Choroba Mareka (MD) jest nowotworową i wirusową chorobą drobiu grzebiące-go. Jej czynnikiem etiologicznym jest wirus choroby Mareka (MDV). Wyróżniane są trzy serotypy MDV tego wirusa, ale tylko serotyp 1 jest onkogenny dla kurcząt. W obrębie tego serotypu występują patotypy: o umiarkowanej zjadliwości (mMDV), zjadliwe (vMDV), bardzo zjadliwe (vvMDV) oraz coraz częściej występujący pato-typ bardzo zjadliwy plus (vvMDV+). Jedyną skuteczną metodą zapobiegania MD są szczepienia ochronne, prowadzone regularnie od około 40 lat. Powszechne stoso-wanie profilaktyki MD w sposób pośredni doprowadziło do wzrostu patogenności szczepów terenowych MDV. W ostatnich latach w Polsce i na całym świecie obser-wuje się wzrost częstości występowania szczepów wirusa choroby Mareka o pod-wyższonej patogenności, a także przypadki przełamania protekcji poszczepiennej. Ze względu na swoją wielkość – 185 kbp wykazano, że genom MDV jest podat-ny na mutacje genetyczne, szczególnie w regionach odwrócopodat-nych i powtórzopodat-nych sekwencji (TR i ITR). Mutacje w obrębie ramek odczytu kodujących główne biał-ka regulatorowe biorące udział w replibiał-kacji wirusa, jak również w jego onkogen-ności mogą mieć bezpośredni wpływ na jego patogenność, zdolność do szybkiego namnażania się czy wreszcie właściwości antygenowe. O ciągłej ewolucji szczepów terenowych MDV świadczy występowanie na terenie kraju szczepów MDV o pod-wyższonej patogenności.
Prowadzone dotychczas badania w kraju i za granicą wykazały występowanie wielu mutacji w sekwencji genu MDV076 kodującego onkoproteinę Meq. Poło-żone w jego bezpośrednim sąsiedztwie dwa regiony: MDV077 kodujący białko
o masie 23 kDa oraz gen MDV077,5 o nieznanej funkcji prawdopodobnie biorą udział w przebiegu procesu onkogenezy i podlegają mutacjom genetycznym ma-jącym związek z patotypem szczepów MDV. Zmiany genetyczne w obrębie tych trzech genów mogą być traktowane jako specyficzne markery dla szczepów MDV o podwyższonej patogenności występujących aktualnie na terenie kraju.
Celem podjętych badań była próba określenia ewolucji szczepów terenowych MDV na podstawie zmian w sekwencji nukleotydowej i aminokwasowej genów MDV076, MDV077 i MDV077,5.
Materiał i metody
Badania przeprowadzono na szczepach wirusa choroby Mareka wyizolowanych z przypadków terenowych MD w kraju od wprowadzenia szczepień aż po lata współczesne. Szczepy te namnożono w hodowli fibroblastów zarodków kurzych SPF (CEF SPF). Dla każdego ze szczepów sporządzono pulę materiału wirusowego, a następnie izolowano całkowity DNA. W celu amplifikacji badanych 3 genów za-projektowano startery komplementarne do genów: MDV076, MDV077 i MDV77,5. Otrzymane produkty amplifikacji sekwencjonowano w firmie Genomed S.A w War-szawie, a następnie porównano je przy wykorzystaniu oprogramowania komputero-wego z ogólnodostępną bazą danych Genebank. Na podstawie porównań sekwen-cji wykreślono drzewo filogenetyczne pozwalające na określenie prawdopodobnego patotypu i ewolucji badanych szczepów izolowanych w Polsce. W przedstawionych badaniach określano różnice występujące w genie MDV076 pośród szczepów izolo-wanych w kraju w latach 2009–2011.
Wyniki
Przeanalizowano 48 sekwencji genu meq (MDV076) pochodzących ze szczepów terenowych MDV. W celu porównania do sekwencji 48 badanych szczepów do-łączono również sekwencje 13 szczepów standardowych o określonym patotypie. W obrębie sekwencji nukleotydowych uzyskanych dla genu meq obserwowano liczne zmiany typu insercji mono- lub polinukleotydowej, bądź delecji, tranzycji (puryna w purynę lub pirymidyna w pirymidynę) oraz transwersji (puryna w pi-rymidynę lub pirymidyna w purynę). Zestawienie najważniejszych mutacji w ge-nie meq przedstawiono w tabeli 1. Najbardziej charakterystycznymi mutacjami dla szczepów vv/vv+MDV były: tranzycja adeniny w guaninę, którą obserwowano w pozycji 39 u 29 szczepów własnych MDV, insercja tyminy w pozycji 77 delecja tyminy w pozycji 78, insercja tyminy w pozycji 92 i tranzycja tyminy w cytozynę w pozycji 95.
Tabela 1. Najważniejsze mutacje w sekwencji nukleotydowej genu meq badanych szczepów nt-pozycja nukleotydowa w sekwencji nukleotydowej genu meq
Obserwowana mutacja Pozycja (nt) Szczepy posiadające mutację
Grupa filogenetyczna (vvMDV/vv+MDV)
Delecja tyminy 110
584A, 648A, 595, 549A, TK, 239/06, 30/07, 8/09, 56/08, 73/08, 40/09, 42/09, 10/10, 57/10, 58/10, 3/11
Insercja tyminy 107
Insercja guaniny i adeniny 129 i 130
Insercja guaniny 142
Tranzycja guaniny w adeninę 144
Delecja adeniny 147
Tranzycja guaniny w adeninę 206 584A, 648A, 595, 549A, TK, 239/06, 30/07,
8/09, 56/08, 63/08, 73/08, 40/09, 42/09, 46/09, 10/10, 48/10, 57/10, 61/10 58/10, 3/11, 8/11
Transwersja tyminy w guaninę 220
Tranzycja tyminy w cytozynę 354 584A, 648A, 595, 549A, TK, 239/06, 30/07,
8/09, 56/08, 73/08, 40/09, 42/09, 10/10, 11/10, 48/10, 57/10, 58/10, 3/11, 8/11
Transwersja cytozyny w adeninę 526 584A, 648A, 595, 549A, TK, 239/06, 30/07,
8/09, 56/08, 73/08, 40/09, 42/09, 10/10, 57/10, 58/10, 3/11
Występowanie guaniny 731 584A, 648A, 595, 549A, TK, 239/06, 30/07,
8/09, 56/08, 73/08, 40/09, 42/09, 10/10, 48/10, 57/10, 58/10, 3/11, 8/11
Tranzycja adeniny w guaninę 751
Równie charakterystyczna była tranzycja guaniny w adeninę w pozycji 206 genu
meq oraz transwersja tyminy w guaninę w pozycji 220 w szczepach: 239/06, 30/07,
8/09, 56/08, 73/08, 40/09, 42/09, 10/10, 48/10, 57/10, 58/10, 61/10, 3/11 i 8/11 oraz w pięciu szczepach standardowych o patotypie vvMDV oraz vv+MDV. Specyficzną tranzycję tyminy w cytozynę w pozycji 354 wykryto w 14 szczepach własnych MDV oraz w szczepach standardowych o patotypie vvMDV i vv+MDV. Ponadto w se-kwencji genu meq stwierdzono wiele pojedynczych delecji i inercji, które nie były charakterystyczne i nie miały wpływu na sekwencję aminokwasową.
Na podstawie porównań sekwencji nukleotydowych onkogenu meq wszystkich badanych szczepów ze szczepami standardowymi stwierdzono od 81,4 do 100% homologii. Najbardziej zróżnicowaną sekwencję posiadał szczep 40/09, który wy-kazał 81,4% podobieństwa sekwencji ze szczepami standardowymi o umiarkowa-nej patogenności, takimi jak: CVI988, JM/102W i CU-2. Na podstawie sekwencji nukleotydowej wykreślono drzewo filogenetyczne, a badane szczepy MDV za-klasyfikowano do 7 grup (ryc. 1). Do pierwszej grupy zaliczono szczepy: 239/06, 30/07, 8/09, 73/08, 40/09, 42/09, 10/10, 57/10, 58/10 i 3/11, do której należą szczepy
Ryc. 1. Drzewo filogenetyczne skonstruowane na podstawie sekwencji genu meq krajowych szczepów MDV. Czerwonymi ramkami zaznaczono oddzielne grupy
standardowe o patotypach vvMDV i vv+MDV. Drugą grupę obok szczepów standardowych o umiarkowanej patogenności i niepatogennych, tj.: JM102/W, CVI988/Rispens i CU-2 utworzyły dwa badane szczepy: 46/09 oraz F301. Trze-cią grupę tworzyły szczepy: 23/07, 23/09, 45/09 i 51/09 oraz szczepy standardowe pochodzące z USA, Indii i Chin. Do grupy czwartej zaliczono wyłącznie polskie szczepy MDV: 25/07, 29/07, 31/07, 32/07, 3/08 i 2/08. Sekwencja nukleotydo-wa tych szczepów posiadała 99,8–100% homologii. Z kolei grupę piątą tworzyło 9 szczepów: 7/08, 12/08, 81/09, 82/09, 8/10, 31/10, 94/10, 95/10 i 11/10, a homo-logia między ich sekwencjami wynosiła od 99,5–100%. Mniej jednorodną gru-pę szóstą tworzyło 8 szczepów własnych. Szczepy 8/08 i 45/08 utworzyły wspól-ną podgrupę, natomiast drugą podgrupę tworzyły szczepy 72/09, 76/09, 30/10, 102/10 mające 100% identyczności sekwencji nukleotydowej genu meq, natomiast szczepy 63/08 oraz 61/10 utworzyły oddzielne podgrupy. Homologia sekwen-cji szczepów w grupie szóstej wynosiła od 98% – 100%. Ostatnią grupę siódmą utworzyło 5 szczepów o 100% identyczności sekwencji: 62/08, 65/09, 6/10, 87/10 i 119/10, natomiast szczep 5/10 utworzył własną podgrupę, pomimo że różnica w homologii jego sekwencji do innych szczepów była niska i wynosiła 0,5%.
Wnioski
Przeprowadzone badania wykazały, że punktowe zmiany nukleotydowe w obrębie genu meq kodowanego przez region MDV076 w regionie od 107–751 nt mogą być markerem patogenności izolowanych szczepów terenowych MDV. Obecnie prowa-dzone są badania nad zmiennością w obrębie genów MDV077 i MDV077,5 co po-winno dostarczyć dodatkowych informacji na temat ewolucji szczepów terenowych MDV.
Przedstawione badania prowadzone są w ramach projektu badawczego własnego nr. 2011/01/B/NZ7/01561 pt. „Ewolucja genów wirusa choroby Mareka związanych z onkogennością.”
Bartłomiej Tykałowski, Tomasz Stenzel, Marcin Śmiałek, Daria Pestka, Andrzej Koncicki Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie