Escherichia coli jest jedną z najistotniejszych przyczyn strat ekonomicznych w
pro-dukcji drobiarskiej. Liczne, pierwotne i wtórne infekcje układu oddechowego i po-karmowego, uogólnione posocznice oraz zakażenia miejscowe, jak na przykład
cellulitis lub zapalenie pępka i woreczka żółtkowego, powodują wysoką
zachoro-walność i śmiertelność u drobiu. Zakażenia te są tradycyjnie leczone antybiotykami lub fluorochinolonami. Chemioterapeutyki pierwotnie bardzo skuteczne w kontro-lowaniu zakażenia E. coli po pewnym okresie ich stosowania, z powodu nabywanej przez bakterie oporności na te związki, stają się nieskuteczne. Coraz częściej noto-wana jest wielooporność (multiple drug resistance (MDR), to znaczy dany szczep bakterii oporny jest na kilka grup antybiotyków jednocześnie [17, 18]. Lekoopor-ność jest naturalnym procesem obronnym drobnoustroju, niezbędnym do prze-trwania w obecności bakteriostatycznego lub bakteriobójczego leku. W obecno-ści antybiotyku między komórkami bakteryjnymi może dochodzić do przekazania materiału genetycznego determinującego lekooporność na drodze kilku złożonych procesów: transdukcji – przeniesienia materiału genetycznego przez bakteriofaga, koniugacji – przeniesienia materiału genetycznego na plazmidach lub transpozo-nach między komórkami tego samego gatunku lub różnych gatunków i w końcu transformacji – umieszczeniu w genomie wolnego DNA zawierającego geny opor-ności. Innymi istotnymi mechanizmami uzyskiwania oporności przez bakterie mogą być „pompy białkowe” (tzw. efflux pomp), które usuwają chemioterapeutyk z komórki, oraz umiejętność syntezy enzymów rozkładających lub
dezaktywują-cych leki. Czasem usunięcie presji selekcyjnej, jaką jest obecność danego chemiote-rapeutyku, powoduje powrót pełnej wrażliwości na ten lek, niemniej częściej dany typ oporności może utrzymywać się długo po zaprzestaniu stosowania chemiote-rapeutyku [3]. Dominującymi grupami leków przeciwdrobnoustrojowych stosowa-nych w Polsce u drobiu są fluorochinolony, antybiotyki β-laktamowe i tetracykliny – ogółem ponad 90% [6].
Wybór chemioterapeutyku stosowanego do leczenia kolibakteriozy jest często ograniczony z jednej strony kosztem leku a z drugiej nasileniem choroby w stadzie. Wybór leków stosowanych w leczeniu kolibakteriozy jest ograniczony i obejmuje najczęściej fluorochinolony, rzadziej sulfonamidy, polimyksyny i tetracykliny oraz ostatnio fenikole. Uważa się, że ograniczona możliwość wyboru chemioterapeuty-ków w terapii zakażeń drobiu powodowanych przez E. coli stosowana przez lata spo-wodowała presję selekcyjną i fakt dominacji szczepów E. coli opornych na fluoro-chinolony, tetracykliny, sulfonamidy i antybiotyki β-laktamowe.
Fluorochinolony – enrofloksacyna i flumechina ze względu na ich dostępność i relatywnie niską cenę są powszechnie stosowane w zwalczaniu kolibakteriozy u drobiu. Mechanizm działania fluorochinolonów polega na szybkim i nieodwra-calnym hamowaniu replikacji DNA bakteryjnego. Przyłączają się one do podjed-nostki GyrA gyrazy oraz ich odpowiednika ParC w topoizomerazie IV, po czym na-stępuje przecięcie obu nici DNA przez gyrazę lub topoizomerazę IV. Doprowadza to do śmierci komórki bakteryjnej w wyniku obecności przerw w DNA i uniemoż-liwienia przemieszczania się polimerazy wzdłuż nici kwasu nukleinowego. Opor-ność bakterii na fluorochinolony jest wynikiem punktowych mutacji chromosomo-wych, które najczęściej występują w obrębie genów kodujących miejsca docelowe tych chemioterapeutyków, czyli gyrazę oraz topoizomerazę IV. W obrębie genów kodujących te podjednostki może być wiele różnych mutacji punktowych, przy czym najczęściej obserwuje się substytucje na obszarze genu gyrA kodującym ami-nokwasy 67–106, który nazywany jest obszarem warunkującym oporność na chi-noliny (QRDR – ang. Quinolone Resistance Determining Region). Substytucje te w pierwszej kolejności dotyczą seryny83, a następnie asparaginy87, natomiast w ge-nie parC, seryny80 i glutaminy84. Wynikiem mutacji jest modyfikacja miejsc do-celowych fluorochinolonów, co utrudnia aktywność tych chemioterapetyków lub niemal całkowicie ją uniemożliwia [4, 12]. Powszechny u Enterobacteriaceae jest plazmid PMQR (plasmid-mediated quinolone resistance, który pierwotnie wykryto u Klebsiella pneumonie. Zawarty w nim między innymi gen qnrA koduje 218 amino-kwasową proteinę chroniącą DNA przed przyłączeniem fluorochinolonu do gyrazy i topoizomerazy IV [2].
Tetracykliny to antybiotyki o szerokim spektrum działania oraz niskiej toksycz-ności. Ze względu na te cechy oraz niskie koszty terapii są one często stosowane za-równo w terapii ludzi, jak i zwierząt. Z tej grupy antybiotyków „popularna” wśród
lekarzy jest doksycyklina i oksytetracyklina. Mechanizm ich działania polega na hamowaniu syntezy białka poprzez wiązanie się do podjednostki 30S rybosomu. Oporność na tetracykliny najczęściej wynika ze zdolności szczepów do syntezy pomp efflux typu MFS, która aktywnie usuwa antybiotyki z komórki. Pompa ta ko-dowana jest przez geny tet, które mogą znajdować się zarówno na plazmidzie, jak i w chromosomie. Do rzadziej występujących mechanizmów oporności na te an-tybiotyki należy ochrona rybosomów przed związaniem tetracyklin, enzymatycz-na ienzymatycz-naktywacja leku, mutacja 16S rRNA oraz zmniejszenie przepuszczalności ścian bakteryjnych. Geny oporności tet kodują nie tylko pompę efflux, ale także białka chroniące rybosom [12, 14].
Antybiotyki β-laktamowe to szeroko stosowana grupa antybiotyków bakteriobój-czych. Do tej grupy antybiotyków zaliczamy: penicyliny, cefalosporyny, karbape-nemy, monobaktamy. Mechanizm działania penicylin jako antybiotyków polega na blokowaniu aktywności enzymów bakteryjnych – transpeptydaz (PBP) biorących udział w ostatnim etapie syntezy peptydoglikanu ściany komórki bakteryjnej. An-tybiotyki te mają wiązanie beta-laktamowe, które ulega rozerwaniu pod wpływem określonych enzymów, tzw. β-laktamaz produkowanych przez liczna Gram- ujemne i Gram-dodatnie bakterie. Niektóre E. coli wytwarzają ten enzym konstytutywnie, to znaczy niezależnie od tego, czy w środowisku znajduje się antybiotyk β-laktamowy, czy nie. Jednym z najczęściej występujących plazmidowych enzymów o aktywności β-laktamazy u Enterobacteriaceae jest TEM-1 kodowany przez gen blaTEM-1 [11]. Z antybiotyków β-laktamowych (z grupy aminopenicylin) u drobiu często stosowa-na jest amoksycylistosowa-na, zwłaszcza do zwalczania tzw. dysbakteriozy przewodu pokar-mowego.
Celem pracy było określenie minimalnych stężeń hamujących (MIC – Minimal Inhibitory Concetration) dla wybranych chemioterapeutyków oraz prewalencji ge-nów warunkujących lekooporność u szczepów E. coli wyizolowanych z przypadków klinicznej kolibakteriozy od kurcząt brojlerów, indyków rzeźnych, gęsi, kaczek i kur niosek oraz porównania ich z lekoopornością szczepów izolowanych od zdrowego drobiu i ptaków wolno żyjących.
Materiał i metody
Szczepy E. coli izolowano w latach 2011/2012 (n=200) oraz w 2001 (n=65). W gru-pie izolatów z lat 2011/2012 od kurcząt brojlerów pochodziło 50 szczepów, od indy-ków rzeźnych 61, od kur niosek 38, od drobiu wodnego 28, oraz 23 szczepy od ptaindy-ków dzikich. Z kolei w grupie izolatów z 2001 r. 33 pochodziły od kurcząt rzeźnych, 15 od indyków i 17 od drobiu wodnego. Szczepy izolowano z narządów wewnętrznych (wą-troba, płuca, serce), które posiewano na podłoże McConkey’a, (Merck, Niemcy) i in-kubowano 18 godzin w temp. 37oC. Pojedyncze charakterystyczne, laktozododatnie
kolonie reizolowano na podłoże agar odżywczy (Merck, Niemcy), a następnie zabez-pieczano do dalszych badań w Microbanku (Pro-lab, Kanada) w temp. -70oC. Dla wy-izolowanych szczepów określono MIC dla amoksycykliny (zakres 0,016–256 µg/ml), tetracykliny (zakres 0,016–256 µg/ml) oraz enrofloksacyny (zakres 0,002–32 µg/ml) metodą Etest (BioMerieux, Francja) na podłożu Mueller-Hintona (bioMeriuex, Fran-cja) zgodnie z instrukcją producenta. Jako szczep referencyjny zastosowano E. coli ATCC 25922. Dla poszczególnych grup szczepów izolowanych od różnych gatunków ptaków wyznaczono MIC50 (minimalne stężenie hamujące 50% badanej populacji bakterii) oraz MIC90 (minimalne stężenie hamujące 90% badanej populacji).
U wyizolowanych szczepów E. coli przy użyciu reakcji PCR określono również prewalenję genów warunkujących oporności na wybrane chemioterapeutyki: geny pompy efflux tetA, tetB, tetC, tetD [13], odpowiedzialne za oporność względem te-tracyklin, geny blaTEM, blaCMY, blaCTX i blaSHV [13], kodujące cztery różne β-laktamazy, warunkujące oporność na antybiotyki β-laktamowe oraz kodowanego plazmidowo, warunkującego oporność na fluorochinolony genu qnr [9].