Analiza częstości występowania zakażeń Mycoplasma synoviae (MS) oparta jest głównie na monitoringu serologicznym wskazującym na wzrastającą rolę tej my-koplazmy w patologii drobiu, głównie u kur ras mięsnych, ale ostatnio u niosek ras lekkich (towarowych). W częstych przypadkach MS jest jedynym czynnikiem etiologicznym zakażenia i skutkuje zwykle chronicznym zapaleniem błony śluzo-wej stawów i pochewek ścięgnowych, szczególnie po dostopowym zakażeniu [1, 6]. Niezwykle ważnym aspektem w świetle literatury i ostatnich badań wykonanych w kraju może być ewolucja w patogenezie MS do układu rozrodczego kury, w tym do środkowego i końcowego odcinka jajowodu. Najczęściej zakażenia MS mają charakter utajonych, a objawy kliniczne zwykle obserwowane są po osiągnięciu przez ptaki dojrzałości płciowej. Swoiste dla MS zmiany patologiczne błony ślu-zowej jajowodu prowadzą prawdopodobnie do jej dysfunkcji, utrudniając proces migracji plemników do miejsca zapłodnienia i formułowanie poszczególnych frak-cji jaja (w tym skorupy). Defekty w budowie skorupy stożka jaja przy komorze powietrznej, określone jako zespół anomalii wierzchołka skorupy jaja (ang. Egg Apical Abnormality-EAA), były w ostatnim czasie opisywane przez niektórych autorów [4, 5, 8]. Dotychczas w wielu krajach mimo obecności zarazka w orga-nizmie ptaków czy też wskazań na kontakt z zakażeniem przez dodatnie wyniki badań serologicznych zakażenia MS uważano za marginalne i nie wprowadzano konieczności monitorowania tych zakażeń u drobiu jako niemających wpływu na ich zdrowotność. W badaniach własnych zarówno od kur niosek z problemami
w reprodukcji i budowie jaj, ale także ze stad klinicznie zdrowych wykazano wzra-stającą tendencję zakażeń MS szczególnie w latach 2011–2012 i utrzymującą się w pierwszych miesiącach 2013 r. [7].
Mykoplazmy należą do klasy Mollicutes (łac. mollis – miękki, cutis – skóra); cha-rakteryzuje je brak typowej dla bakterii ściany komórkowej (posiadają jedynie trój-warstwową błonę protoplazmatyczną), co sprawia, że są oporne na działanie niektó-rych antybiotyków, np. penicyliny, a równocześnie cechuje je wrażliwość na niezbyt liczną grupę antybiotyków stosowanych w terapii drobiu.
Celem podjętych prac było określenie in vitro wrażliwości/oporności wyizolowa-nych i zidentyfikowawyizolowa-nych gatunkowo szczepów MS od kur niosek zarówno z pro-blemami zdrowotnymi ze strony układu rozrodczego, jak i ze stad klinicznie zdro-wych.
Materiał i metody
Do badań wstępnych wybrano szczepy MS: F203/13 ze stada z problemami w bu-dowie skorupy jaj oraz F197/12 ze stada bez objawów klinicznych, a także szczep referencyjny MS. Szczepy terenowe uzyskano, badając wymazy pobrane ze szcze-liny podniebiennej ptaków, jaja lub zamarłe zarodki (po 60 próbek każdego ro-dzaju ze stada) metodami: mikrobiologiczną (uzyskanie wzrostu mykoplazm nie-zbędnych do określenia antybiotykogramu) i real time PCR (identyfikacja gatunku
Mycoplasma synoviae) [2]. Użyto płynnych podłoży PPLO i podłoża agarowego
PPLO według Freya [3]. Skład podłoża modyfikowano według wymagań wzrosto-wych charakterystycznych dla MS (podłoża zawierającego surowicę świńską i glu-kozę). Podłoże płynne zawierało w swoim składzie dodatkowo roztwór wskaźnika barwnego (czerwień fenolowa), którego zmiana wskazywała na wzrost MS w pod-łożu – szczepy MS w czasie wzrostu zmieniały zabarwienie podłoża z czerwonego na żółte (spadek pH), a namnażając się, powodowały równocześnie wzrost gęstości posianych podłoży (wyższą wartość ekstynkcji) OD. Posiane kultury bulionowe in-kubowano w 37°C przez 7 dni, codziennie obserwując zmianę wskaźnika barwne-go. Po uzyskaniu wzrostu mykoplazm na podłożu płynnym określano w hodowli ich koncentrację (CFU), w tym celu wykonano szereg rozcieńczeń hodowli obydwu szczepów od 101 do 108, posiewano na podłoże agarowe metodą kropli spływają-cej, po czym inkubowano w warunkach mikroaerofilnych (dodatek 5% CO2) w za-mkniętym naczyniu w temperaturze 37°C przez kolejne 7 dni, codziennie oglądając pod mikroskopem celem potwierdzenia obecności kolonii mykoplazm. Do ozna-czeń antybiotykogramowych wybrano rozcieńczenie o mianie 104 CFU/ml. Mini-malną koncentrację hamującą wzrost MS wykonano metodą Metabolic Inhibition Test (MIT) według metodyki Bebear i wsp. [3]. Badania te wykonano na płytkach firmy Statens Veterinarmedicinska Anstalt opłaszczonych antybiotykami w
róż-nej koncentracji, w tym: tiamuliną – koncentracja od 0,063–8 µg/ml, valnemuli-ną – odpowiednio 0,125–4 µg/ml, doxycyklivalnemuli-ną – 0,125–16 µg/ml, linkomycyvalnemuli-ną – 0,5–64 µg/ml, tylozyną – 2–128 µg/ml i ampicylliną – 0,5–32 µg/ml. Do baseników opłaszczonych poszczególnymi koncentracjami antybiotyków nanoszono po 0,5 ml bulionu PPLO MS i 0,01 ml hodowli badanego szczepu. Kontrolę ujemną stanowił bulion PPLO, a dodatnią hodowla bulionowa szczepu referencyjnego MS – nanie-sione do baseników nieopłaszczonych żadnym antybiotykiem. Płytki inkubowano w termostacie (temperatura 37°C) przez 72 godz. i obserwowano zmianę zabarwie-nia podłoża. Po tym czasie dokonywano odczytu wizualnego (tab. 1 i 2), a dodat-kowo z każdego basenika pobierano po 0,2 ml hodowli, przenoszono do baseników czystej mikropłytki w analogicznym układzie jak na płytce z antybiotykami i doko-nywano odczytu ekstynkcji przy użyciu czytnika przy długości fali 405 nm (tab. 3 i 4).
Tabela 1. Wyniki antybiotykogramu szczepu 197/12 Mycoplasma synoviae wyrażone w µg/ml*
podłoża płynnego 1 2 3 4 5 6 7 8 A Tiamulin 8* 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0,063 B Valnemulin 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0,063 0,031 C Doxycykline 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 D Lincomycin 64 32 16 8 4 2 1 0,5 E Tylosin 128 64 32 16 8 4 2 K+ F Ampicillin 32 16 8 4 2 1 0,5
K-Tabela 2. Wyniki antybiotykogramu szczepu 203/13 Mycoplasma synoviae wyrażone w µg/ml*
podłoża płynnego 1 2 3 4 5 6 7 8 A Tiamulin 8* 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0,063 B Valnemulin 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0,063 0,031 C Doxycykline 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 D Lincomycin 64 32 16 8 4 2 1 0,5 E Tylosin 128 64 32 16 8 4 2 K+ F Ampicillin 32 16 8 4 2 1 0,5
K-Tabela 3. Wartości OD* hodowli bulionowej i wyniki antybiotykogramu szczepu 197/12
Myco-plasma synoviae wyrażone w µg/ml** podłoża płynnego
1 2 3 4 5 6 7 8 A Tiamulin0,321* 8** 0,303 4 0,3062 0,3221 0,4040,5 0,5180,25 0,6070,125 0,4270,063 B Valnemulin0,304 4 0,293 2 0,2921 0,3470,5 0,3890,25 0,4150,125 0,4630,063 0,4360,031 C Doxycykline0,351 16 0,306 8 0,2964 0,3052 0,3801 0,3740,5 0,4180,25 0,4580,125 D Lincomycin0,306 64 0,299 32 0,33316 0,3528 0,3374 0,3702 0,4131 0,4620,5 E Tylosin0,313 128 0,305 64 0,30632 0,30516 0,3118 0,3024 0,3092 K+ 0,420 0,426 F Ampicillin0,585 32 0,413 16 0,4128 0,4104 0,4152 0,3941 0,3950,5 K-0,330 0,327
Tabela 4. Wartości OD* hodowli bulionowej i wyniki antybiotykogramu szczepu 203/13
Myco-plasma synoviae wyrażone w µg/ml** podłoża płynnego
1 2 3 4 5 6 7 8 A Tiamulin0,393* 8** 0,380 4 0,3742 0,3581 0,3590,5 0,4120,25 0,5210,125 0,4950,063 B Valnemulin 0,331 4 0,332 2 0,3251 0,5060,5 0,5490,25 0,5180,125 0,5610,063 0,5390,031 C Doxycykline 0,385 16 0,362 8 0,4444 0,4772 0,5231 0,6370,5 0,5640,25 0,4880,125 D Lincomycin0,376 64 0,376 32 0,42716 0,4438 0,4664 0,4852 0,5271 0,4670,5 E Tylosin0,371 128 0,359 64 0,37932 0,41316 0,4028 0,3894 0,3792 K+ 0,703 0,423
F Ampicillin0,481 32 0,463 16 0,5118 0,4154 0,4412 0,4371 0,4870,5 K-0,387 0,375
Wyniki i omówienie
Analizując zmianę wskaźnika barwnego hodowli (barwa od czerwonej – brak wzro-stu szczepu, poprzez różową – słaby wzrost, do żółtej – oznaczającej brak hamo-wania i potencjalny wzrost mykoplazm) badanych szczepów w poszczególnych koncentracjach antybiotyków, wykazano, że obydwa badane szczepy były w peł-ni wrażliwe na tylozynę we wszystkich koncentracjach i zupełpeł-nie peł-niewrażliwe na ampicillinę, co wynika z ogólnej cechy mykoplazm w odniesieniu do tej ostatniej. Natomiast na tiamulinę obydwa szczepy wykazały identyczną wrażliwość, tj. peł-na wrażliwość w koncentracji 1 µg/ml i powyżej oraz wynik wątpliwy w koncen-tracji 0,25 µg/ml. Z kolei w odniesieniu do doksycykliny szczep F203/13 różnił się nieznacznie o jedną koncentrację tego leku w stosunku do szczepu F197/12 , któ-ra wynosiła odpowiednio: 2 i 4 µg/ml (pełna wktó-rażliwość) i 2 µg/ml jako wątpliwy dla szczepu F197/12. Podobnie w stosunku do valnemuliny wzrost szczepu F203/13 był w pełni hamowany przy koncentracji 1 µg/ml, podczas gdy zahamowanie wzro-stu szczepu F197/12 następowało już przy 0,25 µg/ml, a wynik wątpliwy uzyskano przy 0,5 µg/ml. Największą różnicę w wrażliwości szczepów stwierdzono w odnie-sieniu do linkomycyny, gdzie hamowanie wzrostu szczepu F203/13 wymagało wy-sokiej koncentracji 32 µg/ml, podczas gdy szczep F197/12 był już wrażliwy na kon-centrację tego leku wynoszącą tylko 4 µg/ml (tab. 1 i 2). Potwierdzeniem wyników uzyskanych w teście MIT (metoda barwna wizualizacji wzrostu mykoplazm w pod-łożu) był pomiar ekstynkcji, który wykonano z użyciem czytnika przy długości fali 405 nm. Wykazano, że zahamowanie metabolizmu (wzrostu szczepu) przekładało się na niższe wartości OD i były one skolerowane z odpowiednią koncentracją leku w danym baseniku płytek antybiotykogramowych. Najwyższe wartości OD (0,420) stwierdzono w kontroli dodatniej (wzrost szczepu referencyjnego), natomiast odpo-wiednio niższe w kontroli ujemnej (0,330) i w basenikach gdzie nastąpiło zahamo-wanie wzrostu badanych szczepów przez odpowiednie koncentracje antybiotyków (tab. 3 i 4).
Podsumowanie
Wstępne wyniki badań wrażliwości na antybiotyki szczepów MS podjętych po raz pierwszy w kraju wskazują, że mykoplazmy tego gatunku izolowane od kur z pro-blemami w reprodukcji i zaburzeń w budowie skorupy jaj mogą być znacznie opor-niejsze na niektóre antybiotyki niż izolaty pochodzące ze stad klinicznie zdrowych
kur. Wyniki powyższych badań wskazują, że tylozyna jako klasyczny lek stosowany w leczeniu zakażeń mykoplazmami ciągle pozostaje lekiem skutecznym, bowiem nie stwierdzono różnicy pomiędzy obydwoma szczepami, które były wrażliwe na najniższe koncentracje leku. Znaczącą różnicę wykazano we wrażliwości szczepów w stosunku do linkomycyny, co sugeruje, że na ten antybiotyk bardziej patogenne szczepy MS mogą wykazywać oporność. Badania powyższe wskazują, że takie leki jak doksycyklina i tiamulina, podobnie jak tylozyna, pozostają w arsenale leków możliwych do użycia w zwalczaniu zakażeń mykoplazmami.
Piśmiennictwo
[1] Bradbury J.M., 2001. Avian mycoplasmas [in:] Poultry Diseases, Fifth Edition, 178–193. [2] Domańska-Blicharz K., Tomczyk G., Minta Z., 2009. Comparison of different
molecu-lar methods for detection of Mycoplasma synoviae. Bull. Vet. Inst. Pulawy, 53, 357–360. [3] Kleven S.H., 1989. Mycoplasmosis [in:] A Laboratory Manual for the Isolation and
Identification of Avian Pathogens, Eds: Swayne D.E., Glisson J.R., Jackwood M.W., Pearson J.E., Reed W.M. American Association of Avian Pathologists, Kennet Square, Pennsylvania, 74–80.
[4] Szeptycki J., 2013. MS-przyczyną zespołu anomalii wierzchołka skorupy. Materiały firmy Biopropeties Pty LTD, Polskie Drobiarstwo, 1, 46–47.
[5] Szeleszczuk P., Kaczmarek Sz., Dolka B., Nerc J., 2013. Klinika pierwszego przypadku zespołu anomalii wierzchołka skorupy jaja (Egg Apical Abnormality –EAA) rozpozna-nego w Polsce. Polskie Drobiarstwo, 3, 44–49.
[6] Tomczyk G., Wieliczko A., 2011. Mykoplazmoza drobiu [w:] Choroby drobiu. Wyd. II, 229–261.
[7] Tomczyk G., 2013. Mykoplazmoza kur w Polsce – aktualne zagrożenia, Vet. Forum, II Kongres Praktyki Weterynaryjnej, Materiały, Łódź, 20–21.04.2013, 129–131.
[8] Tomczyk G., 2013. Patogeneza zakażeń mykoplazmami u drobiu, Magazyn Wet. Suple-ment – Choroby Ptaków, 4–7.
Grzegorz Tomczyk, Anna Sawicka, Katarzyna Domańska-Blicharz, Olimpia Kursa, Zenon Minta Państwowy Instytut Weterynaryjny – Państwowy Instytut Badawczy w Puławach