Cirkowirusy stanowią jeden z największych problemów zdrowotnych w hodowli gołębi. Szczególnie wrażliwe na zakażenie są młode gołębie od 3. do 20. tygodnia życia, u których występuje syndrom chorobowy młodych gołębi (YPDS) wywołany przez wieloczynnikowe zakażenia wirusowe, cechujący się wysoką śmiertelnością. Charakterystycznymi objawami klinicznymi towarzyszącymi zakażeniom cirko-wirusami są: ospałość, utrata wagi, trudności w oddychaniu, biegunka i nieprawi-dłowe upierzenie. Cirkowirusy gołębi odgrywają przede wszystkim rolę immuno-supresyjną i wikłają wtórne zakażenia wirusowe i bakteryjne. Po raz pierwszy ich występowanie opisano w USA, a następnie w Australii, Południowej Afryce, Ka-nadzie i Europie. Cirkowirus gołębi (PiCoV) należy do rodzaju Circovirus rodziny
Circoviridae. Bezotoczkowe wiriony PiCoV posiadają jednoniciowy DNA o
wielko-ści od 1,7 do 2,5 kbp w zależnowielko-ści od zróżnicowania genetycznego izolatów tereno-wych. W genomie PiCoV występuje pięć otwartych ramek odczytu (ORFs). Pierw-sza ramka koduje białko związane z replikacją wirusa (Rep). Z kolei białko kapsydu
(Cap) kodowane jest przez region C1 i ma ono wielkość 274 aminokwasów i masę 31,9 kDa. W przebiegu zakażenia PiCoV zmiany anatomopatologiczne obserwowa-ne są głównie w narządach związanych z układem limfatycznym, w którym docho-dzi do znacznego obniżenia ogólnej liczby limfocytów. Diagnostyka zakażeń PiCoV na podstawie objawów klinicznych czy też zmian anatomopatologicznych jest kło-potliwa, gdyż u niektórych ptaków wirus nie wywołuje postaci klinicznej choroby. Metody izolacji wirusa w hodowlach komórkowych nie są skuteczne w przypadku PiCoV. Jedną z najbardziej przydatnych metod diagnostycznych jest łańcuchowa re-akcja polimerazy (PCR), która pozwala na badanie występowania PiCoV w narzą-dach wewnętrznych gołębi oraz krwi obwodowej. Pomimo dużej przydatności tej metody testy serologiczne takie jak ELISA stanowią bardzo dobrą alternatywę dla PCR i służą często jako potwierdzenie wyników uzyskanych metodami biologii mo-lekularnej. Z tego względu wartościowe wydaje się, że opracowanie testu ELISA na bazie rekombinowanego białka kapsydu PiCoV pozwoliłoby na skuteczną diagno-stykę zakażeń cirkowirusami u gołębi. Celem podjętych badań było otrzymanie re-kombinowanego białka C1 PiCoV do testów serologicznych.
Materiał i metody
Do badań użyto izolatu GW2012 pozyskanego od gołębi hodowlanych w wieku 16 tygodni. U gołębi obserwowano nieprawidłowości w upierzeniu oraz znaczne wy-chudzenie. Z wątrób gołębi wykazujących objawy kliniczne izolowano całkowity DNA przy użyciu zestawu komercyjnego w celu stwierdzenia obecności PiCoV me-todą PCR. Dlatego też zaprojektowano startery oligonukleotydowe komplementar-ne do regionu kodującego białko C1 PiCoV, posiadające miejsca restrykcyjkomplementar-ne dla enzymów HindIII oraz SalI. Sekwencje starterów były następujące:
• PiCoV F: 5’-CCAAAGCTTATGAGGAGGCGGAGATTCAGACG-3’, • PiCoV R: 5’-GTGGTCGACTTATTCAGAATCCACAGCTGAGT-3’.
Skład mieszaniny reakcyjnej do amplifikacji genu C1 był następujący: 2,5 µl 10 x stężonego buforu do PCR (50 mM KCl, pH=9, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2); po 0,5 μl (0,2 µm) każdego ze starterów, 1 μl dNTP (0,2 μm); 4 μl betainy (1 M); 0,5 μl poli-merazy DNA Taq (5 U/μl) oraz 14,5 μl wody dejonizowanej o stopniu czystości 1. Do tak sporządzonej mieszaniny dodawano 2 μl DNA izolatu GW2012. Otrzymany w 1% żelu agarozowym produkt PCR oczyszczano i sekwencjonowano, a następnie poddano ligacji po trawieniu enzymami HindIII oraz SalI z plazmidem ekspresyj-nym pET (Novagen). W ten sposób uzyskano plazmid pC1PiCoV, którym transfor-mowano komórki bakteryjne E.coli linii BL21 (DE3) Rosetta. Wyrosłe po 24 godz. inkubacji na podłożu Luria-Berani (LB) z dodatkiem ampicyliny (50 µg/ml), IPTG i X-Gal białe kolonie bakterii zawierające plazmid pC1PiCoV sprawdzano metodą PCR. O prawidłowym wprowadzeniu genu C1 do wektora ekspresyjnego świadczyła
obecność produktu o wielkości 724 bp. Następnie pojedynczą kolonią bakteryjną in-okulowano 2 ml podłoża płynnego z dodatkiem ampicyliny i inkubowano w tem-peraturze 37°C przez 18 godzin z jednoczesnym wytrząsaniem 225 obr./min. W ko-lejnym etapie 250 ml podłoża LB z ampicyliną inokulowano 1 ml hodowli bakterii z poprzedniego etapu. W celu indukcji ekspresji białka C1 w momencie logarytmicz-nego wzrostu komórek bakteryjnych przy OD600=0,5–0,6 dodawano 1 mM IPTG. Jako kontrolę użyto komórek bakterii nie indukowanych IPTG. Po pięciu godzinach inkubacji w 37°C z wytrząsaniem hodowlę bakterii odwirowywano przy 8000 x g przez 10 min, a z uzyskanego osadu komórek bakteryjnych oczyszczano rekombi-nowane białko przy użyciu kolumienek ze złożem niklowym (Clontech). Otrzymane białko sprawdzano w 12% żelu SDS-PAGE w warunkach denaturujących i przecho-wywano do dalszych etapów badań w temperaturze -70°C.
Wyniki
Badania potwierdziły przynależność izolatu GW2012 do cirkowirusów gołębi. W opracowanej metodzie PCR uzyskano wyraźny produkt wielkości 724 bp (ryc. 1). Przeprowadzona analiza sekwencji produktu PCR kodującego białko C1 kapsydu PiCoV potwierdziła jego 100% stopień podobieństwa do sekwencji izolatów znaj-dujących się w bazie danych GenBanku. Otrzymanie oczyszczonego produktu PCR pozwoliło na konstrukcję wektora ekspresyjnego pC1PiCoV, użytego następnie do transformacji kompetentnych komórek E. coli BL21. Wyrosłe białe kolonie bakterii wykazały obecność insertu genu C1 PiCoV. W kolejnym etapie badań użyto rekom-binowanych kolonii bakterii do inokulacji podłoża płynnego i indukcji ekspresji re-kombinowanego białka. Wykazano, że indukcja 1 mM IPTG powodowała znaczny wzrost ekspresji białka C1, co obserwowano po rozdziale elektroforetycznym w żelu poliakrylamidowym jako znaczne zmętnienie hodowli płynnej, jak również pogru-bienie prążka w żelu SDS-PAGE o wielkości 32,9 kDA (ryc. 2). Otrzymane rekombi-nowane białko zostało oczyszczone i będzie użyte w kolejnym etapie badań do opra-cowania testu ELISA do wykrywania specyficznych przeciwciał PiCoV.
Ryc. 1. PCR. Amplifikacja regionu C1 cirkowirusa gołębi (PiCoV). Zaznaczono produkt PCR wielkości 724 bp
Ryc. 2. Analiza rekombinowanego białka C1 PiCoV w żelu poliakrylamidowym SDS-PAGE. 1 – hodowla bakterii nie indukowana IPTG, 2 – hodowla bakterii indukowana 1 mM IPTG
Piśmiennictwo
[1] Daum I., Finsterbusch T., Härtle S., Göbel T.W., Mankertz A., Korbel R., Grund C., 2009. Cloning and expression of a truncated pigeon circovirus capsid protein suitable for antibody detection in infected pigeons. Avian Pathol., 38, 135–141.
[2] Krapez U., Slavec B., Steyer A.F., Pintaric S., Dobeic M., Rojs O.Z., Dovc A., 2012. Pre-valence of pigeon circovirus infections in feral pigeons in Ljubljana, Slovenia. Avian Dis., 56, 432–435.
[3] Schmidt V., Schlömer J., Lüken C., Johne R., Biere B., Müller H., Krautwald-Jung-hanns M.E., 2008. Experimental infection of domestic pigeons with pigeon circovirus. Avian Dis., 52, 380–386.
[4] Stenzel T.A., Pestka D., Tykałowski B., Śmiałek M., Koncicki A., 2012. Epidemiological investigation of selected pigeon viral infections in Poland. Vet. Rec., 171, 562.
[5] Todd D., Fringuelli E., Scott A.N., Borghmans B.J., Duchatel J.P., Shivaprasad H.L., Raidal S.R., Abadie J.X., Franciosini M.P., Smyth J.A., 2008. Sequence comparison of pigeon circoviruses. Res. Vet. Sci., 84, 311–319.
Maria Biernacka, Wojciech Młodawski, Agnieszka Olszyńska, Joanna Szybalska, Joanna Świder, Katarzyna Witt, Sylwia Doner, Piotr Szeleszczuk
Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie