Zgodnie z najnowszymi raportami Europejskiej Agencji ds. Bezpieczeństwa Żyw-ności (EFSA) drobnoustroje z rodzaju Campylobacter oraz Salmonella należą do najczęściej wymienianych patogenów wywołujących zakażenia oraz zatrucia pokar-mowe u ludzi [2, 3]. Istotną rolę w zachorowaniach ludzi pełnią również werotok-syczne szczepy Escherichia coli.
Za najczęstsze źródło zakażeń ludzi tymi drobnoustrojami uznaje się drób oraz produkty drobiowe nie poddane właściwej obróbce termicznej lub wtórnie zanie-czyszczone. Ponadto, na świecie pojawia się coraz więcej doniesień na temat poten-cjalnego udziału ptaków wolno żyjących w rozprzestrzenianiu zakażeń wywoływa-nych przez te drobnoustroje [1, 5].
Celem prowadzonych badań jest określenie roli ptaków wolno żyjących w łań-cuchu epidemiologicznym zakażeń zwierząt i ludzi drobnoustrojami z rodzaju
Sal-monella spp., Campylobacter spp. oraz Escherichia coli poprzez ocenę częstotliwości
występowania tych drobnoustrojów w krajowej populacji ptaków wolno żyjących oraz przeprowadzenie charakterystyki fenotypowej i genotypowej wyizolowanych drobnoustrojów.
Materiał i metody
Zgromadzony materiał do badań pochodził od różnych gatunków ptaków wolno żyjących, które podzielono na 3 grupy:
• ptaki żerujące w środowisku wodnym (kaczka krzyżówka, kormoran, łabędź); • ptaki drobne:
■wróblowe (sikorka bogatka, sikorka modraszka, wróbel mazurek, dzwoniec), ■jerzykowe (jerzyk),
• ptaki drapieżne (pustułka, sokół wędrowny).
Materiał pobierano przyżyciowo (kał, wymazy kałowe) lub pośmiertnie (narządy wewnętrzne).
Łącznie w kierunku obecności Escherichia coli przebadano 955 ptaków, w kie-runku Salmonella spp. 850 ptaków, natomiast w kiekie-runku Campylobacter spp. 450 osobników.
Zakres badań obejmował:
a. Badania mikrobiologiczne celem wyizolowania drobnoustrojów:
Badanie w kierunku pałeczek Salmonella wykonano zgodnie z normą PN EN ISO 6579:2003 + A1:2007, dotyczącą wykrywania pałeczek Salmonella w materiale bio-logicznym pochodzenia zwierzęcego oraz identyfikacji serologicznej izolatów
Sal-monella.
Do izolacji i identyfikacji drobnoustrojów z rodzaju Campylobacter wykorzystano metody zgodne z normą PN-ISO 10272: „Mikrobiologia żywności i pasz; Horyzon-talna metoda wykrywania termotolerancyjnych bakterii z rodzaju Campylobacter”.
Badanie w kierunku Escherichia coli wykonano poprzez posiew bezpośredni ba-danego materiału na selektywne podłoże McConkey’a (Merck, Niemcy), a uzyskane kolonie wstępnie typizowano oraz z wykorzystaniem odpowiednich testów bioche-micznych: TSI (Merck, Niemcy), Urea/Indol Medium (BioMeriex, Francja).
B. Metody molekularne z wykorzystaniem technik PCR celem:
• określenia przynależności drobnoustrojów do rodzaju Salmonella oraz do kon-kretnych podgatunków (poprzez wykrycie genów: STM, stn, invA, gatD, mdcA i fljB);
• określenia przynależności drobnoustrojów do rodzaju Campylobacter oraz do konkretnych gatunków (poprzez wykrycie genów: mapA, ceuE i trzech genów 16SrRNA dających odpowiednio produkt 408 pz, 506 pz oraz 997 pz);
• określenia przynależności szczepów do rodzaju E. coli i do grup filogenetycz-nych A, B1, B2 i D.
W kolejnej reakcji, z użyciem primerów rozpoznających sekwencję flankujące fragmenty wybranych genów: cva A/B, cvi C, iss, astA, irp2, papC, iucD i tsh, okre-ślono prewalencję wybranych genów wirulencji [5].
Wyniki
Częstotliwość występowania wybranych drobnoustrojów u ptaków wolno żyjących przedstawiono w tabeli 1.
Drobnoustroje z rodzaju Salmonella stwierdzono u 6,82% badanych ptaków wol-no żyjących. Najwięcej izolatów uzyskawol-no od gatunku sikorka bogatka (12 szczepów) oraz kaczka krzyżówka (10 szczepów). Dotychczas zidentyfikowane szczepy należą do dwóch podgatunków: Salmonella enterica subsp. enterica (26 szczepów) i Salmonella
enterica subsp. salamae (14 szczepów). Natomiast 18 szczepów należących do rodzaju Salmonella nie udało się zaklasyfikować do żadnego z podgatunków.
Pałeczki z rodzaju E. coli stwierdzono u prawie 50% ptaków. Wyniki dotyczące przynależności drobnoustrojów z rodzaju Escherichia coli do poszczególnych grup filogenetycznych przedstawiono w tabeli 2.
Tabela 1. Zakażenia bakteryjne ptaków wolno żyjących
Kierunek badania Liczba ptaków/prób badanych Liczba wyników dodatnich
Salmonella spp. 850 58 (6,82%)
Escherichia coli 955 476 (49,84%)
Campylobacter spp. 450 32 (7,11%)
Tabela 2. Przynależność szczepów E.. coli do poszczególnych grup filogenetycznych (%)
Grupa ptaków Grupa A Grupa B1 Grupa B2 Grupa D klasyfikacjiBrak
Blaszkodziobe 20,8 5,0 10,0 20,8 43,4
Drapieżne 0,0 75,0 0,0 5,0 20,0
Wróblowe 0,0 25,0 0,0 0,0 75,0
Zgodnie z badaniami przeprowadzonymi przez Johnsona i wsp. [1] większość szczepów E. coli wykazujących cechy zjadliwości wobec ludzi należy do grupy B2 oraz D. Otrzymane przez nas wyniki wskazują na obecność w populacji ptaków dzi-kich (blaszkodziobe oraz drapieżne) szczepów E. coli należących do tych dwóch grup. Pośród ptaków blaszkodziobych szczepy te stanowiły łącznie 30,8%, natomiast wśród ptaków drapieżnych wykryto 5% szczepów E. coli należących do grupy D.
Nasze badania w zakresie obecności genów warunkujących zjadliwość szczepów
E. coli nie wykazały obecności genu stx determinującego werotoksyczność szczepów.
Powyższą charakterystykę wykonano obecnie dla szczepów E. coli wyizolowanych od blaszkodziobych (kaczka krzyżówka), jak również od ptaków drapieżnych (sokół wędrowny, myszołów, orzeł bielik) i ptaków wróblowych (sikorka bogatka, wróbel mazurek).
Szczepy izolowane od blaszkodziobych (kaczka krzyżówka) posiadają gen irp2 (16,7%), odpowiedzialny za syntezę yersiniobaktyny, gen astA (12,5%) kodujący en-terotoksynę EAST oraz gen iss (4,2%) warunkujący odporność na bójcze działanie surowicy. Z kolei wśród szczepów pochodzących od wróblowych wykazano obec-ność genów astA oraz irp2. Natomiast wśród szczepów E. coli izolowanych od
pta-ków drapieżnych dominuje gen iss. Pośród tych ostatnich szczepów wykryto także gen vat odpowiedzialny za wakuocytarny autotransfer toksyn. Powyższe geny wa-runkują cechy zjadliwości E. coli niebezpieczne dla ptaków.
Obecność Campylobacter spp. w populacji ptaków dzikich stwierdzono na pozio-mie 7,11% (32 szczepy na 450 badanych prób). Najczęściej drobnoustroje te izolo-wano od ptaków związanych ze środowiskiem wodnym. Najwięcej izolatów pozy-skano od kaczki krzyżówki (26,14%), z czego wszystkie szczepy należały do gatunku
C. jejuni. W przypadku kormorana czarnego wyizolowano wyłącznie C. coli (7,93%).
Natomiast od ptaków morskich (uhla zwyczajna) uzyskano 4 szczepy z
Campylo-bacter, z których 3 należą do C. jejuni, a jeden do C. lari.
Podsumowanie
Ptaki wolno żyjące, uwzględniając ich gatunek, miejsce bytowania oraz sposób odży-wiania się, wykazują zróżnicowany stopień zakażenia drobnoustrojami z rodzaju:
Sal-monella, Campylobacter oraz Escherichia coli. Wydaje się, że mogą odgrywać istotną
rolę w rozprzestrzenianiu zoonotycznych drobnoustrojów w środowisku oraz stano-wić istotne ogniwo w łańcuchu epidemiologicznym zakażeń ludzi i zwierząt.
Praca jest realizowana w ramach projektu NCBiR NR 12 0126 10.
Piśmiennictwo
[1] Dobbin G., Hariharan H., Daoust P.-Y., Hariharan S., Heaney S., Coles M., Price L., Muckle A., 2005. Bacterial flora of free-living Double-crested cormorant (Phalacroco-rax auritus) chicks on Prince Edward Island, Canada, with reference to enteric bacteria and antibiotic resistance Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis., 28, 71–82.
[2] EFSA Annual Report, 2012. The European Union Summary Report on Trends and So-urces of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in 2010; EFSA Jour-nal, 10(3), 2597, 442.
[3] EFSA Annual Report, 2013. The European Union Summary Report on Trends and So-urces of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in 2011; EFSA Jour-nal, 11(4), 3129, 250.
[4] French N.P., Midwinter A., Holland B., Collins-Emerson J., Pattison R., Colles F., Car-ter P., 2009. Molecular epidemiology of CampylobacCar-ter jejuni isolates from wild-bird fecal material in children’s playgrounds. Appl Environ Microbiol., 75(3), 779–783. [5] Ewers C., Janssen T., Kiessling S., Philipp H.C., Wieler L.H., 2005. Rapid detection of
virulence-associated genes in avian pathogenic Escherichia coli by multiplex polyme-rase chain reaction. Avian Dis., 49(2), 269–273.
[6] Johnson J.R., Delavari P., Kuskowski M., Stell A.L., 2001. Phylogenetic distribution of extraintestinal virulence-associated traits in Escherichia coli., J. Infect Dis., 183, 78–88.
Karolina Tarasiuk, Grzegorz Woźniakowski Państwowy Instytut Weterynaryjny – Państwowy Instytut Badawczy w Puławach