Przeprowadzono badania w kierunku grypy ptaków metodą real time (r) RT-PCR/M (wykrywanie wszystkich wirusów typu A), a następnie próbki dodatnie analizowano metodą rRT-PCR specyficzną dla podtypów H5, H7 i N1 oraz konwencjonalną me-todą RT-PCR dla podtypu H9 [8, 10–13]. W przypadku pierwszego badanego stada wykonano również badanie RT-PCR dla podtypu N2 [5]. Produkt PCR po amplifika-cji fragmentu genu H9 o wielkości ok. 500 pz poddano sekwencjonowaniu w firmie Genomed (Warszawa). Uzyskaną sekwencję wykorzystano do opracowania drzewa filogenetycznego metodą przyłączania sąsiada w programie MEGA 5, a do porównań użyto sekwencji wirusów H9 znajdujących się w bazie GenBank. Z wybranych pró-bek dodatnich w rRT-PCR prowadzono izolację wirusa na zarodkach kurzych SPF według standardowej procedury opisanej w podręczniku diagnostycznym grypy pta-ków, a płyny zarodkowe wykazujące aktywność hemaglutynacyjną badano metodą hamowania hemaglutynacji w kierunku obecności podtypów H1-H16 wirusa AI [5]. Izolatem wirusa pochodzącym z pierwszego ogniska zakażono dożylnie 10 kurcząt
w wieku 6 tyg. wolnych od przeciwciał dla AI celem określenia indeksu dożylnej zja-dliwości (IVPI) [5]. Badania serologiczne wykonano metodami hamowania hema-glutynacji z antygenami H5, H7 i H9 wirusa AI według standardowej procedury [5] oraz testem ELISA (IDEXX ELISA AIV MulitS-Screen).
Wyniki
We wszystkich badanych fermach wykryto obecność materiału genetycznego wi-rusa grypy ptaków podtypu H9, chociaż wyniki dodatnie nie dotyczyły wszystkich stad pochodzących z badanych ferm. Analizy w kierunku H5, H7 i N1 były ujemne. Próbki z pierwszego stada były również dodatnie w kierunku genu N2, jednak inten-sywność prążka była znacznie niższa niż w RT-PCR/H9, a obniżona czułość wynika prawdopodobnie z braku pełnego dopasowania starterów i sekwencji. W badaniach serologicznych próbki z ogniska 1 były ujemne w pierwszym badaniu, natomiast wyniki dodatnie stwierdzono w próbkach pobranych 2 tygodnie później. Surowice z pozostałych ferm były dodatnie zarówno w teście ELISA, jak również w teście HI z antygenem H9 (w kierunku H5 i H7 – wynik ujemny), przy czym wyższy odsetek wyników dodatnich odnotowano w teście HI. Indeks dożylnej zjadliwości wykazał wartość 0,0 (szczep niezjadliwy). Wstępne badania filogenetyczne wykazały, że izo-lat AIV/H9N2 z pierwszego ogniska jest blisko spokrewniony z wirusami AI/H9 wykrytymi u dzikich ptaków (kaczek krzyżówek) oraz u indyków w 2011 r. w Euro-pie, jest jednak odległy filogenetycznie od szczepów krążących na Bliskim Wscho-dzie i w Chinach.
Wnioski
Niniejsze opracowanie jest pierwszym w kraju doniesieniem dotyczącym zakażeń wirusami grypy ptaków H9N2 w Polsce. Indyki wykazywały objawy grypy pta-ków o niskiej zjadliwości (np. objawy oddechowe), jednak mało charakterystyczne i często spotykane w przebiegu zakażeń innymi patogenami układu oddechowe-go. Ze względu na powiązania epidemiologiczne pomiędzy poszczególnymi ogni-skami określenie zjadliwości oraz podtypu neuraminidazy wykonano tylko w od-niesieniu do izolatu z pierwszej fermy. We wszystkich przypadkach indyki były odchowywane do 4. tygodnia życia w Niemczech, tak więc znajomość sytuacji epi-demiologicznej w zakresie występowania zakażeń H9N2 w tym kraju znacznie uła-twiłaby ustalenie źródła pochodzenia wirusa. Wstępne badania filogenetyczne po-zwalają na obecnym etapie stwierdzić, że nie ma powiązań epidemiologicznych z przypadkami grypy H9N2 na Bliskim Wschodzie i w Chinach, mogą jednak su-gerować, że pierwotnym źródłem wprowadzenia wirusa do populacji drobiu były ptaki dzikie. Izolat z pierwszego zgłoszonego przypadku wykazał niską zjadliwość
(IVPI=0,0) i zgodnie z definicją grypy ptaków zakażenia tym wirusem nie podlega-ją obowiązkowi zwalczania [6]. Pozostapodlega-ją jednak nierozwiązane kwestie. Po pierw-sze, zakażenia powodują straty ekonomiczne wynikające przede wszystkim z wy-dłużenia okresu tuczu i kosztów zwalczania zakażeń wtórnych, dlatego niezbędne jest podniesienie świadomości lekarzy weterynarii i hodowców, że pojawił się nowy czynnik zakaźny u drobiu w kraju. Po drugie, wskazane jest monitorowanie roz-woju sytuacji i śledzenie zmian genetycznych, jakie będą pojawiać się w ewentual-nych nowych ogniskach, gdyż konsekwencje epidemiologiczne mogą być znaczące, chociaż trudne do oszacowania na obecnym etapie. Po trzecie, z uwagi na potencjał zoonotyczny konieczne są dalsze badania molekularne celem ustalenia markerów adaptacji do organizmu człowieka.
Piśmiennictwo
[1] Abdel-Moneim A.S., Afifi M.A., El-Kady M.F., 2012. Isolation and mutation trend analy-sis of influenza A virus subtype H9N2 in Egypt. Virol J., 27, 9, 173.
[2] Bashashati M., Vasfi Marandi M., Sabouri F., 2013. Genetic diversity of early (1998) and recent (2010) avian influenza H9N2 virus strains isolated from poultry in Iran. Arch. Virol. [Epub ahead of print].
[3] Capua I., Terregino C., Cattoli G., Mutinelli F., Rodriguez J.F., 2003. Development of a DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated Animals) strategy using a vaccine containing a heterologous neuraminidase for the control of avian influenza. Avian Pa-thol., 32, 47–55.
[4] Chen F., Yan Z.Q., Liu J., Ji J., Chang S., Liu D., Qin J.P., Ma J.Y., Bi Y.Z., Xie Q.M., 2012. Phylogenetic analysis of hemagglutinin genes of 40 H9N2 subtype avian influenza vi-ruses isolated from poultry in China from 2010 to 2011. Virus Genes, 45, 69–75. [5] Dyrektywa Rady 2005/94/WE z dnia 20 grudnia 2005 r. w sprawie wspólnotowych
środków zwalczania grypy ptaków i uchylająca dyrektywę 92/40/EWG. Dz.U. L 10 z 14.1.2006, 1–64.
[6] Decyzja Komisji z dnia 4 sierpnia 2006 r. zatwierdzająca podręcznik diagnostyczny do-tyczący grypy ptaków, przewidziany w dyrektywie Rady 2005/94/WE, Dziennik Urzę-dowy L 237, 31/08/2006 P. 0001–0027.
[7] Iqbal M., Yaqub T., Reddy K., McCauley J.W., 2009. Novel genotypes of H9N2 influ-enza A viruses isolated from poultry in Pakistan containing NS genes similar to highly pathogenic H7N3 and H5N1 viruses. PLoS One, 11, 4, e5788.
[8] Lee M.S., Chang P.C., Shien J.H., Cheng M.C., Shieh H.K., 2001. Identification and sub-typing of avian influenza viruses by reverse transcription-PCR. J. Virol. Methods, 97, 13–22.
[9] Malik Peiris J.S., 2009. Avian influenza viruses in humans. Rev. Sci. Tech., 28, 161–73. [10] Payungporn S., Chutinimitkul S., Chaisingh A., Damrongwantanapokin S., Buranathai
C., Amonsin A., Theamboonlers A., Poovorawan Y., 2006. Single step multiplex real-time RT-PCR for H5N1 influenza A virus detection. J. Microbiol. Methods, 131, 143–147.
[11] Slomka M.J., Pavlidis T., Banks J., Shell W., McNally A., Essen S., Brown I.H., 2007. Val-idated H5 Eurasian real-time reverse transcriptse-polymerase chain reaction and its application in H5N1 outbreaks in 2005–2006. Avian Dis., 51(Suppl.1), 373–377. [12] Slomka M.J., Pavlidis T., Coward V.J., Voeremans J., Koch G., Hanna A., Banks J.,
Brown I.H., 2009. Validated real time reverse transcriptase PCR methods for the dia-gnosis and pathotyping of Eurasian H7 avian influenza viruses. Influenza Other Respi Viruses, 3, 151–164.
[13] Spackman E., Senne D.A., Myers T.J., Bulaga L.L., Garber L.P., Perdue M.L., Lohman K., Daum L.T., Suarez D.L., 2002. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J. Clin. Microbiol., 40, 3256–3260.
Zenon Minta, Krzysztof Wyrostek, Michał Jóźwiak, Monika Olszewska, Krzysztof Śmietanka Państwowy Instytut Weterynaryjny – Państwowy Instytut Badawczy w Puławach