody S. cerevisiae D2 lub As4 Fig. 3. Utilization of glucose and galactose in test medium (6% Glu+6%Gal) during 72-h fermentation with yeast S.cerevisiae D2 or As4. Oceniajc drode wstpnie adaptowane na podou z galaktoz, stwierdzono wyrane rónice w szybkoci wykorzystania cukrów podoa testowego (rys. 4A). Szczep D2 jak poprzednio odfermentowa glukoz ok. 26 h procesu, natomiast wykorzystywanie galaktozy rozpocz ju od 30 h a nie jak uprzednio po 52 h. Drode S. cerevisiae As4 po adaptacji na galaktozie zareagoway opónieniem wykorzystania glukozy o ok. 6 h,. Biotechnologia 7(3) 2008.

(16) 12. M. Lewandowska, A. Piotrowicz-Cielak. jednoczenie rozpoczynajc asymilacj galaktozy od 32 h procesu (glukoza w tym czasie jeszcze bya obecna w podou). Zarówno drode As4, jak i D2 w tym dowiadczeniu wykazay si poprawionymi zdolnociami do wykorzystywania galaktozy – kocowa jej zawarto w podou po 72 h wyniosa odpowiednio: 42,7 oraz 47,5 g · dm-3 wobec 54,9 oraz 50,1 g · dm-3 odnotowanych w fermentacjach kontrolnych. Znalazo to odwzorowanie w iloci wytworzonego alkoholu 4,21 wobec 3,41% v:v (szczep As4) oraz 3,87 wobec 3,70% v:v (szczep D2) (tab. 3). Odmienne rezultaty uzyskali Keating i in. [2004] podczas swoich bada nad szczepem S. cerevisiae Y 1528, wykazujcym szczególne uzdolnienia do asymilacji galaktozy. Badane drode szybciej wykorzystay oba dostpne cukry (3% glukozy+3% galaktozy) po zastosowaniu adaptacji na glukozie (6 h) ni po adaptacji na galaktozie (24 h). Wstpna propagacja szczepów As4 i D2 na podou z mannoz spowodowaa inn, ni w poprzedniej czci dowiadczenia, reakcj badanych drody (rys. 4B). S. cerevisiae As4 fermentowa cukry w podou niemal w identyczny sposób, jak w dowiadczeniu kontrolnym (niewielkie wykorzystanie galaktozy od momentu zuycia glukozy – tj. od 28–30 godziny fermentacji). Stenie alkoholu w podou po 72 h procesu wynioso 3,63% v:v, przy kocowej zawartoci galaktozy: 51,8 g·dm-3 podoa. Odpowied drody S. cerevisiae D2 na zastosowane rodowisko derepresyjne bya zdecydowanie odmienna: zaobserwowano wprawdzie zjawisko diauksji, lecz okres ten trwa krócej, skutkujc nastpnie znacznie intensywniejszym wykorzystaniem galaktozy – do kocowego poziomu 31,3 g·dm-3 podoa. Dao to jednoczenie pozytywny efekt w postaci 4,37% v:v alkoholu w odfermentowanym podou (tab. 3). Mannoz w swoich dowiadczeniach zastosowali równie Dynessen i in. [1998], oceniajc wpyw jej obecnoci w podou na represj inwertazy u drody S. cerevisiae. Wykazali, e obecno tego cukru obok sacharozy w rodowisku fermentacyjnym nie wywouje zjawiska represji katabolicznej (w przeciwiestwie do glukozy lub fruktozy). Prawdopodobnym wytumaczeniem moe by to, e mannoza w odrónieniu od ww. cukrów nie jest fosforylowana przez heksokinazy PI i PII, lecz przez glukokinaz – enzym nie wywoujcy represji katabolicznej [Rose i in.1991, Winde i in. 1996]. Oceniajc wskaniki biotechnologiczne fermentacji, naley stwierdzi , e przeprowadzone zabiegi adaptacyjne wpyny w pewnym stopniu na popraw zdolnoci badanych drody do fermentowania konkurencyjnych cukrów (wzrost wydajnoci o 6,33 dm3 A100 ·10-2 kg heksozy w trakcie fermentacji z udziaem szczepu As4 po adaptacji na galaktozie oraz o 5,3 dm3 A100 ·10-2 kg heksozy z wykorzystaniem D2 adaptowanego na mannozie). Znalazo to odwzorowanie w prawie 10-procentowym wzrocie sprawnoci cakowitej: 9,57% (As4) i 7,93% (D2). Mona jednak równie wnioskowa o wysokiej stabilnoci metabolicznej ocenianych szczepów, dedykowanych gównie w kierunku fermentacji przemysowej, w której wykorzystuje si typowe surowce gorzelnicze. Verstrepen i in. [2004] analizujc efekty represji katabolicznej w odniesieniu do drody przemysowych wykazali, e szereg operacji wstpnych, np. dugotrwaa propagacja drody na podoach bogatych w glukoz, moe wywoywa dugoterminow utrat ich zdolnoci do fermentacji alternatywnych cukrów. Przykadem mog by. dane uzyskane z szeregu browarów wskazujce na upoledzenie zdolnoci drody do fermentacji maltozy wskutek przeduonego ich prowadzenia na podoach bogatych w sacharoz. [Kuthan i in. 2003].. Acta Sci. Pol..

(17) Biotechnologia 7(3) 2008 48. 54. 60. 66. 72. As4 glu As4 gal. 0 42. 0. 36. 10. 10. 30. 20. 20. 24. 30. 30. 18. 40. 40. 12. 50. 60. 50. 60. 70. 18. D2-glu. 12. 24. 30. 36. 48. D2-gal. 42. 54. 60. 66. 72. Rys. 4. Wykorzystanie glukozy i galaktozy w podou testowym (6%glu+6%gal) w trakcie 72-h fermentacji z udziaem drody S. cerevisiae D2 lub As4, wstpnie adaptowanych na podou z galaktoz (A) lub mannoz (B) Fig. 4. Utilization of glucose and galactose in test medium (6%glu+6%gal) during 72-h fermentation with yeast S. cerevisiae D2 or As4, subjected to preliminary adaptation on medium containing galactose (A) or mannose (B). Zawarto cukrów [g·10 cm ] Sugars content. -3. -3. 70. Ocena zdolnoci drody .... 13.

(18) 14. M. Lewandowska, A. Piotrowicz-Cielak. Wheals i in. [1999] wskazuj, e wprowadzenie urozmaiconych róde wgla na etapie propagacji mikroorganizmów moe przyczyni si do rozszerzenia gamy przyswajanych substratów, a co za tym idzie – zagospodarowania np. produktów odpadowych. Teunissen i in. [2002 ] oraz Van Dijck i wsp. [2000] podkrelaj wielk rol inynierii genetycznej do otrzymywania mikroorganizmów rekombinowanych, zwaszcza w odniesieniu do biaek heterogenicznych czy biofarmaceutyków, gdzie wykorzystanie GMO jest mniej kontrowersyjne. Nie dyskredytuj jednak prostych i skutecznych metod opartych na selekcji i naturalnych mutacjach szczepów przemysowych, które prowadz do bardziej zrównowaonych osigni . PODSUMOWANIE Dowiadczenia przedstawione w niniejszej pracy wskazuj na róne zachowania typowych drody gorzelniczych szczepów As4 i D2 w warunkach fermentacji kilku konkurencyjnych cukrów. Sugeruj równie, e wykorzystanie innych ni glukoza róde wgla do wstpnej propagacji przed waciwym procesem fermentacyjnym zwiksza moliwoci wykorzystania galaktozy w podou fermentacyjnym. Zastpienie atwo przyswajalnego cukru substratem nie powodujcym represji katabolicznej daje szans poprawy wydajnoci procesu fermentacyjnego prowadzonego z wykorzystaniem wglowodanów niekonwencjonalnych. PIMIENNICTWO Beccerra M., Diaz Prado S., Rodriguez-Belmonte E., Cerdán M.E., González Siso M.I., 2002. Metabolic engineering for direct lactose utilization by Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Lett. 24, 1391–1396. Belinchon M., Gancedo J.M., 2003. Xylose and some non-sugar carbon sources cause catabolite repression in Saccharomyces cerevisiae. Arch. Microbiol. 180, 293–297. Czupryski B., Wolska M., Kotarska K., Kosowski G., 2004. Charakterystyka szczepów drody stosowanych w gorzelnictwie rolniczym. Agro Przemys. 1, 32–34. Dynessen J., Smith H.P., Olsson L., Nielsen J., 1998. Carbon catabolite repression of invertase during batch cultivations of Saccharomyces cerevisiae: the role of glucose, fructose, and mannose. Appl. Microbiol. Biotechnol. 50, 579–582. Fiedurek J., 2007. Podstawy biotechnologii przemysowej, pr. zbior. pod red. W. Bednarskiego i J. Fiedurka. WNT, Warszawa. Golubev W.J, Golubev N.W., 2004. Selection and Study of Potent Lactose-Fermenting Yeasts – Appl. Biochem. Microbiol. 3, 280–284. Gonzales Siso M.I., 1996. The biotechnological utilization of cheese whey: a review. Biores. Technol. 57, 1–11. Keating J.D., Robinson J., Bothast R.J., Saddler J.N., Mansweld S.D., 2004. Characterizaction of a unique ethanologenic yeast capable of fermenting galactose. Enzyme Microb. Technol. 35, 242–253. Kuthan, M., Devaux F., Janderová B., Slaninová I., Jacq C., Palková Z., 2003. Domestication of wild Saccharomyces cerevisiae is accompanied by changes in gene expression and colony morphology. Mol. Microbiol. 47, 745–754. Molska I., 1985. Otrzymywanie etanolu z serwatki na skal przemysow. Przem. Spo., t. XXXV, 227–229.. Acta Sci. Pol..

(19) Ocena zdolnoci drody .... 15. Olsson L., Nielsen J., 2000. The role of metabolic engineering in the improvement of Saccharomyces cerevisiae: utilization of industrial media. Enzyme Microb. Technol. 26, 785–792. Ostergaard S., Olsson L., Nielsen J., 2001. In Vivo Dynamics of Galactose Metabolism in Saccharomyces cerevisiae: Metabolic Fluxes and Metabolite Levels. Biotechnol. Bioeng. 73, 5, 412–425. Popko R., Popko H., Hys L., 1992. Kierunki przemysowego przetwórstwa serwatki: Przegl. Mlecz., 199 – 200 Rodriguez C., Sanz P., Gancedo C., 2003. New mutations of Saccharomyces cerevisiae that partially relieve both glucose and galactose repression activate the protein kinase Snf1. FEMS Yeast Res. 3, 77–84. Rose M., Albig W., Entian K.D., 1991. Glucose repression in Saccharomyces cerevisiae is directly associated with hexose phosphorylation by hexokinases PI and PII. Eur J Biochem 199, 511–518. Rønnow B., Olsson L., Nielsen J., Mikkelsen J.D., 1999. Derepression of galactose metabolism in melibiase producing bakers’ and distillers’ yeast. J. Biotechnol. 72, 213–228. Rubio-Texeira M., Arevalo-Rodrguez M., Lequerica J.L., Polaina J., 2000. Lactose utilization by Saccharomyces cerevisiae strains expressing Kluyveromyces lactis LAC genes. J. Biotechnol. 84, 97–106. Rubio-Texeira M., 2005. A comparative analysis of the GAL genetic switch between not-sodistant cousins: Saccharomyces cerevisiae versus Kluyveromyces lactis. FEMS Yeast Res. 5, 1115–1128. Saek A., 1989. Studia nad amplifikacj cech technologicznych drody, Zesz. Nauk. ART w Olsztynie, 22. Sedlak M. Ho N., 2004. Production of Ethanol from Cellulosic Biomass Hydrolysates Using Genetically Engineered Saccharomyces Yeast Capable of Cofermenting Glucose and Xylose. Appl. Biochem. Biotechnol., 114, 1–3, 403–416. Szczodrak J., 2000. Hydrolysis of lactose in whey permeate by immobilized

(20) -galactosidase from Kluyveromyces fragilis. J. Mol. Cat. B: Enzymatic, 10, 631–637. Teunissen A., Dumortier F., Gorwa M.F., Bauer J., Tanghe A., Loïez A., Smet P., Van Dijck P., Johan M. Thevelein J.M., 2002. Isolation and characterization of a freezetolerant diploid derivative of an industrial baker’s yeast strain and its use in frozen doughs. Appl. Environ. Microbiol. 68, 10, 4780–4787. Van Dijck P., Ma P., Versele M., Gorwa M.F, Colombo S., Lemaire K., Bossi D., Loïez A., Thevelein J.M., 2000. A baker’s yeast mutant (fil1) with a specific, partially inactivating mutation in adenylate cyclase maintains a high stress resistance during active fermentation and growth. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2, 521–530. Verstrepen K.J., Iserentant D., Malcorps P., Derdelinckx G., van Dijck P., Winderickx J., Pretorius I.S., Thevelein J.M. and Delvaux F.R., 2004. Glucose and sucrose: hazardous fastfood for industrial yeast?. Trends Biotechnol. 22, 531–537. Wheals A.E., Basso L.C., Alves D.M, Amorim H.V., 1999. Fuel ethanol after 25 years. Trends Biotechnol. 17, 482–487. Winde J.H. de, Crauwels M., Hohmann S., Thevelein J.M., Winderickx J., 1996. Differential requirement of the yeast sugar kinases for sugar sensing in establishing the cataboliterepressed state. Eur. J. Biochem 24, 633–643.. Biotechnologia 7(3) 2008.

(21) 16. M. Lewandowska, A. Piotrowicz-Cielak. EVALUATION OF S. CEREVISIAE YEAST CAPACITY FOR FERMENTATION OF MONOSACCHARIDE LACTOSE DERIVATIVES. Abstract. The industrial distillery yeast Saccharomyces cerevisiae was determined for its capacity to ferment monosaccharide lactose derivatives. Analyses were carried out to examine their natural predisposition for fermentation of media with lactose hydrolysates (12%) and in addition, the rate of saccharides utilization in the experimental fermentation medium (6% glu/6% gal) was monitored as affected by the method of preliminary propagation of yeast: on standard medium with glucose or on adaptive media with galactose or mannose. It was demonstrated that the level of lactose derivatives attenuation by the yeast examined did not exceed 4% v:v alcohol. A chromatographic analysis of the saccharides enabled determining the rate of their utilization in the fermenting mixture. The effect of delayed utilization of galactose by the yeast was found to be evoked by the phenomenon of glucose repression. The preliminary propagations of the analyzed yeast on adaptive media before the fermentation process caused the acceleration of galactose assimilation, resulting in increased alcohol content in fermented media to 4.2-4.4% v:v. Key words: distillery yeast, lactose, fermentation, ethanol, glucose repression. Zaakceptowano do druku – Accepted for print: 29.09.2008 Do cytowania – For citation: Lewandowska M., Piotrowicz-Cielak A., 2008. Ocena zdolnoci drody Saccharomyces cerevisiae do fermentacji monosacharydów pochodnych laktozy. Acta Sci. Pol. Biotechnol. 7(3), 3–16.. Acta Sci. Pol..

(22) Acta Sci. Pol., Biotechnologia 7(3) 2008, 17-26. BIOSYNTEZA KWASU CYTRYNOWEGO Z GLICEROLU PRZEZ DRODE YARROWIA LIPOLYTICA IMMOBILIZOWANE W CHITOZANIE I POLIWINYLOALKOHOLU* Waldemar Rymowicz Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocawiu1 Streszczenie. Drode Yarrowia lipolytica Wratislavia AWG7 immobilizowano w rónych elach chitozanowych oraz poliwinyloalkoholowych i stosowano do biosyntezy kwasu cytrynowego z glicerolu. W 7-dobowych hodowlach wstrzsanych immobilizowane komórki drody produkoway od 0 do 17,5 gl-1 kwasu cytrynowego. Biokatalizator chitozanowy typu CH+TP+AG i poliwinyloalkoholowy typu PVA+A produkoway kwas cytrynowy z najwysz szybkoci i wydajnoci odpowiednio; 2,5 g l-1d-1 i 0,54 gg-1 oraz 2,5 g l-1d-1 i 0,52 gg-1. Sowa kluczowe: chitozan, alkohol poliwinylowy, puapkowanie, kwas cytrynowy, Yarrowia lipolytica. WSTP W przemysowej produkcji kwasu cytrynowego na drodze mikrobiologicznej wykorzystywane s przede wszystkim grzyby strzpkowe z gatunku Aspergillus niger [Anastassiadis i in. 2008]. Wci rosnce zapotrzebowanie na kwas cytrynowy i jego sole (w roku 2007 wiatowa produkcja kwasu cytrynowego wynosia 1,4 mln ton rocznie) powoduje konieczno poszukiwania nowych i tanich technologii jego produkcji [Kamzolova i in. 2005]. Zastosowanie rónych gatunków drody do biosyntezy kwasu cytrynowego, takich jak Candida lipolytica, C. tropikalis, C. oleophila czy Yarrowia lipolytica, moe by jednym z alternatywnych rozwiza technologicznych [Anastassiadis i in. 2008]. Przedmiotem wnikliwych bada z zakresu drodowej fermentacji cytrynowej byy zagadnienia zwizane z wyjanieniem mechanizmów nadprodukcji * Praca wykonana w ramach grantu 2P06T 044 30 finansowanego przez MNiSZW w latach 2006–2009. Adres do korespondencji – Corresponding author: Waldemar Rymowicz, Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii ywnoci, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocawiu, ul. Norwida 25, 50–375 Wrocaw, e-mail: waldemar.rymowicz@up.wroc.pl.

(23) 18. W. Rymowicz. tego kwasu przez drode, aktywnoci podstawowych enzymów cyklu Krebsa odpowiedzialnych za wydzielanie tego metabolitu do rodowiska oraz charakterystyka systemów hodowlanych z zastosowaniem komórek wolnych i immobilizowanych [Rymowicz i in. 2005, Soccol i in. 2006]. Drode wykorzystywane w procesach biosyntezy kwasu cytrynowego przez immobilizowane komórki unieruchamiano w takich nonikiach jak: alginian, karagen, poliakryloamid czy wiórki drzewne, a gównym ródem wgla w takich procesach bya glukoza [Tisnadjaja i in. 1996, Maddox i Kingston 1983]. W ostatnich latach dostpnym i tanim surowcem stosowanym w rónych procesach biotechnologicznych jest gliceryna. Odpadowa gliceryna, generowana w procesie produkcji biodiesla, z powodzeniem zostaa uyta w procesie biosyntezy kwasu cytrynowego przez drode Yarrowia lipolytica [Imandi i in. 2007, Papanikolaou i in. 2002, Rymowicz i in. 2006, 2008]. Gliceryna nie bya natomiast stosowana w procesach biosyntezy kwasu cytrynowego przez immobilizowane komórki drody. Wykorzystanie unieruchomionych komórek drody w procesach pócigej i cigej produkcji kwasu cytrynowego stwarza liczne problemy technologiczne. Stosowane proste noniki, takie jak alginianowe czy karacenowe, ulegaj w czasie procesu cieraniu i rozpynnieniu w obecnoci jonów jednowartociowych czy zwizków chelatujcych wap. Powoduje to obnienie produktywnoci procesu, co zwizane jest z uwalnianiem i przechodzeniem komórek z matrycy elu do rodowiska hodowlanego. Niekorzystny wpyw ma równie zastosowanie noników o duej rednicy ziaren, gdy powoduje to wystpienie bariery dyfuzyjnej dla tlenu i substratów w wewntrznych rejonach biokatalizatora. Natomiast noniki syntetyczne, np. poliakryloamidowe, mog wykazywa toksyczny wpyw na mikroorganizmy, a tym samym powodowa znaczne obnienie aktywnoci kwasotwórczej drody [Maddox i Kingston 1983, Rymowicz 1998, 2003, Rymowicz i in. 1993]. W ostatnich latach wiele uwagi powica si wykorzystaniu chitozanu lub alkoholi poliwinylowych (PVA) do immobilizacji caych komórek i enzymów. Uycie alkoholu poliwinylowego, jako nonika do immobilizacji, zostao zainicjowane okoo 20 lat temu. Noniki PVA charakteryzuj si brakiem toksycznoci w stosunku do mikroorganizmów, s trwae, stabilne chemicznie i mechanicznie. Zalet tych noników jest równie niska cena i powszechna dostpno [Chang i Tseng 1998, Yujian i in. 2006, Dave i Madamwar 2006]. Podobnymi cechami charakteryzuj si take noniki chitozanowe, które wykazuj cenne waciwoci, a mianowicie s biodegradowalne, biokompatybilne, nietoksyczne i podatne na modyfikacje chemiczne ze wzgldu na obecno grup aminowych i hydroksylowych w strukturze chitozanu [Rinaudo 2006]. W procesach biotechnologicznych biokatalizatory chitozanowe wykorzystywano w ksztacie kapsuek, wókien oraz membran [Huang i in. 2004, Krajewska 2004, Rinaudo 2006, Shepherd i in. 1997]. Ze wzgldu na szereg zalet jakie wykazuj noniki chitozanowe i PVA, wydaje si celowe zbadanie przydatnoci takich noników do puapkowania drody i zastosowania ich w drodowej fermentacji cytrynowej. Celem podjtych bada by dobór optymalnych warunków puapkowania drody Yarrowia lipolytica w chitozanie i w alkoholu poliwinylowym, z przeznaczeniem do biosyntezy kwasu cytrynowego z glicerolu oraz ocena stabilnoci chemicznej i mechanicznej takich biokatalizatorów.. Acta Sci. Pol..

(24) Biosynteza kwasu cytrynowego .... 19. MATERIAY I METODY Mikroorganizm. W badaniach wykorzystano mutanta octanowego (oct-) drody Yarrowia lipolytica Wratislavia AWG7 pochodzcego z kolekcji wasnej Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii ywnoci Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocawiu. Szczep przechowywano na skosach YM pod parafin w temperaturze 4oC. Substrat. W eksperymentach zastosowano gliceryn techniczn jako substrat o stopniu czystoci 98% (v/m) pochodzc z POCH – Gliwice. Podoa hodowlane. W procesie puapkowania wykorzystywano biomas drody namnoon w podou o skadzie (gl-1): glicerol – 100; KH2PO4 – 0,2; NH4Cl – 4; MgSO4 x 7 H2O – 1; ekstrakt drodowy – 1; woda wodocigowa 1 litr. Komórki pobierano z fazy stacjonarnej. Biosyntez kwasu cytrynowego przez wolne i immobilizowane komórki prowadzono w podou o skadzie (gl-1): glicerol 50; ekstrakt drodowy 0,2; woda wodocigowa 1 litr. Korekt pH na poziomie 5–6 prowadzono co 12 godzin, za pomoc 5 M NaOH. Metody puapkowania drody Do puapkowania drody wykorzystywano chitozan (CH) o masie czsteczkowej 750000 i 2 000000 firmy Fluka. W procedurach otrzymywania eli chitozanowych stosowano alginian sodu (Macrocystis pyrifera firmy Sigma), tripolifosforan sodu (TP), siarczan laurylu (SL), aldehyd glutarowy (AG) i chlorek wapnia. Do puapkowania drody wykorzystywano poliwinyloalkohol (PVA) o masie czsteczkowej 49000 firmy Fluka. W procedurach otrzymywania eli PVA stosowano kwas borowy i azotan (V) wapnia. Procedura unieruchamiania drody w rónych typach eli chitozanowych Typ CH+TP+AG. 15 g mokrej masy drody wprowadzano do 85 ml 2; 2,5; 3; 3,5% roztworu chitozanu o masie czsteczkowej 2 000000, sporzdzonego w 2% roztworze kwasu octowego. Po zmieszaniu zawiesiny drody w odpowiednim roztworze chitozanu cao wkraplano za pomoc igy o rednicy 0,5 mm do 2% roztworu tripolifosforanu sodu i przetrzymywano przez 3 godz., nastpnie przemywano steryln wod i wprowadzano na 2 min do 0,5 lub 0,75% roztworu aldehydu glutarowego w buforze fosforanowym o pH 7,6. Typ CH(M)+SL i CH(H)+SL. 15 g mokrej masy drody wprowadzano do 85 ml 3% roztworu chitozanu sporzdzonego w 2% roztworze kwasu octowego o masie czsteczkowej 750000 (typ CH(M)+SL) lub 2 000000 (typ CH(H)+SL). Po zmieszaniu zawiesiny drody w odpowiednim roztworze chitozanu cao wkraplano do 2% roztworu siarczanu laurylu. Kuleczki biokatalizatora o rednicy 2–3 mm przetrzymywano w roztworze siarczanu laurylu przez 3 godz., celem utwardzenia biokatalizatora. Typ CH+ALG i CH+ALG*. 15 g mokrej masy drody wprowadzano do 85 ml 2,5% roztworu alginianu sodu i wkraplano do 2% roztworu chlorku wapnia sporzdzonego w 0,5% roztworze chitozanu o masie czsteczkowej 2 000000 (typ CH+ALG) lub tylko do 2% roztworu chlorku wapnia (typ CH+ALG*) i przetrzymywano przez 4 godziny. Typ ALG+CH+ALG. Homogenn mieszanin alginianu sodu i drody uzyskan jak w typie CH+ALG*, wkraplano do 2% roztworu chlorku wapnia i przetrzymywano przez 30 min, nastpnie biokatalizator wprowadzano do 0,5% roztworu chitozanu o masie. Biotechnologia 7(3) 2008.

(25) 20. W. Rymowicz. czsteczkowej 2 000000. Po 30 min biokatalizator przenoszono do 0,15% roztworu alginianu sodu i przetrzymywano przez 1 godzin. Procedura unieruchamiania drody w rónych typach eli PVA Typ PVA+A. 15 g mokrej masy drody wprowadzano do 85 ml 12,5% roztworu alkoholu poliwinylowego o ciarze czsteczkowym 49000 sporzdzonego w 2,5% roztworze alginianu sodowego. Po zmieszaniu homogenn zawiesin wkraplano za pomoc igy o rednicy 0,5 mm do 3% roztworu azotanu (V) wapnia. Tak otrzymany biokatalizator w formie kuleczek przetrzymywano w ww. roztworze przez 1 godz., a nastpnie przemywano steryln wod i zamraano. Biokatalizatory mroono przez 24 godz. w temperaturze –20°C. Przed wprowadzeniem do podoa produkcyjnego biokatalizatory rozmraano przez 20 godz. w temperaturze +4°C. Typ PVA+KB. 15 g mokrej masy drody wprowadzano do 85 ml 12,5% roztworu alkoholu poliwinylowego o ciarze czsteczkowym 49000 sporzdzonego w 2,5% roztworze alginianu sodowego. Po zmieszaniu homogenn zawiesin wkraplano za pomoc igy o rednicy 0,5 mm do 5% roztworu kwasu borowego sporzdzonego w 2% chlorku wapnia. Tak otrzymany biokatalizator w formie kuleczek przetrzymywano w ww. roztworze w temp. 4°C przez 24 godziny. Typ PVA+KB/T. Homogenn mieszanin alkoholu poliwinylowego i drody uzyskan w metodzie (typ PVA+KB) wkraplano do 5% roztworu kwasu borowego sporzdzonego w 2% chlorku wapnia zawierajcego 0,2% Tween 80. Tak otrzymany biokatalizator w formie kuleczek przetrzymywano ww. roztworze w temp. 4°C przez 24 godziny. Wszystkie typy biokatalizatorów przed wprowadzeniem do podoa produkcyjnego przemywano kilkakrotnie steryln wod. Techniki prowadzenia hodowli Hodowle okresowe. Biosyntez kwasu cytrynowego z immobilizowanymi lub wolnymi komórkami drody przeprowadzono w kolbach Erlenmeyera o pojemnoci 250 ml zawierajcych 40 ml podoa produkcyjnego i 15 g odpowiedniego typu biokatalizatora. Hodowle prowadzono na wstrzsarce typu Elpan, przy 160 obr min-1 przez 7 dni w temperaturze 30ºC. Kontrol stanowiy zawsze hodowle z wolnymi komórkami, których stenie byo takie samo jak w uytych biokatalizatorach. WYNIKI Ocena aktywno ci kwasotwórczej biokatalizatorów chitozanowych W pierwszej czci bada zbadano wpyw stenia chitozanu i aldehydu glutarowego, stosowanego do modyfikacji struktury elu, na proces biosyntezy kwasu cytrynowego z glicerolu przez badany szczep drody Wratislavia AWG7. Stenie chitozanu w biokatalizatorach byo w zakresie od 2 do 3,5%. Do modyfikacji eli stosowano aldehyd glutarowy o steniu 0,5 i 0,75%. Stenie kwasu cytrynowego (KC) w hodowlach zawierajcych komórki unieruchomione w chitozanie byo niskie i w zalenoci od rodzaju biokatalizatora ksztatowao si na poziomie od 4 do 17,5 gl-1 (tab. 1). Dynamika produkcji oraz wydajno kwasu cytrynowego w hodowlach z uyciem biokatalizatorów typu CH+TP+AG zaleaa zarówno od stenia chitozanu, w którym puapkowano. Acta Sci. Pol..

(26) Biosynteza kwasu cytrynowego .... 21. komórki drody, jak i od stenia aldehydu glutarowego (AG) zastosowanego do modyfikacji otrzymanych eli. Jednoczenie ze wzrostem stenia chitozanu w elu oraz wzrostem stenia aldehydu glutarowego do modyfikacji elu obserwowano wzrost stenia kwasu cytrynowego. Stenie KC w hodowlach z udziaem biokatalizatorów sieciowanych 0,5% AG ksztatowao si w granicach od 4,0 do 15,0 gl-1, natomiast biokatalizatorów sieciowanych 0,75% AG w przedziale od 10,0 do 17,5 gl-1. Objtociowa szybko produkcji kwasu cytrynowego (QKC) bya na poziomie od 1,4 do 3,5 gl-1d-1, natomiast wydajno kwasu cytrynowego (YKC) w zakresie od 0,3 do 0,54 gg-1. W przypadku hodowli z wolnymi komórkami zaobserwowano prawie dwukrotnie nisz warto objtociowej szybkoci produkcji kwasu cytrynowego (QKC=1,4 gl-1d-1) i trzykrotnie nisz warto wydajnoci produkcji kwasu cytrynowego (YKC = 0,18 gg-1), w porównaniu z najlepszym biokatalizatorem typu CH+TP+AG stabilizowanym 0,75% AG. Tabela 1. Wpyw stenia chitozanu i aldehydu glutarowego na produkcj i wydajno kwasu cytrynowego przez komórki Yarrowia lipolytica Wratislavia AWG7 immobilizowane w elach chitozanowych typu CH+TP+AG Table 1. Effect of chitosan and glutaraldehyde concentration on the production of citric acid and citric acid yield by Yarrowia lipolytica Wratislavia AWG7 cells immobilized in the chitosane gel type CH+TP+AG Chitozan Chitosan (%) 2,0 2,5 3,0 3,5 2,0 2,5 3,0 3,5 Wolne komórki Free cells. Kwas cytrynowy QKC Citric acid [gl-1] [gl-1d-1] 0,5% aldehyd glutarowy – glutaraldehyde 0,6 4,0 1,3 9,0 12,5 1,8 15,0 2,1 0,75% aldehyd glutarowy – glutaraldehyde 1,4 10,0 1,8 12,5 2,5 17,3 2,5 17,5 9,5. 1,4. YKC [gg-1] 0,19 0,31 0,41 0,45 0,32 0,42 0,48 0,52 0,18. Ze wzgldu na niskie zawartoci KC w hodowlach z biokatalizatorami typu CH+TP+AG – w kolejnej czci pracy sprawdzono aktywno kwasotwórcz drody Y. lipolytica Wratislavia AWG7 puapkowanych w elach chitozanowych w obecnoci siarczanu laurylu. Przeprowadzono hodowle wstrzsane z uyciem biokatalizatorów typu CH(M)+SL oraz CH(H)+SL, zawierajcych dwa róne chitozany rónice si mas czsteczkow. Uyty do modyfikacji 2% siarczan laurylu mia niekorzystne oddziaywanie na komórki drody i zahamowa proces biosyntezy kwasu cytrynowego. Wszystkie biokatalizatory niezalenie od zastosowanego rodzaju chitozanu (chitozan o redniej i wysokiej masie czsteczkowej) nie wykazay adnej aktywnoci kwasotwórczej. Sugeruje to nieprzydatno takich biokatalizatorów w procesie biosyntezy kwasu cytrynowego przez drode. Naley zaznaczy , e uzyskane w ten sposób ele chitozanowe byy stabilne mechanicznie i chemicznie. Wysokiej aktywnoci kwasotwórczej nie udao si równie osign w hodowlach z komórkami drody puapkowanymi w elach chitozanowych, modyfikowanych. Biotechnologia 7(3) 2008.

(27) W. Rymowicz. 22. alginianem i chlorkiem wapnia. Do bada wykorzystano trzy typy biokatalizatorów: CH+ALG, CH+ALG* oraz ALG+CH+ALG. We wszystkich hodowlach odnotowano produkcj kwasu cytrynowego, jednak z rón dynamik i wydajnoci. Najnisz aktywno kwasotwórcz wykazay hodowle z biokatalizatorem typu CH+ALG*, natomiast najwysz hodowl z biokatalizatorem typu ALG+CH+ALG. Biokatalizatory te produkoway odpowiednio 12,5 oraz 16,3 gl-1 kwasu cytrynowego (tab. 2). Najwysz dynamik produkcji (2,3 gl-1d-1) oraz wydajno kwasu cytrynowego (0,33 gg-1) uzyskano w procesie z udziaem biokatalizatora typu ALG+CH+ALG. Nieco gorszymi parametrami cechoway si procesy z uyciem pozostaych biokatalizatorów. Ocena aktywno ci kwasotwórczej biokatalizatorów PVA Drode Y. lipolytica Wratislavia AWG7 unieruchomiono w 3 typach eli PVA: (PVA+KB, PVA+KB/T i PVA+A) i uyto w procesie biosyntezy kwasu cytrynowego z glicerolu w 7-dobowych hodowlach wstrzsanych. Stenie KC w hodowlach zawierajcych puapkowane komórki drody byo niskie i w zalenoci od typu biokatalizatora ksztatowao si w przedziale od 0,5 do 17,5 gl-1 (tab. 2). Komórki drody puapkowane w elach typu PVA+KB oraz PVA+KB/T, w których stosowano 3% kwas borowy i Tween 80, celem modyfikacji zewntrznej membrany elu PVA, nie byy zdolne do biosyntezy duych iloci kwasu cytrynowego. Stenie kwasu cytrynowego nie przekraczao 2,1 gl-1. Sporód badanych biokatalizatorów najlepsze efekty kwasotwórcze uzyskano z udziaem komórek drody szczepu Wratislavia AWG7 unieruchomionych w elu typu PVA+A, stabilizowanym azotanem (V) wapnia, który produkowa 17, 5 gl-1 kwasu cytrynowego. Stwierdzono równie, e produkcja kwasu cytrynowego z udziaem tego typu biokatalizatora przebiegaa z najwysz dynamik (QKC= 2,5 gl-1d-1) i wydajnoci (YKC=0,54 gg-1). Ponadto, uzyskane wartoci tych parametrów technologicznych byy znacznie wysze w porównaniu do hodowli z wolnymi komórkami, gdzie wielkoci te osigny wartoci odpowiednio (QKC= 1,3 gl-1d-1) i (YKC=0,17 gg-1). Tabela 2. Charakterystyka procesu biosyntezy kwasu cytrynowego z glicerolu przez Yarrowia lipolytica Wratislavia AWG7 unieruchomione w rónych typach biokatalizatorów chitozanowych i poliwinyloalkoholowych Table 2. Characteristic of the citric acid biosynthesis from glycerol by Yarrowia lipolytica Wratislavia AWG7 immobilized in different kind of chitosane and polivinylalcohol biocatalysts Typ biokatalizatora Type of biocatalist CH+ALG CH+ALG* ALG+CH+ALG CH(M)+SL CH(H)+SL PVA+KB PVA+KB/T PVA+A Komórki wolne Free cells. Kwas cytrynowy Citric acid [gl-1] 14,3 12,5 16,3 0 0 0,5 2,1 17,5 9,0. QKC -1 -1. [gl d ] 2,0 1,8 2,3 0 0 007 0,3 2,5 1,3. YKC [gg-1] 0,28 0,25 0,33 0 0 0,06 0,1 0,54 0,17. Acta Sci. Pol..

(28) Biosynteza kwasu cytrynowego .... 23. DYSKUSJA WYNIKÓW Badania nad procesami wykorzystujcymi immobilizowane komórki zostay zapocztkowane kilkadziesit lat temu i budz zainteresowanie do dnia dzisiejszego. Wedug Kourkoutas i in. [2004] prace zwizane z immobilizacj caych komórek maj zwykle charakter czysto dowiadczalny, co wynika z duej iloci noników, ich rónorodnoci pod wzgldem struktury i waciwoci, a take licznych procedur wizania komórek z nonikiem. W tematycznej literaturze niewiele jest informacji o zastosowaniu immobilizowanych komórek drody w procesie drodowej fermentacji cytrynowej. Autorzy swoje badania ograniczyli przede wszystkim do wykorzystania matryc alginianowych lub karagenowych, ale adne z nich nie zostay uyte na wiksz skal [Tisnadjaja i in. 1996, Kautola i in. 1991]. Zapotrzebowanie na immobilizowane biokatalizatory nowej generacji jest jednak bardzo due, co intensyfikuje badania nad aplikacj nowych, naturalnych czy syntetycznych materiaów matrycowych. W ramach tej pracy podjto szereg prób puapkowania drody w chitozanie i PVA. Zasadniczy cel stanowio uzyskanie biokatalizatorów o moliwie wysokiej aktywnoci kwasotwórczej i dobrej wytrzymaoci mechanicznej oraz chemicznej, co uznano za podstawowe kryteria doboru warunków immobilizacji. Powszechnie stosowan metod modyfikacji eli jest uycie zwizków dwufunkcyjnych. W dyskutowanej pracy w celu stabilizacji biokatalizatorów chitozanowych stosowano aldehyd glutarowy. Rymowicz i in. [1993] stwierdzili, e optymalne stenie aldehydu glutarowego do utwardzania eli alginianowych i karagenowych nie powinno przekracza 0,5%, gdy wysze stenia AG powoduj gwatowne obnienie aktywnoci kwasotwórczej drody Y. lipolytica. Z kolei Cheng i in. [2006] stosujc 3% AG w celu zwikszenia stabilnoci biokatalizatorów PVA, uzyskali wysok aktywno enzymów. W niniejszej pracy biokatalizatory chitozanowe traktowano 0,5 oraz 0,75% roztworem aldehydu glutarowego. Biokatalizatory, na które oddziaywa 0,75% AG, odznaczay si najlepszymi cechami mechanicznymi i byy aktywne. Naley zwróci uwag, e uzyskanie biokatalizatorów o dobrych waciwociach mechanicznych i odpornych na czynniki chemiczne nie oznacza, e wykazuj one take wysok aktywno biologiczn. W prezentowanej pracy zaobserwowano, e biokatalizatory chitozanowe typu CH+SL oraz biokatalizatory poliwinyloalkoholowe PVA+KB i PVA+KB/T, cechujce si najwysz stabilnoci sporód wszystkich przebadanych w niniejszej pracy, nie produkoway kwasu cytrynowego. Obnienie zdolnoci drody Y. lipolytica do tworzenia KC moe wiza si z niekorzystnym oddziaywaniem tych zwizków na komórk drodow lub jej metabolizm. Mogy te zaistnie. inne przyczyny obnienia aktywnoci kwasotwórczej drody. Aktywno biokatalizatorów silnie zaley od szybkoci dyfuzji substratów i produktów przez warstw elu tworzcego cian kapsuki [Antczak i in. 2000, Wang i in. 2005, Fujii i in. 1999]. Dua porowato moe powodowa ograniczenie dyfuzji tlenu i substratów do wewntrznych regionów eli, co w konsekwencji moe powodowa czciow konsumpcj wytworzonego kwasu cytrynowego przez komórki drody. Wedug innych autorów waciwoci fizjologiczne i metabolizm immobilizowanych komórek drody moe znacznie si róni od waciwoci komórek wolnych [Kourkoutas i in. 2004]. W badaniach wasnych zaobserwowano, e aktywno kwasotwórcza drody Y. lipolytica uzaleniona jest od typu nonika zastosowanego do puapkowania oraz rodzaju zwizków stabilizujcych struktur eli. Najlepsze efekty kwasotwórcze uzyskano w hodowlach prowadzonych z udziaem biokatalizatora chitozanowego typu. Biotechnologia 7(3) 2008.

(29) 24. W. Rymowicz. CH+TP+AG oraz biokatalizatora PVA+A, którego struktur stabilizowano w 24godzinnym procesie mroenia. Produkcja kwasu cytrynowego przez drode Y. lipolytica AWG7 puapkowane w ww. biokatalizatorach ksztatowaa si na poziomie 17,5– 17,9 gl-1. W przypadku hodowli z wolnymi komórkami, w której zastosowano równowan biomas do wyjciowej w badanych biokatalizatorach, zaobserwowano prawie dwukrotnie niszy poziom kwasu cytrynowego. Wedug Juszczyk i in. [2005] w hodowli wgbnej szczep Y. lipolytica Wratislavia AWG7 wytwarza równie niewielkie iloci kwasu cytrynowego (11,0 gl-1). Objtociowa szybko produkcji kwasu cytrynowego przez immobilizowane komórki szczepu Wratislavia AWG7 bya podobna do wartoci uzyskanych przez innych autorów. W zalenoci od rodzaju podoa, techniki immobilizacji i uytego szczepu drody wielko tego parametru wynosia od 0,006 do 1,16 gl-1 h-1 [Rymowicz i in. 1993, Kautola i in. 1991, Tisnadjaja i in. 1996]. Niewtpliwie, zakres przeprowadzonych dowiadcze nie wyczerpa wszystkich moliwoci badawczych, które mog mie wpyw na proces biosyntezy kwasu cytrynowego z udziaem immobilizowanych komórek drody. Konieczne s dalsze szczegóowe badania, które pozwol na udoskonalenie metody otrzymywania stabilnych chemicznie i aktywnych kwasotwórczo biokatalizatorów. Reasumujc, mona stwierdzi , e aktywno kwasotwórcza drody puapkowanych w elach chitozanowych i poliwinyloalkoholowych w istotny sposób uzaleniona jest od sposobu uzyskiwania powyszych biokatalizatorów oraz rodzaju stosowanej modyfikacji do wzmocnienia struktury biokatalizatora. Sporód badanych biokatalizatorów najlepsze efekty kwasotwórcze uzyskano w hodowlach z udziaem komórek drody Y. lipolytica Wratislavia AWG7 unieruchomionych w elu chitozanowych typu CH+TP+AG, stabilizowanym dodatkowo 0,75% AG oraz w elu poliwinyloalkoholowym typu PVA+A, stabilizowanym azotanem (V) wapnia. Przeprowadzenie procesu biosyntezy kwasu cytrynowego przez immobilizowane komórki drody w reaktorze barbotaowym lub typu air-lift moe znacznie poprawi podstawowe parametry kinetyczne i wydajno procesu. PIMIENNICTWO Anastassiadis S., Morgunov I.G., Kamzolova S.V., Finogenova T.V., 2008. Citric acid Patent Review. Recent Patents on Biotechnology, 2(2), 1–17. Antczak T., Bugla J., Mastalerz M., Niemiec A., Szeja W., lk M., Galas E., 2000. Immobilizacja unieruchomionych in situ lipaz Mucor w mikroporowatych kapsukach alginianowych. Biotechnologia, 4(51), 142–151. Chang C.C., Tseng S.K., 1998. Immobilization of Alcaligenes eutrophus using PVA crosslinked with sodium nitrate. Biotechnology Techniques, 12, 865–868. Cheng S., Wei D., Song Q., Zhao X., 2006. Immobilization of permeabilized whole cell penicillin G acylase from Alcaligenes feacalis using pore matrix crosslinked with glutaraldehyde. Biotechnology Letters, 28, 1129–1133. Dave R., Madamwar D., 2006. Esterification in organic solvents by lipase immobilized in polymer of PVA–alginate–boric acid. Process Biochemistry, 41, 951–955. Fujii N., Sakurai A., Onjoh K., Sakakibara M., 1999. Influence of surface characteristics of cellulose carriers on ethanol production by immobilized yeast cells. Process Biochemistry, 34, 147–152.. Acta Sci. Pol..

(30) Biosynteza kwasu cytrynowego .... 25. Huang R., Du Y., Zheng L., Liu H., Fan L., 2004. A new approach to chemically modified chitosan sulfates and study of their influences on the inhibition of Escherichia coli and Staphylococcus aureus growth. Reactive and Functional Polymers, 59, 41–51. Imandi S.B., Bandaru V.R., Somalanka S.R., Garapati H.R., 2007. Optimization of medium constituents for the production of citric acid from byproduct glycerol using Doehlert experimental design. Enzyme and Microbial Technology, 40, 1367–1372. Juszczyk P., Musia I., Rymowicz W., 2005. Dobór szczepów drody do produkcji biomasy z glicerolu odpadowego. Biotechnologia, 4(1–2), 65–76. Kamzolova S.V., Finogenova T.V., Morgunov I.G., 2005. Microbiological production of citric and isocitric acids from sunflower oil. Food Technolology and Biotechnology, 46(1), 51–59. Kautola H., Rymowicz W., Linko Y.-Y., Linko P., 1991. Production of citric acid with immobilized Yarrowia lipolytica. Applied Microbiology and Biotechnology, 35, 447–449. Kourkoutas Y., Bekatorou A., Banat I.M., Marchant R., Koutinas A.A., 2004. Immobilization technologies and support materials suitable in alcohol beverages production: a review. Food Microbiology, 21, 377–397. Krajewska B., 2004. Application of chitin- and chitosan-based materials for enzyme immobilizations: a review. Enzyme and Microbial Technology, 35, 126–139. Maddox I.S., Kingston P.J., 1983. Use of immobilized cells of the yeast Saccharomycopsis lipolytica for the production of citric acid. Biotechnology Letters, 5(12) 795–798. Papanikolaou S., Muniglia L., Chevalot I., Aggelis G., Marc I., 2002. Yarrowia lipolytica as a potential producer of citric acid from raw glycerol. Journal of Applied Microbiology, 92, 737–744. Rinaudo M., 2006. Chitin and chitosan: Properties and applications. Progress Polymers Sciences, 31, 603–632. Rymowicz W., Rywiska A., Gadkowski W., 2008. Simultaneous production of citric acid and erythritol from crude glycerol by Yarrowia lipolytica Wratislavia K1. Chemical Papers, 62(3), 239–246. Rymowicz W., Rywiska A., arowska B., Juszczyk P., 2006. Citric acid production from crude glycerol by acetate mutants of Yarrowia lipolytica. Chemical Papers, 60, 391–394. Rymowicz W., 1998. Biosynteza kwasu cytrynowego z glukozy przez wolne i immobilizowane komórki drody Yarrowia lipolytica w systemach cigych. Zesz. Nauk. AR Wroc. Rozpr. Hab., 61, 329. Rymowicz W., 2003. Biosynteza kwasu cytrynowego z sacharozy przez unieruchomione w karaganie pojedyncze i mieszane kultury Yarrowia lipolytica. Biotechnologia, 2(1–2), 31–40. Rymowicz W., Juszczyk P., Rywiska A., arowska B., Musia I., 2005. Produkcja kwasu cytrynowego z odpadowego glicerolu przez drode Yarrowia lipolytica. Biotechnologia, 2(2), 46–54. Rymowicz W., Wojtatowicz M., Robak M., Jurgielewicz W., 1993. The use of immobilized Yarrowia lipolytica cells in Ca-alginate for citric acid production. Acta Microbiologica Polanica, 42(2), 163–170. Shepherd R., Reader S., Falshaw A., 1997. Chitosan functional properties. Glycoconjugate Journal, 14, 535–542. Soccol C.R., Vandenberghe L.P.S., Rodrigues C., Pandey A., 2006. New Perspectives for Citric Acid Production and Application. Food Technology and Biotechnology, 44(2), 141–149. Tisnadjaja D., Gutierrez N.A., Maddox I.S., 1996. Citric acid production in a bubble-column reactor using cells of the Candida guillermondii immobilized by adsorption onto sawdust. Enzyme and Microbial Technology, 19, 343–347. Wang G.J., Chu L.Y., Chen W.M., Zhou M.Y., 2005. A porous microcapsule membrane with straight pores for the immobilization of microbial cells. Journal of Membrane Science, 252, 279–284.. Biotechnologia 7(3) 2008.

(31) W. Rymowicz. 26. Yujian W., Xiaojuan Y., Hongyu L., Wei T., 2006. Immobilization of Acidithiobacillus ferrooxidans with complex of PVA and sodium alginate. Polymer Degradation and Stability, 91, 2408–2414.. BIOSYNTHESIS OF CITRIC ACID FROM GLICEROL BY YARROWIA LIPOLYTICA IMMOBILIZED IN CHITOSANE AND POLIVINYLALCOHOL. Abstract. Yarrowia lipolytica Wratislavia AWG7 yeast strain was immobilized in different kind of chitosane and PVA gels and used for biosynthesis of citric acid from glycerol. The yeast strain produced citric acid in the range from 0 to 17,5 gl-1 in 7-days shake flask. Chitosane biocatalyst type of CH+TP+AG and polivinylalcohol biocatalyst type PVA+A produced citric acid with the highest production rate and the yield; 2,5 gl-1d-1, 0,54 gg-1 and 2,5 gl-1d-1, 0,52 gg-1, respectively. Key words: Chitosan, polivinylalcohol, immobilization, citric acid, Yarrowia lipolytica. Zaakceptowano do druku – Accepted for print: 29.09.2008 Do cytowania – For citation: Rymowicz W., 2008. Biosynteza kwasu cytrynowego z glicerolu przez drode yarrowia lipolytica immobilizowane w chitozanie i poliwinyloalkoholu. Acta Sci. Pol. Biotechnol. 7(3), 17–26.. Acta Sci. Pol..

(32) Acta Sci. Pol., Biotechnologia 7(3) 2008, 27-43. ASYMILACJA NIETYPOWYCH RÓDE WGLA PRZEZ MIKROORGANIZMY O SPECYFICZNYCH UZDOLNIENIACH DO YCIA W WYSOKO STRESOGENNYCH RODOWISKACH* Isaura Zaleska, Micha Piegza Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocawiu1 Streszczenie. Utylizacja oleistych odpadów przemysu spoywczego i motoryzacyjnego stanowi jedno z istotniejszych i trudniejszych wyzwa dla ochrony rodowiska. W niniejszej pracy podjto prób wyselekcjonowania mikroorganizmów zdolnych do biologicznej asymilacji nietypowych róde wgla. Rozwój ponadprzecitnych uzdolnie enzymatycznych u takich mikroorganizmów moe by indukowany przez stresogenne rodowisko ycia, a tym samym umoliwia utylizacj szkodliwych dla rodowiska odpadów. Do izolacji mikroorganizmów wybrano nisz, w której byy stosowane róne, silne detergenty inhibujce wzrost drobnoustrojów. W efekcie wieloetapowej izolacji otrzymano 22 szczepy, w tym 18 szczepów drody nalecych do rodzajów: Candida, Trichosporon, Geotrichum, Pichia oraz 4 szczepy bakterii. Wszystkie badane drobnoustroje wykazay wysok zdolno nie tylko wzrostu w obecnoci detergentów, ale i asymilacji odpadów pochodzenia oleistego. Przeprowadzono hodowle ze zoonymi ródami wgla, takimi jak oleje z przemysu spoywczego i motoryzacyjnego (benzyna bezoowiowa oraz paliwo lotnicze), uzyskujc w wielu przypadkach wysoki przyrost biomasy w otrzymanych pynach pohodowlanych. Oceniono wybrane aktywnoci hydrolaz, wskazujc na szerokie uzdolnienia enzymatyczne testowanych izolatów. Jako mikroorganizmy wzorcowe, z którymi porównano zdolnoci wzrostu na trudno degradowalnych zwizkach oleistych – jedynych ródach wgla, wybrano drobnoustroje charakteryzujce si zdolnoci do utylizacji ropopochodnych odpadów Yarrowia lipolytica oraz wysoko uzdolnione lipolitycznie Geotrichum candidum. Sowa kluczowe: degradacja olejów, Candida pelliculosa, Trichosporon cutaneum, Candida tropicalis, lipazy, utylizacja ropopochodnych odpadów. * Praca zrealizowana w Studenckim Kole Naukowym Biotechnologów przy Katedrze Biotechnologii i Mikrobiologii ywnoci w latach 2006–2007.. Adres do korespondencji – Corresponding author: Isaura Zaleska, Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii ywnoci, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocawiu, ul. Norwida 25, 50–375 Wrocaw, e-mail: isaura.zaleska@up.wroc.pl.

(33) 28. I. Zaleska, M. Piezga. WSTP Postp urbanizacji przyczynia si do powstawania ogromnej iloci odpadów, w tym zwizków ropopochodnych, a rozwizania przemysowego zagospodarowania zdecydowanie nie nadaj za wszechstronnie pojt utylizacj. Gówny problem stanowi zanieczyszczenia, takie jak zuyte oleje czy smary, a ich utylizacja systematycznie wzrastajcej masy odpadów stanowi duy problem w ochronie rodowiska [Goncalves i in. 2007, Kasprzak i in. 2002]. Biotechnologia rodowiska staje si jedn z najwaniejszych dziedzin wspóczesnych nauk przyrodniczych. Technologiczne wykorzystanie organizmów ywych, zdolnych do utylizacji trudno degradowalnych odpadów organicznych [Alexieva i in. 2004, Ijah i in. 1998; Kaczorek i in. 2003, Kwapisz 2006, Lataa i Wierzba 2004, Lisowska i Dugoski 2003, Oh i in. 2000, ogaa i in. 2005], takich jak odpady ropopochodne, jest obecnie dobrym rozwizaniem dla rekultywacji gleb i wód skaonych substancjami olejopodobnymi [Ijah i in. 1998, Kaczorek i in. 2003, Kwapisz i in. 2006, Lataa i Wierzba 2004, ogaa i in. 2005]. Wielopiercieniowe wglowodory aromatyczne (WWA) pochodzce gównie z przeróbki ropy naftowej stanowi najszersz grup toksycznych zwizków. S to ksenobiotyki, które z czasem staj si coraz bardziej oporne na rozkad – tym samym rosn ich mutagenne i toksyczne waciwoci. Asymilacja ropopochodnych odpadów zachodzi moe na drodze chemicznej, a take z udziaem wyspecjalizowanych mikroorganizmów. Procesy chemiczne, to reakcje takie jak: arylowanie, alkilowanie, dealkilowanie, dehalogenacja, hydroliza estrów lub amidów, utlenianie, redukcja, hydroksylacja piercienia aromatycznego, rozerwanie piercienia aromatycznego, kondensacja i tworzenie koniugantów. Dziaanie drobnoustrojów ujawnia si przede wszystkim: utlenieniem czsteczki wglowodoru, rozerwaniem wiza C-C, atakiem na grupy funkcyjne zawierajce np. metal oraz biokrakingiem wglowodorów ciszych [Kwapisz 2006]. Wykorzystywane do rozkadu odpadów organicznych mikroorganizmy musz cechowa si odpowiednim aparatem enzymatycznym, umoliwiajcym utylizacj odpadów na drodze reakcji metabolicznych w rodowisku wodnym, ale take niewodnym. Spowodowao to rozwój nowej gazi biotechnologii nazwanej „biokataliz w niekonwencjonalnych mediach” lub enzymologi niewodn [Antczak, Graczyk 2002]. Podmiotem przeprowadzonych bada byy odpady pochodzenia oleistego, w których skad wchodz liczne lipidy, a do ich skutecznej utylizacji poszukiwano charakteryzujcych si wydajn biosyntez lipaz. Wyizolowane z wysoko stresogennego rodowiska mikroorganizmy posiadaj uzdolnienia hydrolityczne, które umoliwiaj im nie tylko wzrost w niekorzystnych warunkach ycia, ale równie sprzyjaj asymilacji trudno degradowalnych zwizków wglowych. MATERIAY I METODY Mikroorganizmy. Badane mikroorganizmy wyizolowano z odpywów zlewozmywaków wrocawskich punktów gastronomicznych. Izolacje do czystych kultur prowadzono w kolejnych pasaach na podou bulion+agar, poniewa wzrost uzyskanych drobnoustrojów na tym podou by wybitnie. Acta Sci. Pol..